專利名稱：一種利用香菇液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用香菇液體發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)用酶制劑漆酶的方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase,P-diphenol oxidase, EC I. 10. 3. 2)是一類(lèi)結(jié)合多個(gè)銅離子的蛋白質(zhì)，屬于銅藍(lán)氧化酶，存在菇、菌及植物中，其中以擔(dān)子菌中的白腐菌中分布最為廣泛。漆酶可存活于空氣中，發(fā)生反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物是水，是一種環(huán)保型酵素。由于環(huán)保意識(shí)逐漸被人所重視，因此近年來(lái)漆酶國(guó)內(nèi)外 研究較熱。真菌漆酶一般含有4個(gè)銅離子，其氧化還原電位比昆蟲(chóng)和植物漆酶高，可以氧化多種酚類(lèi)、芳胺類(lèi)、羧酸類(lèi)、留體激素與生物色素、金屬有機(jī)化合物和一些非酚類(lèi)底物，在廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、免疫檢測(cè)等諸多現(xiàn)代工業(yè)領(lǐng)域里都能廣泛應(yīng)用。香燕(Lentinula edodes)又名香蕈,屬擔(dān)子菌綱,傘菌目，蘑菇科，皮裥屬，學(xué)名香皮裥菌，在我國(guó)已有悠久的生產(chǎn)栽培歷史。我國(guó)是全球最大的香菇生產(chǎn)國(guó)，目前在我國(guó)70%以上的省份均有栽培香菇，因此香菇具有價(jià)格低、產(chǎn)地多、易于培養(yǎng)的特點(diǎn)。香菇作為一種白腐真菌已被證明可以產(chǎn)生漆酶，而且其中包括多種同工酶，合稱為總漆酶，且其酶的氧化還原活力比昆蟲(chóng)漆酶、植物漆酶都要高出很多。相比直接從香菇子實(shí)體中提取，低成本、高效的液體發(fā)酵技術(shù)是目前工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)展方向，然而當(dāng)前相關(guān)香菇發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的研究很少，而且與香菇其它活性成分的發(fā)酵提取生產(chǎn)相比，其漆酶的產(chǎn)量仍然偏低，同時(shí)酶活性受到培養(yǎng)條件和基質(zhì)成分等諸多因素的制約。已有報(bào)道利用芳香類(lèi)化合物或重金屬離子誘導(dǎo)提高產(chǎn)量，但是這些誘導(dǎo)物一般都具有毒性，且難于降解，添加后使發(fā)酵液處理成本增高，還易造成環(huán)境污染。利用液體靜置培養(yǎng)或固態(tài)發(fā)酵技術(shù)能夠緩解漆酶生產(chǎn)的環(huán)境污染問(wèn)題，但發(fā)酵周期太長(zhǎng)，不適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用。如中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1463578A(申請(qǐng)?zhí)?2124094)，公開(kāi)了一種香菇液體菌種的深層發(fā)酵培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基涉及菌種深層發(fā)酵培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基。該培養(yǎng)方法包括(I)將母種在母種培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；(2)將在母種培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)長(zhǎng)滿試管的菌絲移種到木屑原種培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 溫度22 27± 1°C，暗培養(yǎng)12 20天，待菌絲長(zhǎng)滿，(3)將木屑菌種充分打碎后立即移種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)搖瓶的培養(yǎng)擴(kuò)增；(4)將一級(jí)搖瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)5 7天的菌液移入盛有新鮮液體培養(yǎng)基的二級(jí)搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)增；(5)將二級(jí)搖瓶出來(lái)的菌液進(jìn)行發(fā)酵處理即可得到成品香菇液體菌種。其它一些利用漆酶基因的異源表達(dá)的產(chǎn)量往往也低于野生菌。因此，這些都限制了目前漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，急需開(kāi)發(fā)一種新的能夠提高漆酶產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的制備方法和生產(chǎn)工藝以滿足現(xiàn)代工業(yè)化的需要。近年來(lái)在植物細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)一類(lèi)稱為擴(kuò)張蛋白的新蛋白種類(lèi)。研究表明，擴(kuò)張蛋白在植物形態(tài)建成(Fleming et al. , 1999)、果實(shí)成熟(Cosgrove, 2000)、根毛發(fā)生(Choand Cosgrove, 2002)、細(xì)胞擴(kuò)張(Cosgrove, 1998)、滲透調(diào)節(jié)(Wu and Cosgrove, 2000)和禾本科植物花粉管生長(zhǎng)(Cosgrove，1997)等諸多方面均起著極為重要的作用。在擬南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多種植物中均已發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張蛋白，被認(rèn)為其普遍存在于各種雙子葉和單子葉植物的細(xì)胞壁中。試驗(yàn)證明這種植物細(xì)胞壁蛋白有使熱鈍化的離體細(xì)胞壁恢復(fù)伸展的功能，推測(cè)其能夠打斷細(xì)胞壁多聚物之間的氫鍵進(jìn)而調(diào)節(jié)酸依賴的細(xì)胞壁延展和壓力松弛等生理活動(dòng)，可能在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起生理調(diào)控和細(xì)胞壁延伸等調(diào)控作用。然而，關(guān)于擴(kuò)張蛋白的作用機(jī)制目前仍未有明確定論，將擴(kuò)張蛋白應(yīng)用于香菇的液體發(fā)酵進(jìn)行漆酶等次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)國(guó)內(nèi)外目前均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用香菇液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法。本發(fā)明技術(shù)方案如下
—種利用香菇液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，包括如下步驟(I)將香菇菌種接種到ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng),得種子液；(2)將步驟(I)制得的種子液按5 15%體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25 30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)I 5天，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 0 3. Omg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)4 8天，分離，取上清液，得到發(fā)酵液；(3)從步驟(2)制得的發(fā)酵液中提取漆酶。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g，蒸餾水定容至lOOOmL。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 ISOr/min,溫度25 30°C,時(shí)間3 6天。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下玉米粉IOOg,麩皮 IOOg,鹿糖 20g,白糖 IOg,蛋白胨 2g, MgSO4 7H20 0. 5g,KH2PO4O. 5g，水定容至 1000ml, pH 5. 0 7. 0。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5 3. Omg/mL ;進(jìn)一步優(yōu)選2. 0 3. Omg/mL。最優(yōu)選的,所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為2. 5mg/mL。所述步驟(2)中的擴(kuò)張蛋白溶液可參照現(xiàn)有技術(shù)制備,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins thatinduce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的記載的方法制備；也可以按照如下方法制備擴(kuò)張蛋白溶液將大豆或黃瓜種子經(jīng)0. 05 0. 15wt % HgCl2消毒4 6min,流水沖洗5 7h,然后，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗下胚軸頂端3 4cm，置_20°C預(yù)冷0. 5h，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，勻漿后，用孔徑70 y m的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取44 50h，過(guò)濾，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加(NH4) 2S04,添加(NH4) 2S04過(guò)程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過(guò)飽和，然后靜置25 30h，4°C條件下25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液經(jīng)20000g離心lOmin，取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液。上述擴(kuò)張蛋白溶液制備方法中，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/L HEPES(4_羥乙基哌嗪乙橫酸)，I. 5mmol/L Na2S2O5, 2mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，0. Iwt Tritonx-100, pH 7. O ;所述提取液組分為15mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，I. 5mmol/LNa2S205,0. 5mol/L NaCl, pH 6. 0 ;所述酸性緩沖液配制是將 2.05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，水定容至1L。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(2)中所述的分離是將發(fā)酵液經(jīng)4 6層紗布過(guò)濾，4°C、8000r/min 離心 15min。所述步驟(3)中，從發(fā)酵液中提取漆酶的步驟如下向步驟⑵制得的發(fā)酵液中0 4°C下按0. 3 0. 5g/mL的添加量向發(fā)酵液中緩慢添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過(guò)程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過(guò)飽和，4°C沉淀6 8h，于4°C IOOOOrpm離心20min，棄上清液，將沉淀溶解于磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液中；4°C用截留分子量為10 20kDa的透析袋透析，然后4°C條件下用截留分子量為10 20kDa的透析膜進(jìn)行超濾濃縮，除去小分子的蛋白質(zhì)，即得香菇漆酶酶液。所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法是將0. 69g磷酸二氫鈉、0. 012g檸檬酸溶于蒸餾水中，定容至lL，pH 8.0。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明將植物擴(kuò)張蛋白和優(yōu)化后的發(fā)酵方法應(yīng)用于香菇漆酶的液體發(fā)酵生產(chǎn)，大幅度提高了香菇漆酶的液體發(fā)酵產(chǎn)量，使產(chǎn)量達(dá)到17. 41U/mL，相比傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)方法提高了 3. 2倍以上，具有極好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2.本發(fā)明所采用的香菇液體發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，環(huán)保無(wú)毒，原材料成本低廉，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程可控，不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)。本方法也適用于其它普通香菇栽培品種3.本發(fā)明所述的植物擴(kuò)張蛋白可從大多數(shù)雙子葉和單子葉植物等多種物種中提取，來(lái)源相當(dāng)廣泛，成本較低，制備方法也相對(duì)簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可工業(yè)化規(guī)模提取。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。原料及培養(yǎng)基實(shí)施例中所述的發(fā)酵菌種為香燕(Lentinus edodes),菌種編號(hào)為XDJ_l,購(gòu)自濟(jì)南先道生物科技有限公司。實(shí)施例中所述截留分子量為10 20kDa的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋，購(gòu)自北京博潤(rùn)萊特科技有限公司，截留分子量為10 20kDa的聚偏氟乙烯(PVDF)透析膜，購(gòu)自濟(jì)南盛偉生物科技有限公司。實(shí)施例中所述牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、考馬斯亮藍(lán)、愈創(chuàng)木酚均購(gòu)自濟(jì)南盛偉科技有限公司，其它試劑均為常規(guī)市售產(chǎn)品。實(shí)施例中所述的擴(kuò)張蛋白溶液的制備步驟如下將大豆(Glycine max L. Merr. CV. M40 ;購(gòu)自濟(jì)南偉麗種業(yè)有限公司)或黃瓜(Cucumis sativus L. CV. Jinnian No. 6 ;購(gòu)自濟(jì)南偉麗種業(yè)有限公司)種子經(jīng)0. Iwt %HgCl2消毒5min，流水沖洗6h，然后，栽入濕蛭石中，27°C暗培養(yǎng)5d。剪取幼苗下胚軸頂端3 4cm，即生長(zhǎng)區(qū)約100g，置-20°C冰箱預(yù)冷0. 5h，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，高速勻漿后，用70 y m尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置2h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取48h，過(guò)濾，濾液按0. 4g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過(guò)程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過(guò)飽和，然后靜置28h，4°C條件下25000g離心lOmin，沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C條件下用截留分子量為3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(購(gòu)自北京博潤(rùn)萊特科技有限公司)透析，透析液經(jīng)20000g離心lOmin，取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液，置4°C下保存。其他未描述步驟可參照 McQueen-Mason 等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Twoendogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell,1992,4 :1425 1433中的描述進(jìn)行。上述勻漿緩沖液組分為25mmol/L HERES (4_羥乙基哌嗪乙磺酸)，I. 5mmol/ LNa2S2O5, 2mmol/L EDTA, 0. Iwt % Triton X-100, pH 7. 0 ；上述提取液組分為15mmol/LHERES，I.Ommol/LEDTA, I. 5mmol/LNa2S205，0. 5mol/LNaCl，pH 6. 0 ；所述酸性緩沖液每升按如下方法配制將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，水定容至1L。擴(kuò)張蛋白溶液濃度的測(cè)定方法采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，具體可參照(《精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，ISBN:703018086，出版日期1900-1-1)中記載的考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行操作，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)檢測(cè)上述擴(kuò)張蛋白溶液中擴(kuò)張蛋白濃度為0. 31g/ml。實(shí)施例中所述的ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。實(shí)施例中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下玉米粉IOOg,麩皮 IOOg,蔗糖 20g，白糖 IOg,蛋白胨 2g，MgSO4 7H20 0. 5g，KH2PO4O. 5g，水定容至 1000ml, pH 5. 0 7. 0。所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法是將0. 69g磷酸二氫鈉、0. 012g檸檬酸溶于蒸餾水中，定容至lL，pH 8.0。琥珀酸鈉緩沖液配制方法是稱取NaOH I. Og和琥珀酸5. 9g，溶于800mL蒸餾水中，用I. OmM的NaOH溶液調(diào)pH 4. 5,蒸懼水定容至1000mL。實(shí)施例I :一種利用香菇液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，包括如下步驟(I)將香菇(Lentinus edodes)菌種，菌種編號(hào)為XDJ-I，接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，溫度28°C，時(shí)間3天，進(jìn)行活化培養(yǎng)，得種子液；(2)將步驟(I)制得種子液按10%體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)I天，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5mg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)8天,經(jīng)5層紗布過(guò)濾,4°C、8000r/min離心15min,取上清液,得到發(fā)酵液；(3)向步驟(2)制得的發(fā)酵液中4°C下按0. 4g/mL的添加量向發(fā)酵液中緩慢添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過(guò)程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過(guò)飽和，進(jìn)行4°C沉淀8h，于4°C IOOOOrpm離心20min，棄上清液，將沉淀溶解于磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液中；4°C用截留分子量為10 20kDa的透析袋透析，然后4°C條件下用截留分子量為10 20kDa的透析膜進(jìn)行超濾濃縮，除去小分子的蛋白質(zhì)，即得香菇漆酶酶液。 漆酶待測(cè)樣品的制備
取由IL發(fā)酵液制得的漆酶，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至50mL，制得漆酶待測(cè)樣品。漆酶的含量測(cè)定(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立采用本領(lǐng)域常規(guī)的BCA法，具體參見(jiàn)(《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》，ISBN : 7-03-008329-6，出版日期2000)(I)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立將牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(0.5g/L)0. OmL,0. ImL,0. 2mL，0. 3mL，0. 4mL，0. 5mL，0. 6mL,依次加入 0. 15mol/L NaCl 溶液 I. OmT,, 0. 9mL, 0. 8mL, 0. 7mL, 0. 6mL, 0. 5mL, 0. 4mL,再在每支管中加入5mL的0. 01% (W/V)考馬斯亮藍(lán)。465nm進(jìn)行測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(I)漆酶的產(chǎn)量測(cè)定取制得的制得的漆酶待測(cè)樣品IOii L試管中，用0. 15mol/L NaCl溶液定容至
1.OmL，搖勻?？瞻讓?duì)照為I. OmL 0. 15mol/L NaCl溶液。再加入5mL加入0. 01wt% (W/V)考馬斯亮藍(lán)。465nm進(jìn)行測(cè)定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量測(cè)得蛋白含量為0. 234g/L，得到漆酶發(fā)酵液每升粗漆酶總蛋白含量為0. 234X100/20 = I. Hg.(2)漆酶的活力測(cè)定采用本領(lǐng)域常規(guī)的愈創(chuàng)木酚法測(cè)定(具體參照張玉榮等影響愈創(chuàng)木酚法測(cè)定玉米過(guò)氧化物酶活力的因素，糧食工程.2008 4 7)發(fā)酵液漆酶總酶活將ImL琥珀酸鈉緩沖液，ImL 4mM愈創(chuàng)木酚和0. 5mL漆酶待測(cè)樣品混合，制得
2.5mL反應(yīng)混合液，然后30°C反應(yīng)30min后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于465nm處測(cè)定吸光值，用0. 5ml磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液替代漆酶待測(cè)樣品與ImL琥珀酸鈉緩沖液和ImL4mM愈創(chuàng)木酚混合做對(duì)照。所述酶活力單位定義每分鐘使OD465值改變0. 01為一個(gè)酶活單位(U)。經(jīng)檢測(cè)，漆酶待測(cè)樣品總酶活為85. IU。得到每毫升粗漆酶發(fā)酵液總酶活為85. 1X2/20 = 8.51U。(測(cè)得值X2得Iml酶活的活力，再除以發(fā)酵液濃縮的倍數(shù))，具體結(jié)果如表I所示。實(shí)施例2 如實(shí)施例I所述的方法，不同之處在于，步驟(2)中，在溫度25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)3天，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液,使擴(kuò)張蛋白的濃度為2. Omg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)6天。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，465nm比色法測(cè)定得到漆酶發(fā)酵液每升粗漆酶總蛋白含量為I. 52g，每毫升發(fā)酵液粗漆酶總酶活10. 33U。具體結(jié)果如表I所示。實(shí)施例3如實(shí)施例I所述的方法，不同之處在于，步驟(2)中，在溫度25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)5天，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液,使擴(kuò)張蛋白的濃度為2. 5mg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)4天。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，465nm比色法測(cè)定得到漆酶發(fā)酵液每升粗漆酶總蛋白含量為2. 82g，每毫升發(fā)酵液粗漆酶總酶活17. 41U。具體結(jié)果如表I所示。對(duì)比例I : 如實(shí)施例I所述的方法，不同之處在于，步驟(2)中，將步驟(I)制得種子液按10%體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)9天，過(guò)濾得發(fā)酵液。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，465nm比色法測(cè)定得到漆酶發(fā)酵液每升粗漆酶總蛋白含量為0. 71g，每毫升發(fā)酵液粗漆酶總酶活4. 07U。具體結(jié)果如表I所示。表I.不同實(shí)施例的香燕漆酶產(chǎn)量比較
權(quán)利要求
1.一種利用香菇液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)將香菇菌種接種到ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，得種子液； (2)將步驟(I)制得的種子液按5 15%體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25 30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)I 5天，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為1.O 3. Omg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)4 8天,分離,取上清液,得到發(fā)酵液； (3)從步驟(2)制得的發(fā)酵液中提取漆酶。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，溫度25 30°C，時(shí)間3 6天。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下 玉米粉 100g，麩皮 100g，蔗糖 20g,白糖 10g，蛋白胨 2g，MgSO4 *7H20 0. 5g, KH2PO4O. 5g，水定容至 1000ml, pH 5. 0 7. 0。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I.5 3.0mg/mL ;進(jìn)一步優(yōu)選2. 0 3. 0mg/mL。最優(yōu)選的，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為2.5mg/mL。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的擴(kuò)張蛋白溶液按照如下方法制備 將大豆或黃瓜種子經(jīng)0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min,流水沖洗5 7h,然后，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗下胚軸頂端3 4cm，置_20°C預(yù)冷0. 5h，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，勻漿后，用孔徑70 y m的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取44 50h，過(guò)濾，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過(guò)程中不斷攪拌，防止(NH4) 2S04局部過(guò)飽和，然后靜置25 30h，4°C條件下25000g離心5 lOmin，沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液經(jīng)20000g離心IOmin,取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/L4-羥乙基哌嗪乙橫酸，I. 5mmol/L Na2S2O5, 2mmol/L 乙二胺四乙酸,0. Iwt Triton X-100, pH 7. 0 ；所述提取液組分為15mmol/L 4-輕乙基哌嗪乙磺酸，I. 0mmol/L乙二胺四乙酸，I. 5mmol/LNa2S2O5, 0. 5mol/L NaCl，pH 6. 0 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4. 0，水定容至1L。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的分離是將發(fā)酵液經(jīng)4 6層紗布過(guò)濾，4°C、8000r/min離心15min。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，從發(fā)酵液中提取漆酶的步驟如下 向步驟(2)制得的發(fā)酵液中0 4°C下按0. 3 0. 5g/mL的添加量向發(fā)酵液中緩慢添加研磨后的(NH4) 2S04,4°C沉淀6 8h，于4°C IOOOOrpm離心20min，棄上清液，將沉淀溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中；4°C用截留分子量為10 20kDa的透析袋透析，然后4°C條件下用截留分子量為10 20kDa的透析膜進(jìn)行超濾濃縮，除去小分子的蛋白質(zhì)，即得香菇漆酶酶液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法是將0. 69g磷酸二氫鈉、0. 012g檸檬酸溶于蒸餾水中，定容至1L，pH 8. O0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用香菇液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，包括如下步驟(1)將香菇菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，得種子液；(2)將種子液按5～15％體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，液體發(fā)酵培養(yǎng)1～5天，加入擴(kuò)張蛋白溶液，然后繼續(xù)培養(yǎng)4～8天，分離，取上清液，得到發(fā)酵液；(3)從發(fā)酵液中提取漆酶。本發(fā)明將植物擴(kuò)張蛋白和優(yōu)化后的發(fā)酵方法應(yīng)用于香菇漆酶的液體發(fā)酵生產(chǎn)，大幅度提高了香菇漆酶的液體發(fā)酵產(chǎn)量，相比傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)方法提高了32倍以上，具有極好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102618512SQ20121011126
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者萬(wàn)魯長(zhǎng), 任海霞, 任鵬飛, 單洪濤, 姚強(qiáng), 孫濤, 宮志遠(yuǎn), 曲玲, 王 琦, 韓建東, 高能 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所