專利名稱：對目標dna序列進行特異性信號放大和檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA序列檢測領(lǐng)域，包括核酸信號放大、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型以及低豐度點突變檢測等技術(shù)領(lǐng)域。具體來說，涉及利用內(nèi)切酶IV/Lambda外切酶復合酶體系與單脫堿基探針的一種放大體系，實現(xiàn)溫和條件下高靈敏度、高選擇性、快速地檢測目標DNA序列。
背景技術(shù)：
核酸信號放大技術(shù)近幾年取得了迅速的發(fā)展，分別建立了以限制性內(nèi)切酶、核酸外切酶III和DNA酶為基礎(chǔ)的信號放大方法。這類技術(shù)的檢測工具都是DNA探針，理論上有希望應(yīng)用于生命體系中進行原位、活體檢測。另一方面，放大過程一般為恒溫，操作較為簡便。因而，核酸信號放大技術(shù)較PCR有一定的優(yōu)勢。但是，目前發(fā)展的一些信號放大方法，靈敏度不夠理想，比PCR低4-5個數(shù)量級，而特異性方面表現(xiàn)也較為一般對于單堿基錯配的區(qū)分并不明顯。所以，這些信號放大方法的主要應(yīng)用依舊局限于偶聯(lián)其他檢測體系，為這些檢測體系放大檢測信號。實際上，信號放大的優(yōu)勢并不僅僅在于提高信號相對于底物的比值，還可以用于放大信號差值如果DNA探針能夠有效區(qū)分完全匹配與單堿基錯配，那么信號放大技術(shù)則可以有效的將這個差異放大，從而被儀器檢測到。對于SNP分型和低豐度突變檢測來說，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是區(qū)分完全匹配與單堿基錯配的信號。所以，特異性高、普適性好的信號放大技術(shù)能夠方便的應(yīng)用于這兩個領(lǐng)域，而且與已有檢測方法相比，信號放大技術(shù)有操作簡單，容易設(shè)計等優(yōu)點。因此，迫切需要開發(fā)具有高選擇性的信號放大體系，將信號放大技術(shù)的優(yōu)點應(yīng)用于SNP分型以及低豐度突變的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種可以在溫和條件下(例如37°C的生理溫度條件下)選擇性放大目標DNA序列信號的放大體系，從而實現(xiàn)高選擇性、高靈敏度、易操作的DNA檢測。內(nèi)切酶IV是一種脫嘌呤/嘧啶(AP)核酸內(nèi)切酶，水解DNA上的完整AP位點(脫堿基位置)，切割5’端與AP位點相連的第一個磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3’ -OH和5’ -P末端，其最適工作溫度為37°C。Lamdba外切酶催化雙鏈DNA分子從5’ -P末端進行逐步的水解，釋放出5’ -單核苷酸，但不能降解5’ -OH末端。根據(jù)這兩種酶的上述特性，本發(fā)明利用單脫堿基探針的區(qū)分作用，結(jié)合內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶的切割作用，采用如下技術(shù)方案，對DNA目標序列進行信號放大和檢測。設(shè)計單脫堿基的雙標記熒光探針，探針為5’ -OH末端的單鏈DNA，脫堿基位置(AP位點)位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處；熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游(可以在探針鏈的中部或3’末端)，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上。將該探針與待測體系混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C的檢測溫度下，如果待測體系中存在能與所述探針特異性結(jié)合的DNA目標序列，則探針與該目標序列所形成的雙鏈DNA中的脫堿基空位被內(nèi)切酶IV識別并切割，結(jié)合于目標序列上的探針被內(nèi)切酶IV切割為3-6 nt的短鏈和剩余的長鏈，3-6 nt的短鏈會從目標序列上解離下來，與目標序列保持結(jié)合的剩余長鏈的5’-P末端則引發(fā)Lamdba外切酶的進一步切割，當熒光基團或猝滅基團標記的核苷酸殘基被切割后，熒光集團與猝滅基團遠離，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)被破壞，從而發(fā)出熒光信號，而探針剩余片段的核苷酸殘基被Lamdba外切酶逐個水解，釋放出的目標序列依舊完好，可以繼續(xù)與另一個探針特異性結(jié)合，再次引發(fā)上述反應(yīng)；重復上述過程，實現(xiàn)目標序列的信號放大和檢測，所檢測到的熒光強度越高表明待測體系中目標序列的含量越高。
進一步的，本發(fā)明在研究過程中還發(fā)現(xiàn)了一個重要現(xiàn)象參見圖1，除AP位點外，當DNA目標序列與探針有一個堿基錯配，且該錯配位于探針AP位點的3’下游第一個堿基位置時(定義該位置為I號位點，定義探針AP位點3’下游第二個堿基位置為2號位點，3號位點、4號位點等等依此類推)，所述信號放大過程得到加速，即熒光上升速率大于DNA目標序列與探針完全匹配的情況。另一方面，當DNA目標序列與探針在3號位點錯配時，信號放大過程得到較大程度抑制；如果目標DNA序列與探針在1、3號位置同時錯配時，信號放大過程受抑制程度更高，熒光上升非常緩慢。根據(jù)上述現(xiàn)象的啟發(fā)，探針具體設(shè)計時有如下原則I.當DNA目標序列沒有受到其他DNA序列的干擾時(這里的干擾性DNA序列特指與DNA目標序列僅有一個堿基不同的序列，記作“單堿基差異干擾序列”)，可以將探針在I號位點設(shè)置成與目標序列錯配，其他部分除AP位點外完全匹配，以加速放大過程，提高靈敏度。2.當DNA目標序列與單堿基差異干擾序列同時存在時，首先確定目標序列與干擾序列的差異堿基，并找到探針與差異堿基對應(yīng)的配對堿基的位置，然后將探針的脫堿基位點設(shè)計在差異堿基配對位點的5’上游第四個堿基處。這樣，探針與目標序列或者干擾序列結(jié)合后，差異堿基位置就剛好處在探針的3號位點。另一方面，將探針3號位點設(shè)計成與目標序列匹配，自然，探針在3號位點與干擾序列是錯配的。同時，故意設(shè)計探針I(yè)號位點的堿基與目標序列錯配，由于干擾序列與目標序列僅在3號位點有一個堿基是不同的，因而探針與干擾序列在I號位點同樣是錯配的?？偟膩砜?，這樣設(shè)計造成的結(jié)果是探針與目標DNA序列在I號位點錯配，信號放大過程得到加速；而探針與單堿基差異干擾序列在1、3號位點同時錯配，信號放大過程得到極大的抑制。事實上，上文所述DNA目標序列與單堿基差異干擾序列在臨床上是很常見的單核苷酸多態(tài)性(SNP)中各種基因型之間的關(guān)系就是這樣的。此外，DNA發(fā)生點突變時，突變型與野生型的關(guān)系同樣如此。因此，本發(fā)明的方法可以用于SNP分型與低豐度突變基因的檢測。SNP分型與低豐度突變檢測唯一的不同在于SNP分型時，樣品僅含有其中一種基因型，而進行低豐度突變檢測時，樣品中同時含有突變型序列和野生型序列，且突變型豐度較低，有些甚至低于I %。因此，可以說，能夠進行SNP分型的辦法不一定能夠進行低豐度突變的檢測，而能夠進行低豐度突變檢測的方法一定能夠用于SNP分型。下面以低豐度突變檢測為例，進一步說明本方法的原理將突變型視為目標序列，野生型視為單堿基差異干擾序列，然后按照上文所述原則2設(shè)計探針。于是，探針與突變型序列在I號位錯配，探針與野生型序列在1、3號位錯配。探針與樣品混合后，突變型序列的信號得到快速的放大，而野生型序列的信號上升很緩慢，這樣，即使突變型序列的豐度很低，依然可以通過快速放大其信號而檢測到它。因此，在本發(fā)明的一方面，針對待測體系中不存在與目標序列僅有一個堿基差異的干擾序列的情況，本發(fā)明提供了如下對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的方法I)制備單脫堿基雙標記熒光探針，該探針為5’_0H末端的單鏈DNA，其脫堿基位置(AP位點)位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處；熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列完全匹配互補，或者僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置與目標序列錯配；2)將步驟I)制備的探針與待測體系混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C進行實時熒光測定所述探針與待測體系中的目標序列特異性結(jié)合，經(jīng)內(nèi)切酶IV和 Lamdba外切酶切割后發(fā)出熒光，釋放出的目標序列繼續(xù)與另一個探針特異性結(jié)合，重復上述過程，從而通過發(fā)出的熒光實現(xiàn)對目標序列的信號放大和檢測。針對待測體系中可能存在與目標序列僅有一個堿基不同的干擾序列的情況，本發(fā)明提供了如下對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的方法I)制備單脫堿基雙標記熒光探針，該探針為5’_0H末端的單鏈DNA，其脫堿基位置位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處；熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置錯配，而與干擾序列在脫堿基位置3’下游第一和第三兩個堿基位置錯配；2)將步驟I)制備的探針與待測體系混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C進行實時熒光測定所述探針與待測體系中的目標序列特異性結(jié)合，經(jīng)內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶切割后發(fā)出熒光，釋放出的目標序列繼續(xù)與另一個探針特異性結(jié)合，重復上述過程，熒光信號快速上升；而所述探針與待測體系中的干擾序列特異性結(jié)合后，熒光信號上升受到抑制；從而通過發(fā)出的熒光實現(xiàn)對目標序列的信號放大和檢測。本發(fā)明探針中的脫堿基位點(AP位點)，可以通過化學合成法直接獲得，也可以通過其他途徑獲得，例如先制備含有單一尿嘧啶(U)脫氧核苷酸位點的雙標記熒光探針，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶(Uracil DNA-glycosylase, UDG)處理，切除尿嘧啶堿基，剩下脫氧核糖殘基，得到單脫堿基位點(AP位點)。本發(fā)明所述探針長度一般設(shè)置為20-30核苷酸殘基。所述探針上的熒光基團和猝滅基團選自常用的FRET基團對，如熒光基團FAM和猝滅基團BHQl，熒光基團FAM和猝滅基團TAMRA，熒光基團TET和猝滅基團BHQ2。熒光基團和猝滅基團在探針上的標記位置可以互換。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的試劑盒，包括單脫堿基雙標記熒光探針、內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，其中所述探針為5’ -OH末端的單鏈DNA，其脫堿基位置位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處，熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列完全匹配互補，或者僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置與目標序列錯配；該試劑盒所針對的待測體系中不存在與目標序列僅有一個堿基差異的干擾序列。在溫和條件下(37°C )，上述試劑盒的探針與待測體系混合后，加入內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，利用內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶的混合酶體系的特異性識別功能，切割與DNA目標序列特異性結(jié)合的探針，發(fā)出熒光，釋放出的DNA目標序列可以與新的探針結(jié)合，重復上述過程，實現(xiàn)信號放大，從而通過實時熒光測定結(jié)果反映出待測體系中目標序列的含量。本發(fā)明還提供了另一種對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的試劑盒，所針對的待測體系中可能存在與目標序列僅有一個堿基差異的干擾序列；該試劑盒包括單脫堿基雙標記熒光探針、內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，其中所述探針為5’-0H末端的單鏈DNA，其脫堿基位置位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處，熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置錯配，而與干擾序列在脫堿基位置3’下游第一和 第三兩個堿基位置錯配。在溫和條件下(37°C)，上述試劑盒的探針與待測體系混合后，力口入內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，利用內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶的混合酶體系的特異性識別功能，快速切割與DNA目標序列特異性結(jié)合的探針，而非常緩慢的切割與單堿基差異干擾序列結(jié)合的探針，同時，結(jié)合的探針被切割后，釋放出的DNA目標序列可以與新的探針結(jié)合，重復上述過程，實現(xiàn)信號放大，從而通過實時熒光測定結(jié)果反映出待測體系中目標序列的含量。本發(fā)明的試劑盒中，所述探針長度一般設(shè)置為20-30核苷酸殘基。所述探針上的熒光基團和猝滅基團選自常用的FRET基團對，如熒光基團FAM和猝滅基團BHQl，熒光基團FAM和猝滅基團TAMRA，熒光基團TET和猝滅基團BHQ2。熒光基團和猝滅基團在探針上的標記位置可以互換。相比于其他信號放大技術(shù)，本發(fā)明有一些顯著的優(yōu)點I.普適性，內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶對序列沒有特殊要求，空位的位置以及故意設(shè)置的I號位點錯配可以根據(jù)目標序列靈活設(shè)計。2.高選擇性，內(nèi)切酶IV/Lambda外切酶混合酶體系對不同位置的錯配有很強的選擇性，同時，一個目標鏈與多個探針結(jié)合，實際上是進行了多次選擇，選擇性也得到了放大，從而實現(xiàn)了超高選擇性的檢測，選擇性高出所有其他信號放大方法。3.條件溫和，可行性高。放大體系不需要加熱，在溫和條件下就可以實現(xiàn)。更重要的是，體系的選擇性來源于酶本身固有的性質(zhì)，因而可以非常容易的實現(xiàn)高選擇性。實驗設(shè)計和條件的控制都很簡便。


圖I是本發(fā)明對DNA目標鏈進行特異性信號放大和檢測的原理示意圖。圖2是實施例I對低濃度DNA目標序列進行檢測的熒光值變化曲線，圖中各曲線分別對應(yīng)不同的目標序列量。圖3是實施例2對不同類型DNA序列進行信號放大的效果比較圖。
圖4是實施例3對低濃度I位錯配DNA目標序列進行檢測的熒光值變化曲線。圖5是實施例4對低豐度突變進行檢測的熒光值變化曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，通過具體實施例進一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1〈低濃度匹配DNA序列檢測>在該實施例中，目標物為DNA單鏈，除 脫堿基位點外，探針與目標DNA單鏈完全匹配。實驗中設(shè)置一系列DNA單鏈的濃度梯度，希望能檢測到盡可能少的目標鏈。檢測原理參見圖I，具體步驟如下I.設(shè)計并合成含有尿嘧啶脫氧核苷酸殘基的雙標記熒光探針，然后使用UDG酶處理得到單脫堿基探針；2.將得到的單脫堿基探針與不同濃度的目標DNA序列混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，迅速測定混合溶液熒光值隨時間的變化。在該實施例中，設(shè)計的探針序列如下5，-TCGUCT (-FAM)CCACAGACACATACTCCA-BHQ 1-3，(SEQ ID No. I)該探針的5’端為-0H, 5’端下游第4位為脫堿基位點，脫堿基位點下游第2位核苷酸殘基上標記有熒光基團FAM，探針3’端標記猝滅基團BHQl。目標序列如下5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 2)(下劃線部分與探針互補匹配)不同濃度目標序列的50 μ L反應(yīng)體系中探針量5pmol ；目標序列量5pmol,lpmol, O. Ipmol, IOfmol, Ifmol ;各反應(yīng)體系中加入O. IU的內(nèi)切酶IV和5U的Lambda外切酶?？瞻讓φ阵w系探針5pmol,目標序列量0。熱程序37°C 2400s，每8s測定一次熒光值。熒光測定儀器為實時熒光PCR儀rotor-gene 6000，檢測時檢測器的靈敏度(gainlevel)為7。檢測結(jié)果熒光值變化曲線如圖2所示，曲線a、b、C、d、e和f分別對應(yīng)于加入5pmol, lpmol,O. lpmol, IOfmol, Ifmol和O的目標序列量,在反應(yīng)開始后的前600s內(nèi)，突光值隨著時間逐漸增大，30min后，目標序列量多于Ipmol的反應(yīng)體系中，熒光值達到平臺。實施例2〈不同類型DNA序列放大效果對比>在該實施例中，目標物為DNA單鏈。實驗中設(shè)置一系列不同類型的DNA單鏈除脫堿基位點外，單脫堿基雙熒光標記探針與這些單鏈I位錯配，完全匹配，2位錯配，3位錯配或1、3位錯配。檢測原理參見圖1，具體步驟如下I.設(shè)計并合成含有尿嘧啶脫氧核苷酸殘基的雙標記熒光探針，然后使用UDG酶處理得到單脫堿基探針；2.將得到的單脫堿基探針(5 pmol)與不同類型的目標DNA序列(I pmol)混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，迅速測定混合溶液熒光值隨時間的變化。熱程序37°C 1600s，每8s測定一次熒光值。熒光測定儀器為實時熒光PCR儀rOtOr-gene6000，檢測時檢測器的靈敏度(gain level)為7。該實施例包含三個實驗(一 )實驗I的結(jié)果見圖3 (a)和(b)。實驗I所用的探針序列如下 5，-TCGUCT (-FAM)CCACAGACACATACTCCA-BHQ 1-3，(SEQ ID No. I)該探針的5’端為-0H, 5’端下游第4位為脫堿基位點，脫堿基位點下游第2位核苷酸殘基上標記有熒光基團FAM，探針3’端標記猝滅基團BHQl。目標序列如下I位錯配序列I (記作I-C :T ;圖3 (b)柱I)5’ ~GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAT ACGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 3)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；I位錯配序列II (記作I-C :C ;圖3 (b)柱2)5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGA C ACGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 4)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；I位錯配序列III (記作I-C :A ;圖3 (a)曲線a，圖3 (b)柱3)5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGA A ACGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 5)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；完全匹配序列(圖3 (a)曲線b，圖3 (b)柱4)5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 2)(下劃線部分與探針互補匹配)；2位錯配序列(記作2-T :T ;圖3 (a)曲線c)5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGG T GACGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 6)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；3位錯配序列(記作3-C :A ;圖3 (a)曲線d)5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG T AGACGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 7)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；1、3位錯配序列1(記作I-C :A，3_C :T ;圖3(a)曲線e，圖3 (b)柱5):5 ’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG T A A ACGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 8)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；1、3 位錯配序列 11(記作 I-C :A，3_C :A ;圖 3(b)柱 6)5 ’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG A A Λ ACGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 9)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；1、3 位錯配序列 111(記作 I-C :A，3_C :C ;圖 3(b)柱 7)5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG C A A ACGAGAGTAAG-3’ (SEQ ID No. 10)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)。( 二)實驗2的結(jié)果見圖3 (C)。實驗2所用的探針序列如下5，-TCGUCT(-FAM)TCACAGACACATACTCCA-BHQ 1-3， (SEQ ID No. 11)
該探針的5’端為-0H, 5’端下游第4位為脫堿基位點，脫堿基位點下游第2位核苷酸殘基上標記有熒光基團FAM，探針3’端標記猝滅基團BHQl。目標序列如下I位錯配序列(記作I-C :A ;圖3 (C)柱I)5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGAA A ACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 9)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；完全匹配序列(圖3 (C)柱2):5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGA AGACGAGAGTA AG-3，(SEQ ID No. 12)(下劃線部分與探針互補匹配)；
1、3 位錯配序列(記作 I-C :A，3-T :G ;圖 3(c)柱 3)5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG GaA ACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 5)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；I、3 位錯配序列(記作 I-C A,3-T :T ;圖 3(c)柱 4)5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG T A A ACGAGAGTAAG-3’ (SEQ ID No. 8)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)。(三)實驗3的結(jié)果對應(yīng)圖3(d)。實驗3所用的探針序列如下5，-TCAUCT(-FAM)GCACAGACACATACTCCA-BHQl-3， (SEQ ID No. 13)該探針的5’端為-0H, 5’端下游第4位為脫堿基位點，脫堿基位點下游第2位核苷酸殘基上標記有熒光基團FAM，探針3’端標記猝滅基團BHQl。目標序列如下I位錯配序列(記作I-C :A ;圖3 (d)柱I)5 -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGA Λ ATGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 14)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；完全匹配序列(圖3 (d)柱2):5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGCAGATGAGAGTAAG-3’ (SEQ ID No. I 5)(下劃線部分與探針互補匹配)；1、3 位錯配序列(記作 I-C :A，3_G :G ;圖 3(d)柱 3)5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG G A Λ ATGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 16)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；1、3 位錯配序列(記作 I-C :A，3_G :A ;圖 3(d)柱 4)5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG A. A A ATGAGAGTAAG-3 ’ (SEQ ID No. 17)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)。實驗結(jié)果顯示三種I位錯配的DNA序列都能加速信號放大，七種1、3位錯配的DNA序列都顯著阻礙信號放大過程。實施例3〈低濃度I位錯配DNA序列檢測>在該實施例中，目標物為DNA單鏈，除脫堿基位點外，探針與目標DNA單鏈在I號位點錯配。實驗中設(shè)置一系列DNA單鏈的濃度梯度，希望能檢測到盡可能少的目標鏈。檢測原理參見圖I，具體步驟如下
I.設(shè)計并合成含有尿嘧啶脫氧核苷酸殘基的雙標記熒光探針，使用UDG酶處理得到單脫喊基探針；2.將得到的單脫堿基探針與不同濃度的目標DNA序列混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，迅速測定混合溶液熒光值隨時間的變化。在該實施例中，設(shè)計的探針序列如下5’-TCGUCT (-FAM)CCACAGACACATACTCCA-BHQ 1-3’ (SEQ ID No. I)該探針的5’端為-0H, 5’端下游第4位為脫堿基位點，脫堿基位點下游第2位核苷酸殘基上標記有熒光基團FAM，探針3’端標記猝滅基團BHQl。
目標序列如下5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGA A ACGAGAGTAAG-3’ (SEQ ID No. 5)(下劃
線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；不同濃度目標序列的50μ L反應(yīng)體系中探針量5pmol ；目標序列量5pmol,lpmol, O. lpmol, IOfmol, Ifmol ;各反應(yīng)體系中加入O. IU的內(nèi)切酶IV和5U的Lambda外切酶?？瞻讓φ阵w系探針5pmol,目標序列量0。熱程序37°C 1600s，每8s測定一次熒光值。熒光測定儀器為實時熒光PCR儀rotor-gene 6000，檢測時檢測器的靈敏度(gainlevel)為7。檢測結(jié)果熒光值變化曲線如圖4所示，曲線a、b、C、d、e和f分別對應(yīng)于加入5pmol, lpmol, O. lpmol, IOfmol, Ifmol和O的目標序列量,在反應(yīng)開始后的前200s,突光值隨著時間逐漸增大，IOmin后，目標序列量多于Ipmol的反應(yīng)體系中，熒光值達到平臺。 實施例4〈低豐度突變檢測>在該實施例中，待測體系為野生鏈、突變鏈的混合體系，除脫堿基位點外，探針設(shè)計為與野生鏈在1、3號位錯配，與突變鏈在I號位錯配。兩種鏈的總量為lpmol，但設(shè)置一系列不同的突變比例，希望能檢測到盡可能低的突變比例。檢測原理參見圖1，具體實施步驟如下I.制備單脫堿基探針，方法同實施例I中步驟I ;2.將單脫堿基探針與含有不同比例突變鏈的混合目標體系混合，加入內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，迅速測定熒光值隨時間的變化。在該實施例中，設(shè)計的探針序列如下5’-TCGUCT (-FAM)CCACAGACACATACTCCA-BHQ 1-3’ (SEQ ID No. I)該探針的5’端為-0H, 5’端下游第4位為脫堿基位點，脫堿基位點下游第2位核苷酸殘基上標記有熒光基團FAM，探針3’端標記猝滅基團BHQl。突變鏈序列如下5’ -GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGA Λ ACGAGAGTAAG-3 (SEQ ID No. 5)(下劃線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)；野生鏈序列如下5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTG T A A ACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 8)(下劃
線部分與探針互補匹配，加著重號的是錯配堿基)。
不同比例突變鏈序列的50yL反應(yīng)體系探針量5pmol ;突變鏈比例10%，5%，2.0%,1%,0.5%,混合鏈(突變鏈和野生鏈)總量均為Ipmol ;各反應(yīng)體系中加入O. IU的內(nèi)切酶IV和5U的Lambda外切酶?？瞻讓φ战M探針量5pmol ;突變比例0%。熱程序37°C 1200s，每8s測定一次熒光值。熒光測定儀器為實時熒光PCR儀rotor-gene 6000，檢測時 檢測器的靈敏度(gainlevel)為7。檢測結(jié)果熒光值變化曲線如圖5所示，曲線a、b、C、d、e和f分別對應(yīng)于突變鏈比例為10 %，5 %，2. O %，I %，O. 5 %和O的混合目標體系，熒光值隨著時間逐漸增大，上升斜率隨突變型豐度下降而下降。
權(quán)利要求
1.一種對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的方法，所述待測體系中不存在與目標序列僅有一個堿基差異的干擾序列，該方法包括如下步驟 1)制備單脫堿基雙標記熒光探針，該探針為5’-OH末端的單鏈DNA，其脫堿基位置位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處；熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列完全匹配互補，或者僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置與目標序列錯配； 2)將步驟I)制備的探針與待測體系混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C進行實時熒光測定所述探針與待測體系中的目標序列特異性結(jié)合，經(jīng)內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶切割后發(fā)出熒光，釋放出的目標序列繼續(xù)與另一個探針特異性結(jié)合，重復上述過程，從而實現(xiàn)對目標序列的信號放大和檢測。
2.一種對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的方法，所述待測體系中可能存在與目標序列僅有一個堿基差異的干擾序列，該方法包括如下步驟 1)制備單脫堿基雙標記熒光探針，該探針為5’-0H末端的單鏈DNA，其脫堿基位置位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處；熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置錯配，而與干擾序列在脫堿基位置3’下游第一和第三兩個堿基位置錯配； 2)將步驟I)制備的探針與待測體系混合，然后加入內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C進行實時熒光測定所述探針與待測體系中的目標序列特異性結(jié)合，經(jīng)內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶切割后發(fā)出熒光，釋放出的目標序列繼續(xù)與另一個探針特異性結(jié)合，重復上述過程，熒光信號快速上升；而所述探針與待測體系中的干擾序列特異性結(jié)合后，熒光信號上升受到抑制；從而實現(xiàn)對目標序列的信號放大和檢測。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，在所述探針上，熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在探針的中部或3 ’末端。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，步驟I)通過化學合成法制備所述單脫堿基雙標記熒光探針；或者，先制備含有單一尿嘧啶脫氧核苷酸位點的雙標記熒光探針，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶對其進行處理，切除尿嘧啶堿基，得到單脫堿基雙標記熒光探針。
5.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述探針長度為20-30核苷酸殘基。
6.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述熒光基團和猝滅基團是下列基團對之一 FAM 和 TAMRA，F(xiàn)AM 和 BHQl，或者 TET 和 BHQ2。
7.一種對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的試劑盒，所述待測體系中不存在與目標序列僅有一個堿基差異的干擾序列，該試劑盒包括單脫堿基雙標記熒光探針、內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，其中所述探針為5’ -OH末端的單鏈DNA，其脫堿基位置位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處，熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列完全匹配互補，或者僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置與目標序列錯配。
8.一種對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的試劑盒，所述待測體系中可能存在與目標序列僅有一個堿基差異的干擾序列；該試劑盒包括單脫堿基雙標記熒光探針、內(nèi)切酶IV和Lambda外切酶，其中所述探針為5’ -OH末端的單鏈DNA，其脫堿基位置位于探針5’末端下游第3-6位核苷酸殘基處，熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在上一個基團的下游，二者之間相隔三個核苷酸殘基以上；除脫堿基位置外，該探針與DNA目標序列僅在脫堿基位置3’下游第一個堿基位置錯配，而與干擾序列在脫堿基位置3’下游第一和第三兩個堿基位置錯配。
9.如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述探針長度為20-30核苷酸殘基。
10.如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，在所述探針上，熒光基團和猝滅基團中的一個標記在脫堿基位置下游六個核苷酸殘基以內(nèi)，另一個標記在探針的中部或3 ’末端；所述熒光基團和猝滅基團是下列基團對之一 FAi^P TAMRA，F(xiàn)AM和BHQ1，或者TET和BHQ20
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對待測體系中的DNA目標序列進行特異性信號放大和檢測的方法，利用單脫堿基雙標記熒光探針的區(qū)分作用，結(jié)合內(nèi)切酶IV和Lamdba外切酶的選擇性切割作用，在溫和條件下高靈敏度、高選擇性、快速地檢測DNA目標序列。本發(fā)明方法能夠區(qū)分目標序列與單堿基差異干擾序列，適合應(yīng)用于SNP分型以及低豐度突變的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102660640SQ20121011240
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者張晨, 肖先金, 蘇昕, 趙美萍 申請人:北京大學