專利名稱：海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫 半乳糖苷酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫￠-半乳糖苷酶主要應(yīng)用于食品
工業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域。該低溫酶制劑可以降低生產(chǎn)成本，減少工藝流程，提高生產(chǎn)效率，增加經(jīng)濟(jì)效益，改善產(chǎn)品質(zhì)量。
背景技術(shù)：
-半乳糖苷酶(3 -Galactosidase, EC3. 2. I. 23)又稱乳糖酶、3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，是一種無毒副作用的生物酶制劑(張莉，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009)。它能夠 在特定的條件下水解P-D-半乳糖苷鍵(￠-1,4-糖苷鍵)，將乳糖水解成a D-葡萄糖和
3D-半乳糖；同時(shí)乳糖酶具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷的作用，能把半乳糖連接到乳糖上，生成低聚半乳糖(盧麗麗等，微生物學(xué)報(bào)，2008)。早期￠-半乳糖苷酶生產(chǎn)方法主要是從哺乳動(dòng)物組織和一些植物中提取，存在生產(chǎn)成本高、純度低、生產(chǎn)工藝復(fù)雜等問題(張莉，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009);利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)3 -半乳糖苷酶工藝比較簡單、生產(chǎn)成本較低、純度高(周春雷等，極地研究，2010)。目前國內(nèi)對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)￠-半乳糖苷酶的研究主要集中于中溫酶，對(duì)低溫酶的研究較少，主要是低溫￠-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌篩選、理化性質(zhì)及酶分子特性的研究(劉文玉等，新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007 ;李玉強(qiáng)等，食品添加劑，2001)。對(duì)海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫3-半乳糖苷酶的研究尚在起步階段，產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用還未見報(bào)道。與中、高溫￠-半乳糖苷酶相比，海洋低溫￠-半乳糖苷酶具有松散、柔順的分子結(jié)構(gòu)，使其在自然條件下具有更低的活化能、Km值及催化反應(yīng)溫度，這些特點(diǎn)可以加強(qiáng)其對(duì)底物的親和力，提高底物利用率，從而降低能耗，縮短作用過程的時(shí)間；另外，低溫￠-半乳糖苷酶對(duì)熱很敏感，海洋低溫￠-半乳糖酶上述這些特點(diǎn)有助于該酶制劑的推廣和使用(李興峰等，中國食品學(xué)報(bào)，2003)，這些優(yōu)勢(shì)是中、高溫酶所無法比擬的。利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫￠-半乳糖苷酶在降低生產(chǎn)成本和能耗方面的巨大優(yōu)勢(shì)，可從根本上擺脫中、高溫酶應(yīng)用的加熱、冷卻設(shè)備和工藝，從而減少工藝流程、降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率、改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。該酶制劑開發(fā)對(duì)利用海洋資源，為人類擺脫生存和發(fā)展中所面臨的諸如疾病、能源危機(jī)以及環(huán)境污染等困境提供現(xiàn)實(shí)的機(jī)遇。因此，海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫^-半乳糖苷酶具有廣闊應(yīng)用前景和巨大開發(fā)潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶的方法，該方法主要是海洋微生物經(jīng)過定向馴化后，按常規(guī)方法液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫3 -半乳糖苷酶，這種生產(chǎn)方法獲得的海洋低溫P -半乳糖苷酶活力可達(dá)120U/ml，如再經(jīng)過分離和純化可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該酶制劑生成成本低、純度高，應(yīng)用操作簡單、方便、快捷、 成本低，可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。本發(fā)明所述的一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶的方法具體包括以下步驟(I)將產(chǎn)生￠-半乳糖苷酶的海洋微生物進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長良好；(2)按常規(guī)方法將定向馴化后的P -半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)48 84h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為P-半乳糖苷酶粗酶液；(6)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(5)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本項(xiàng)目中使用的菌種來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進(jìn)行。3 -半乳糖苷酶產(chǎn)生菌(例如，CGMCC菌種編號(hào)1. 3或I. 11)，菌株先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產(chǎn)酶條件發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶，馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在-80°C條件下可以長期保藏。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸餾水I. 0L, pH 值 7. 2，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基乳糖5. 0 15. Og,蛋白胨8. 0 12. Og,酵母膏5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L，pH 值 7. 2，121 °C 高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養(yǎng)基蛋白胨8. 0 12. 0g，酵母膏12. 0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4L 5 3. 5g，瓊脂 15. 0 25. Og,自來水 I. 0L，pH 值 7. 2，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基乳糖15.0 25. 0g，蛋白胨5.0 15. 0g，NaCl 4. 0 7. 0g，K2HPO4L 0 3. 5g，自來水 I. 0L, pH 值 7. 2，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min。(2)將產(chǎn)生P -半乳糖苷酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進(jìn)行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的P -半乳糖苷酶產(chǎn)生菌10 16°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 5%接種量接入10L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 12°C培養(yǎng)72 84h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶結(jié)束；
(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為P-半乳糖苷酶粗酶液；(8)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(7)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實(shí)施例二 (I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸餾水
I.0L, pH 值 7. 2，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基乳糖5. 0 15. Og,蛋白胨8. 0 12. Og,酵母膏5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L，pH 值 7. 2，121 °C 高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養(yǎng)基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4 I. 5 3. 5g，瓊脂 15. 0 25. Og,自來水 I. 0L，pH 值 7. 2，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4 1.0 3.5g，自來水 1.01，？11值7.2，1211高壓蒸汽滅菌30111111。(2)將產(chǎn)生P -半乳糖苷酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進(jìn)行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種進(jìn)行定向馴化，使其在常規(guī)壓力、鹽濃度條件下生長良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的P -半乳糖苷酶產(chǎn)生菌10 16°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的5 7%接種量接入50L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在12 14°C培養(yǎng)60 72h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為P-半乳糖苷酶粗酶液；(8)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(7)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。實(shí)施例三(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸餾水
I.0L, pH 值 7. 2，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基乳糖5. 0 15. Og,蛋白胨8. 0 12. Og,酵母膏5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L，pH 值 7. 2，121 °C 高壓蒸汽滅菌30mino
③液體種子培養(yǎng)基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4 I. 5 3. 5g，瓊脂 15. 0 25. Og,自來水 I. 0L，pH 值 7. 2，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4 1.0 3.5g，自來水 1.01，？11值7.2，1211高壓蒸汽滅菌30111111。(2)將產(chǎn)生P -半乳糖苷酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進(jìn)行初始活化；
(3)將⑵活化好的菌種進(jìn)行定向馴化，使其在常規(guī)壓力、鹽濃度條件下生長良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的P -半乳糖苷酶產(chǎn)生菌10 16°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的7 9%接種量接入200L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在14 16°C培養(yǎng)48 60h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為P-半乳糖苷酶粗酶液；(8)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(7)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫￠-半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟 (1)將產(chǎn)生￠-半乳糖苷酶的海洋微生物進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長良好； (2)按常規(guī)方法將定向馴化后的P-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子； (3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)48 84h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫P -半乳糖苷酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀； (5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm離心,收集到的上清為P-半乳糖苷酶粗酶液； (6)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(5)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，在步驟(6)之后進(jìn)一步包括將步驟(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為 (1)菌種低溫馴化培養(yǎng)基乳糖5.0 15.0g，蛋白胨8.0 12.0g，酵母膏5.0 15. 0g, NaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L，pH 值 7. 2，121 °C 高壓蒸汽滅菌30mino (2)液體種子培養(yǎng)基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12. 0 16. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4 I. 5 3. 5g，瓊脂 15. 0 25. Og,自來水 I. 0L，pH 值 7. 2，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。
(3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基乳糖15.0 25.0g，蛋白胨5.0 15. 0g，NaCl 4. 0 7. 0g，K2HPO4 1.0 3.5g，自來水 1.01，？11值7.2，1211高壓蒸汽滅菌30111111。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶的方法，是將產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的微生物進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長良好；將定向馴化后的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在10～16℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)48～84h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶結(jié)束；發(fā)酵液4,000～8,000rpm離心收集菌體，數(shù)次洗滌后收集沉淀，懸浮于緩沖液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm離心收集上清即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，可以將粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號(hào)C12N9/38GK102653747SQ20121010960
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者于爽, 崔愛萍, 張慶芳, 王曉輝, 竇少華, 遲乃玉 申請(qǐng)人:大連大學(xué)