專利名稱：一種快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的pcr試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，特別涉及檢測(cè)鹿產(chǎn)品中是否含有水鹿產(chǎn)品的成分，用于快速準(zhǔn)確識(shí)別鹿產(chǎn)品，屬于生物檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鹿產(chǎn)品是鹿的一些組織或者器官，主要包括有鹿茸，鹿心，鹿腎，鹿胎，鹿筋，鹿鞭，鹿尾，鹿肉和鹿血等。由于鹿產(chǎn)品大多為名貴中藥材，價(jià)格昂貴，所以市場(chǎng)上屢見用偽劣產(chǎn)品來冒充名貴的鹿產(chǎn)品。目前，鹿產(chǎn)品的鑒定大多采用傳統(tǒng)方法，主要包括性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定。雖然傳統(tǒng)鑒定方法簡(jiǎn)單、快捷、成本低，但影響傳統(tǒng)鑒定方法的因素很多(如人為因素、 環(huán)境因素、營(yíng)養(yǎng)因素)，因而不能準(zhǔn)確地判斷鹿產(chǎn)品的偽劣情況。比如在鹿產(chǎn)品的加工過程中，其性狀、顯微結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等常常發(fā)生改變，利用傳統(tǒng)鑒定方法來鑒定鹿產(chǎn)品可能會(huì)出現(xiàn)誤判。然而，分子鑒定方法(基于DNA的方法)不受這些因素的影響，且具有準(zhǔn)確性大、 靈敏度高、穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，解決了鹿產(chǎn)品中是否含有水鹿成分的問題。本發(fā)明還提供了上述快速檢測(cè)鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒的制備方法，通過一個(gè)PCR方法反應(yīng)體系采用一步反應(yīng)來鑒別鹿產(chǎn)品中的水鹿源性成分。本發(fā)明提供的快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，其特征在于
包括DNA提取液、PCR反應(yīng)液和陰性標(biāo)準(zhǔn)品
所述的DNA提取液
(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；
(2)細(xì)胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；
所述的PCR反應(yīng)液
ddH20、10 X PCR Buffer、dNTPs、上游引物、下游引物、酶；
具體引物序列為
上游引物5 ’ -ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3，
下游引物5’ -CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
陰性標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。本發(fā)明所述快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒的制備方法，包括以下步驟
I)DNA提取液
(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8) : 12-13份Tris堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份 Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgC12，4-5份NaCl,余份為水；
(2)細(xì)胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；
2)PCR反應(yīng)液。(I)引物設(shè)計(jì)在水鹿的線粒體DNA D-Ioop區(qū)域,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,包括一個(gè)上游引物和一個(gè)下游引物。序列如下
上游引物5 ’ -ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3，
下游引物5’ -CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
(2)PCR反應(yīng)液
ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM) O. 5ul，下游引物(20 uM) O. 5ul，酶(5U/ul) 0.2ul。(3)陰性標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。本發(fā)明的水鹿源性鹿產(chǎn)品PCR檢測(cè)的使用方法
(1)從待檢樣品中提取基因組DNA；
(2)制備PCR反應(yīng)體系
取步驟(I)中的DNA Iul和陰性對(duì)照加入到PCR反應(yīng)液中，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；
(3)設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序均如下
940C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)。(4)反應(yīng)結(jié)束后取5 μ I PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果判定若擴(kuò)增出長(zhǎng)度為296bp的片段，說明被檢樣品中含有水鹿源性成分。本發(fā)明的積極效果在于采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增水鹿的線粒體DNA的特異分子片段， 制成試劑盒，用于檢測(cè)被檢樣品中是否含有水鹿成分，并能檢測(cè)混合樣品；具有操作簡(jiǎn)單、 靈敏度高，速度快特點(diǎn)。


圖I為引物的種間特異性；
圖2為引物的種內(nèi)通用性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明
實(shí)施例I:試劑盒的組成與配制
I) DNA提取液的配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 6)800ml蒸餾水溶解I. 21gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 38g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0· 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入Ig SDS(十二烷基硫酸鈉)，Iml Triton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。提取方法200ul抗凝血和400ul低鹽緩沖液加入到I. 5ml離心管中，充分混勻后 1000RPM離心lOmin，棄上清；加入500ul低鹽緩沖液，混勻后于室溫下1000RPM離心5min， 重復(fù)一次；小心吸出上清，加入300ul細(xì)胞裂解液，混勻后于65°C水浴IOminJPA 75ul飽和NaCl，充分混勻后12000RPM離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5ml離心管中，加入2倍體積無水乙醇，充分混勻后于10000RPM離心2min，棄上清，加入500ul冰浴70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次后于10000RPM離心lmin，棄上清；65°C烘箱中干燥5min，加入IOOul ddH20后于65°C 水浴溶解15min。2) PCR 反應(yīng)液
(O引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中已公布的鹿科動(dòng)物線粒體全基因組序列，采用 Bioedit 7. O. 9. O軟件進(jìn)行序列比對(duì)后，根據(jù)種內(nèi)具有保守性、種間具有特異性的原則選擇線粒體的D-Ioop區(qū)域，利用Oligo 6. O軟件設(shè)計(jì)水鹿的特異性引物。其中包括一個(gè)的下游引物，一個(gè)上游引物。引物對(duì)要具有種內(nèi)通用性和種間特異性。序列如下
上游引物5’ -ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3’
下游引物5’ -CATGGTMTTAAGCTCGTGATCTA-3’
(2)PCR反應(yīng)液:
ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM)
O.5ul，下游引物(20 uM) O. 5ul，酶(5U/ul) 0.2ul。(3)陰性標(biāo)準(zhǔn)品為無囷雙蒸水。實(shí)施例2 =PCR最佳反應(yīng)條件的建立。對(duì)于一個(gè)PCR反應(yīng)來說，最重要的反應(yīng)條件就是退火溫度，因此從這個(gè)方面來設(shè)定PCR反應(yīng)的最佳條件。最佳反應(yīng)條件的設(shè)定首先應(yīng)遵循種間特異性和種內(nèi)通用性原則， 然后在此基礎(chǔ)上選擇擴(kuò)增效果最理想時(shí)的溫度設(shè)定為引物的最佳反應(yīng)溫度。I) DNA 的提取
按照實(shí)施例I的方法從血液中提取了水鹿的基因組DNA。2 ) PCR反應(yīng)體系的制備
將步驟I)中提取的DNA Iul加入到實(shí)施例I中的PCR反應(yīng)液中，構(gòu)成15ul的反應(yīng)體
系O3)PCR反應(yīng)最佳退火溫度的設(shè)定。退火溫度的梯度范圍為54-68°C，每隔2°C設(shè)一個(gè)梯度，反應(yīng)在Eppendorf AG上進(jìn)行，
程序如下
940C 5min ；94°C 30s, 54-68°C 30s,72°C 30s,30 cycles ；72°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μ I PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)中記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)凝膠中條帶的亮度確定每對(duì)引物的最佳退火溫度。4)最佳PCR反應(yīng)條件的確立
最終確立 PCR 反應(yīng)最佳條件為94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。實(shí)施例3 :試劑盒的特異性試驗(yàn)
I)證明引物具有種間特異性。(I)為證明本發(fā)明的引物具有種間特異性，按照實(shí)施例I的方法提取了梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿、馴鹿、水鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、點(diǎn)鹿、豬、牛、羊、雞的基因組DNA，提取的DNA用于制備PCR反應(yīng)體系，無菌水作為陰性對(duì)照。
(2)PCR反應(yīng)體系的制備取步驟(I)提取的DNA Iul加入到實(shí)施例I中的PCR反應(yīng)液中，構(gòu)成15ul體系。(3)按照反應(yīng)程序94°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min, 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(4)結(jié)果如圖I 1 :水鹿；2 :梅花鹿；3 :馬鹿；4 :塔里木馬鹿；5 :赤鹿；6 :馴鹿；7 坡鹿；8 白唇鹿；9 :糜鹿；10 :點(diǎn)鹿；11 :豬；12 :牛；13 :羊；14 :雞；15 :陰性對(duì)照；M Marker I (600，500，400，300，200，100 bp)；
在以上所有物種的基因組DNA的PCR反應(yīng)中，只有水鹿基因組DNA擴(kuò)增出296bp的特異性片段，而梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿、馴鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、點(diǎn)鹿、豬、牛、羊、雞的基因組DNA均為陰性，說明本發(fā)明的引物具有種間特異性。2)證明引物的種內(nèi)通用性。弓丨物除了在種間具有特異性之外，還必須同時(shí)具有種內(nèi)通用性，因此對(duì)引物的種內(nèi)通用性也進(jìn)行了評(píng)估。(I)按照實(shí)施例I的方法提取了 6個(gè)水鹿的基因組DNA，提取的DNA用于制備PCR 反應(yīng)體系，無菌水作為陰性對(duì)照。(2)PCR反應(yīng)體系的制備取步驟(I)提取的DNA Iul加入到實(shí)施例I中的PCR反應(yīng)液中，構(gòu)成15ul體系。(3)按照反應(yīng)程序94°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s, 72°C 5min, 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(4)結(jié)果如圖 2 :水鹿(1-6)，7 :陰性對(duì)照；M:Marker I (600，500，400，300，200， 100 bp) ;6個(gè)水鹿基因組DNA均擴(kuò)增出了 296bp的目的片段。說明本發(fā)明的引物在種內(nèi)具
有通用性。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，其特征在于包括以下引物上游引物5 ’ -ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3，下游引物5’ -CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’。
2.權(quán)利要求I所述的快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，其特征在于包括DNA提取液、PCR反應(yīng)液和陰性標(biāo)準(zhǔn)品；所述的DNA提取液(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；(2)細(xì)胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；所述的PCR反應(yīng)液ddH20、10 X PCR Buffer、dNTPs、上游引物、下游引物、酶；具體引物序列為上游引物5 ’ -ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3，下游引物5’ -CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’陰性標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。
3.權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)DNA提取液(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；(2)細(xì)胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；2)PCR反應(yīng)液；(I)引物設(shè)計(jì)在水鹿的線粒體DNA D-Ioop區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，包括一個(gè)上游引物和一個(gè)下游引物；序列如下上游引物5 ’ -ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3，下游引物5’ -CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’PCR反應(yīng)液ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM) O. 5ul，下游引物(20 uM) O. 5ul，酶(5U/ul) O. 2ul ；(3)陰性標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增水鹿的線粒體DNA的特異分子片段，制成試劑盒，用于檢測(cè)被檢樣品中是否含有水鹿成分，并能檢測(cè)混合樣品；具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，速度快特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605096SQ201210108559
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月15日
發(fā)明者吳瓊, 楊福合, 査代明, 蘇偉林, 榮敏, 邢秀梅 申請(qǐng)人:邢秀梅