專利名稱：檢測(cè)禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，特別涉及一種檢測(cè)禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒以及利用所述試劑盒檢測(cè)禽白血病病毒群特異性抗原的方法。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽白血病病毒(ALV)屬反轉(zhuǎn)錄病毒科，禽C性反轉(zhuǎn)錄病毒屬，可引起禽類多種腫瘤性疾病。本病在世界各地均有發(fā)生，感染率高，發(fā)病率低，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一。禽白血病主要危害有兩個(gè)方面，一是產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致雞的死亡；二是引起母雞產(chǎn)蛋率下降、蛋重減輕等生產(chǎn)指標(biāo)的改變；而且，還可以引起雞的免疫抑制，繼發(fā)其他細(xì)菌和病毒的感染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近些年來，在國內(nèi)許多省份，ALV-J主要感染15到29周齡蛋雞，弓丨起產(chǎn)蛋量顯著下降，趾骨周圍皮膚和羽毛處淋巴結(jié)出血。1997年和1998年，J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病尚無徹底可行的防治措施。迄今為止尚無有效地疫苗可用。預(yù)防本病的主要方法是培育具有遺傳性抵抗力的新品種，淘汰陽性雞，凈化種群，經(jīng)過幾代選育出無白血病的雞群。自1868年，Roloff報(bào)道禽白血病以來，研究工作者就對(duì)其進(jìn)行長期的研究，并在病毒的分離、鑒定、檢測(cè)和診斷方面取得了相當(dāng)大的成就。建立了很多禽白血病的檢測(cè)方法，如病毒中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA、放射免疫、免疫熒光技術(shù)等。國外很早就建立了檢測(cè)該病的ELISA診斷試劑盒，但國內(nèi)目前為止還沒有令人滿意的商品化禽白血病診斷試劑。禽白血病病毒的主要蛋白質(zhì)組分有g(shù)ag基因編碼的核心蛋白，pol基因編碼的3種酶，env基因編碼的兩種糖蛋白。在gag編碼的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特異性抗原，是一種高度保守的非糖基化蛋白，有許多病毒抗原位點(diǎn)，是制備檢測(cè)抗體的首選抗原。本發(fā)明利用本實(shí)驗(yàn)室制備的針對(duì)p27的單克隆抗體和多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA方法，為ALV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查以及ALV的早期診斷提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于建立一種檢測(cè)禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其操作簡(jiǎn)單，特異性好，敏感性高，具有良好的可靠性；本發(fā)明的目的之二在于提供了一種使用以上所述的試劑盒進(jìn)行禽白血病病毒群特異性抗原檢測(cè)的方法；本發(fā)明的目的之三在于提供用于建立以上所述試劑盒的單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；本發(fā)明的目的之四在于提供所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測(cè)或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途；及所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段本發(fā)明發(fā)明人從黑龍江省某雞場(chǎng)送檢的海蘭褐蛋雞病料中分離鑒定出I株J亞群禽白血病病毒(ALV-J)，命名為HLJ09MDJ-I。為了解其分子特征，對(duì)其進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并與其他毒株進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，HLJ09MDJ-1分離株的gag和pol基因非常保守，與各參考毒株的同源性為97. 5% 99. 0% ；env基因的同源性為88. 4% 97. 5%。與參考毒株相比，HLJ09MDJ-1分離株與HPRS-103株的親緣關(guān)系較近。該毒株HLJ09MDJ-1及全序列分析已分別記載在2010年11期的《動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》題目為“蛋雞J亞群禽白血病病毒HLJ09MDJ-I株的分離鑒定”和2010年第8卷的《Virologyjournal〉〉，題目為“Novel sequences of subgroup J avian leukosis viruses associatedwith hemangioma in Chinese layer hens”的文中，公眾可通過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽傳染病研究室獲取得到。兩篇文章以全文引用的方式并入本發(fā)明的說明書中。本發(fā)明從ALV-J (HLJ09MDJ-1)病毒株感染的DF-1細(xì)胞的凍融裂解液中提取DNA，通過PCR方法擴(kuò)增出禽白血病群特異性抗原p27基因，將其克隆至pMD18-T載體，酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定和分析。最后將P27基因亞克隆到載體pET-30a(+)，轉(zhuǎn)化受體菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)獲得融合蛋白。經(jīng)過Western-blot檢測(cè),證明表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。將純化的P27蛋白作為抗原，免疫7周齡BALB/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，最終制備了 5株能夠分泌抗p27蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。其分泌的單克隆抗體效價(jià)高達(dá)IO7以上，且分泌抗體穩(wěn)定、特異性高。ALV-J，ALV-A, ALV-B是常見的外源性禽白血病病毒，5株雜交瘤細(xì)胞株能夠與ALV-J，ALV-A，ALV-B發(fā)生特異性反應(yīng)，能夠觀察到明顯的熒光，且與DF-I細(xì)胞不反應(yīng)。本發(fā)明從五株雜交瘤細(xì)胞株挑選出了一株特異性好且效價(jià)較高的分泌抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為雜交瘤細(xì)胞株2E5，分類命名為雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其微生物保藏號(hào)為CGMCCNo. 5961，保藏時(shí)間為2012年3月29日。進(jìn)一步的本發(fā)明還提供了由所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。再進(jìn)一步的，本發(fā)明又提供了所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測(cè)或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。及所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。本發(fā)明利用得到的單克隆抗體建立了一種檢測(cè)禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于包括包被抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板；所述的單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細(xì)胞株命名為雜交瘤細(xì)胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5961。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的單克隆抗體的包被量為2 ii g/ML。本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步的還可包括抗禽白血病病毒p27蛋白的多抗、酶標(biāo)抗兔二抗、封閉液以及稀釋液等，所述的封閉液優(yōu)選為含有50g/L的脫脂奶粉的IOmM pH7. 2的磷酸緩沖液；所述的稀釋液優(yōu)選為IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液。所述的試劑盒能夠用于制備檢測(cè)禽白血病群特異性抗原的試劑。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施例中，優(yōu)選的，所述的試劑盒包括酶標(biāo)板由保藏編號(hào)為CGMCC No. 5961的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體2E5包被，包被量為Zyg/ML; 多克隆抗體抗p27蛋白的多克隆抗體，濃度為4 μ g/ML ；酶標(biāo)ニ抗HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG(sigma公司)；封閉液含有50g/L的脫脂奶粉的IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液；稀釋液10mM pH 7. 2的磷酸緩沖液；洗滌液含O. 5%吐溫20的IOmM pH 7. 2的PBS緩沖液；陰性對(duì)照未接毒生物DF-I細(xì)胞培養(yǎng)液；陽性對(duì)照ALV-J(HLJ09MDJ-1)的DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液；顯色液TMB顯色液(TianGen)；終止液2mol/L硫酸溶液。其他的任何可獲得的禽白血病病毒(ALV)都可作為本發(fā)明試劑盒中的陽性對(duì)照，而達(dá)到相同的技術(shù)效果。本發(fā)明還提供了利用所述的試劑盒檢測(cè)禽白血病病毒群特異性抗原的方法，其特征在于按照雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，具體的包括以下步驟(I)包被抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板4°C過夜后用含O. 5%吐溫20的磷酸緩沖液洗滌，37°C封閉液封閉4h，洗板；(2)加入待檢樣品，室溫孵育，洗板；(3)加入純化的多抗，室溫孵育，洗板；(4)加入酶標(biāo)抗兔ニ抗，室溫孵育，洗板；(5)加入TMB顯色液，室溫顯色，最后加2mol/L硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定OD45tlnm值。為了確定出最佳反應(yīng)條件，本發(fā)明在不同反應(yīng)條件下，對(duì)單抗2E5包被量(8yg/ml>4 μ g/ml>2 μ g/ml、l μ g/ml)，多抗工作濃度(8 μ g/ml>4 μ g/ml>2 μ g/ml、l μ g/ml) ,HRP標(biāo)記的抗兔ニ抗稀釋度(I 8000,1 5000,1 3000)，病毒、單抗、酶標(biāo)ニ抗(O. 5h、lh、I. 5h)及TMB工作最佳作用時(shí)間(10min、15min、20min)，封閉液的種類(10g/L BSA、50g/L脫脂奶粉、10g/L魚明膠)進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)同一陽性和陰性樣品。選擇OD45tol值接近于I. O, P/N值最大的條件為最佳條件。經(jīng)試驗(yàn)確定DAS-ELISA單抗2E5最佳包被量為2 μ g/ML，多抗最佳濃度為4 μ g/ML，酶標(biāo)ニ抗最佳稀釋度為I : 3000(以上四要素通過方陣法確定)，病毒抗原、多抗、酶標(biāo)ニ抗及TMB最佳作用時(shí)間分別為lh, lh, Ih和20min。封閉液選擇含有50g/L脫脂奶粉的IOmM pH 7. 2磷酸緩沖液。本實(shí)驗(yàn)中建立的DAS-ELISA是以抗p27蛋白的単體和多抗分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體，而不是ALV其他蛋白的單抗和多杭，是因?yàn)閜27是主要的群特異性抗原，在不同ALV亞群中高度保守，且有許多病毒抗原位點(diǎn)，是制備檢測(cè)抗體的首選抗原。本實(shí)驗(yàn)建立的DAS-ELISA具有良好的敏感性和特異性，能夠檢測(cè)到I. 25ng/mlp27蛋白，且與常見的禽類病毒不反應(yīng)(IBV，MDV，AIV等)。ALV-J，ALV-A，ALV-B是常見的外源性禽白血病病毒，DAS-ELISA與ALV-J、ALV-A和ALV-B反應(yīng)特異，為禽白血病的診斷、防控和凈化奠定了基礎(chǔ)。在人工感染試驗(yàn)中，PCR最早檢出陽性為感染ALV后第11天(lid. p. i.)，DAS-ELISA最早檢出陽性是在12d.p. i.。DAS-ELISA檢測(cè)到ALV比PCR方法晚一天，敏感性良好，且與PCR的符合率很高。PCR方法檢測(cè)ALV早有文獻(xiàn)報(bào)道，但是DAS-ELISA與PCR相t匕，具有方便、省時(shí)和批量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。DAS-ELSIA在攻毒后12天后就能檢測(cè)到ALV’為ALV的檢測(cè)和及時(shí)淘汰陽性雞群奠定了基礎(chǔ)。利用DAS-ELSIA檢測(cè)了 491份蛋清樣品和190份肛拭子樣品，與PCR方法符合率分別為96. 5%和88. 9%?？傊?，ALV DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立，為ALV的檢測(cè)和防控奠定了基礎(chǔ)。


圖I為p27基因的PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)載體pET_30a-p27的酶切鑒定；圖A為p27基因的PCR擴(kuò)增(M DNA Marker DL2000 ；1 :p27基因PCR產(chǎn)物；2 :陰性對(duì)照)；圖8為重組表 達(dá)載體 pET-30a-p27 的酶切鑒定(I pET-30a-p27BamH I/Sal I ；M1 DNA Marker DL2000 ；M2 DNA Marker DL 15000)圖2A為誘導(dǎo)表達(dá)p27蛋白的SDS-PAGE分析；圖2B為p27蛋白的Western blot分析；al.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；a2. a3. a4誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物；a5.誘導(dǎo)前表達(dá)產(chǎn)物；a6.純化后的p27蛋白；bl.純化的p27蛋白；b2.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker圖3為單抗的特異性鑒定；圖4為單抗間接熒光免疫反應(yīng)(IFA)分析結(jié)果；圖5為多克隆抗體間接免疫滅光結(jié)果；A =ALV-A間接免疫熒光結(jié)果；B =ALV-B間接免疫熒光結(jié)果；C =ALV-J間接免疫熒光結(jié)果；D :陰性對(duì)照；圖6為單抗2E5和多抗的間接免疫熒光鑒定；圖7為DAS-ELSIA的敏感性分析；圖8為DAS-ELSIA的特異性性分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例I抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體及分泌該抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備I、材料和方法I. I病毒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和血清ALV毒株ALV-J(HLJ09MDJ-1)、ALV-A和ALV-B由哈爾濱獸醫(yī)研究所分離鑒定，提供；IBV, MDV，AIV H5, AIV H7, AIV H9, I LTV, FPV, IBDV, NDV, ARV 和 REV 由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；3周齡BALB/c小鼠，2月齡新西蘭家兔和SPF雞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；DF-1、S/P20細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；兔抗天然p27蛋白陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。I. 2載體、細(xì)菌克隆載體PMD-18T、原核表達(dá)載體pET_30a、大腸桿菌DH5a和BL21菌種由本實(shí)驗(yàn)
室保存。I. 3 試劑 DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收提取試劑盒購自AXYGEN公司；T4DNA連接酶、IPTG、PMD18-T載體等購自大連寶生物工程(Takara)有限公司；原核表達(dá)載體pET_30a購買自Novagen公司；HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG、抗鼠突光二抗購自Sigma公司，免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；1640培養(yǎng)基、HAT、HT購自GibcoBRL，蛋白純化用填充材料購自GE healthcare。I. 4引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)HLJ09MDJ-1毒株的序列(潘偉，高玉龍，秦立廷，等.蛋雞J亞群禽白血病病毒株HLJ09MDJ-1的分離鑒定及全基因組序列分析，中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C]. 2010.)，用軟件，premier 5. 0設(shè)計(jì)一對(duì)引物pi、p2用于擴(kuò)增p27基因，是含有BamH I和SalI酶切位點(diǎn)的一對(duì)特異性引物，上游引物Pl 5，CGGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGAC 3’，含有BamH I酶切位點(diǎn)。下游引物 P2 :5’ ACGTCGACCTAGGGCTGGATAGCAGACG 3’，含有 Sal I 酶切位點(diǎn)。I. 5DNA提取和p27基因的擴(kuò)增將毒株HLJ09MDJ-1接種到對(duì)數(shù)期生長DF-I細(xì)胞的6孔板上，7天后收集細(xì)胞培養(yǎng)板并凍融DF-I細(xì)胞3次。用DNA提取試劑盒從DF-I細(xì)胞凍融液中提取DNA (操作按說明書進(jìn)行)。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為94°C 5min，94°C 30s, 56°C 30s，72°C lmin，擴(kuò)增35次，最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳分析。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID No. 2所示。其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。I. 6重組表達(dá)載體pET-30a_p27的構(gòu)建及鑒定利用AXYGEN凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于pMD_18T載體后轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，用BamH I和SalI雙酶切鑒定，鑒定為陽性的重組質(zhì)粒的命名為pMD_P27并送生物公司測(cè)序。利用BamH I和SalI雙酶切質(zhì)粒pMD_p27和pET_30a，分別回收720bp和4900bp片段，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌，小量提取質(zhì)粒，BamH I和SalI雙酶切鑒定出陽性質(zhì)粒，命名為pET-30a-p27。I. 7p27基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)、純化及活性檢測(cè)挑取單個(gè)含有口￡1'-30&- 27的乩-21細(xì)菌菌落加入1(&11(1001^/1111)的LB中，37°C過夜振搖培養(yǎng)，次日擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_約為0. 8，加入IPTG至終濃度0. ImM,于37°C誘導(dǎo)6h，收獲細(xì)菌。離心后，將菌體用PBS重懸(50iiL PBS/mL LB)，于4°C過夜后，超聲波溫和裂解菌體，離心取上清，12% SDS-PAGE電泳分析。而后轉(zhuǎn)印到NC膜上，封閉后，酶標(biāo)兔抗p27抗體3000倍稀釋孵育，加底物顯色。由于p27蛋白與His Tag是以融合蛋白的形式表達(dá)，因此可以用Ni填料對(duì)其進(jìn)行非變性純化,具體方法參照按照GE healthcare公司His Trap HP使用說明書進(jìn)行。將純化的His-p27融合蛋白和重組蛋白用兔抗自然P27蛋白陽性血清進(jìn)行Western blot分析。I. 8免疫動(dòng)物
把純化的p27蛋白(2mg/ml)加等量的弗氏完全佐劑，皮下注射7周齡BLAB/c小鼠，每只0.05ml ;21d后用含等量弗氏不完全佐劑的p27蛋白腹腔注射二次免疫，O. Iml/只，21天后僅用p27蛋白腹腔兼尾靜脈注射O. 05mL/只加強(qiáng)免疫，3d后取脾用于融合。I. 9陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立取上述免疫鼠的脾制成細(xì)胞懸液與處于對(duì)數(shù)生長期的S/P20細(xì)胞以8 I的比例進(jìn)行融合。待融合細(xì)胞長至孔底1/2或1/3時(shí)，通過間接ELISA篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞株，再利用有限稀釋法連續(xù)克隆2 3次。至陽性率為100%后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存于液氮中。I. 10抗p27蛋白的單克隆 抗體的制備將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，以5X 106/0. 5ml雜交瘤細(xì)胞腹腔注射BLAB/C小鼠1ml，14d后待小鼠腹圍增大后用注射器收集腹水，1000r/min離心lOmin，上清以O(shè). 45 μ m濾器過濾后即為腹水MAb粗制品。I. 11單抗的效價(jià)測(cè)定及亞類的測(cè)定將純化的p27蛋白作I : 1000稀釋包被酶聯(lián)反應(yīng)板，用間接ELISA法測(cè)定腹水中MAb效價(jià)，以P/N > 2. 5的最大稀釋度作為抗體的效價(jià)。用免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒檢測(cè)五株p27單抗的亞類。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。I. 12單抗的特異性鑒定I. 12. I五株單抗與禽類常見病毒的交叉反應(yīng)將ALV-J, ALV-A, ALV-B, IBV，MDV，AIV H5,AIV H7,AIV H9, ILTV, FPV，IBDV,NDV，ARV和REV等14種病毒根據(jù)蛋白含量的不同，全部稀釋至約15 μ g/mL包被酶聯(lián)反應(yīng)板，間接法ELISA檢測(cè)與單抗反應(yīng)，DF-I細(xì)胞凍融離心后上清作為陰性對(duì)照，PBS作為空白對(duì)照。OD45tl >0.2判定為陽性。I. 12. 2五株單抗與ALV-J、ALV-A, ALV-B間接熒光免疫反應(yīng)將ALV-J(HLJ09MDJ-1) ,ALV-A和ALV-B禽白血病病毒接種于含DF-1細(xì)胞的24孔細(xì)胞板，將不接種病毒的DF-I作為陰性對(duì)照。5d后將培養(yǎng)液棄掉，用無水こ醇固定15min，將單抗2E5、3H8、4B7、6D9和10G2做I : 200稀釋，加入細(xì)胞板孔內(nèi)，室溫孵育lh。PBST洗4次，抗鼠熒光二抗做I : 200稀釋加入細(xì)胞板孔內(nèi)，避光室溫孵育lh，用PBST洗板4次，加入PBS，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。2 結(jié)果2. I重組質(zhì)粒pET-30a_p27的鑒定提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增所得片段大小約720bp，與預(yù)期大小相符(見圖1A)，將重組質(zhì)粒pET-30a-p27用BamH I和Sal I雙酶切鑒定，與預(yù)期的結(jié)果相符(見圖1B)。擴(kuò)增所得到p27基因全長717bp，編碼239個(gè)氨基酸殘基。2. 2p27基因的表達(dá)、重組蛋白純化及蛋白活性檢測(cè)將表達(dá)蛋白在非變性條件下純化獲得HIS-p27融合蛋白，獲得分子量約為34kD的重組P27蛋白(圖2A)，重組p27蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兔抗天然p27蛋白陽性血清進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果所表達(dá)的蛋白具有生物反應(yīng)活性(圖2B)。2. 3細(xì)胞融合率陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立細(xì)胞融合率為89. 4%，最終篩選出5株持續(xù)分泌抗ALV p27蛋白的MAb雜交瘤細(xì)胞株，編號(hào)分別是2E5、3H8、4B7、6D9和10G2。本發(fā)明從五株雜交瘤細(xì)胞株挑選出了一株特異性好且效價(jià)較高的分泌抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為雜交瘤細(xì)胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其微生物保藏號(hào)為=CGMCC No. 5961，保藏時(shí)間為2012年3月29日。2. 4單抗效價(jià)測(cè)定及亞類的測(cè)定用已建立的ELISA方法對(duì)五株單抗做效價(jià)測(cè)定的結(jié)果為2E5:27 ;3H8:21° ;4B7:29 ;6D9:27和10G2:28。免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒測(cè)定五株單抗的結(jié)果為2E5為IgG2b ;3H8、4B7、6D9 和 10G2 全部是 IgGl。2. 5單抗特異性鑒定IBV，MDV，AIV H5, AIV H7, AIV H9, I LTV, FPV，IBDV, NDV，ARV 和 REV 與五株單抗反應(yīng)的OD值均小于O. 15，且ALV-J，ALV-A, ALV-B與五株單抗反應(yīng)的OD值均大于I. 2。表明五株單抗有良好的特異性(圖3)。分析熒光顯微鏡觀察單抗2E5、3H8、4B7、6D9和10G2分別與ALV-J (HLJ09MDJ-1) ,ALV-A和ALV-B呈陽性反應(yīng)，有明顯的綠色熒光，且陰性對(duì)照無綠色熒光(圖4)。實(shí)施例2抗p27蛋白的多克隆抗體的制備I、多克隆抗體的制備選4只約2kg的健康雌性新西蘭大白兔，用PBS稀釋純化后的重組p27蛋白(按照實(shí)施例I所述的方法制備得到)，加入等體積CFA充分乳化后，按每只兔O. 5mg重組蛋白劑量皮下多點(diǎn)接種；以后每隔2周用等量IFA乳化，加強(qiáng)免疫2次，三免后7天耳緣靜脈采血O. 5ml，分離血清。2、間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)多抗免疫原性將DF-I細(xì)胞鋪于24孔板，每孔加入lOOulALV-A，ALV-B, ALV-J病毒，并設(shè)正常細(xì)胞為陰性對(duì)照，37°C溫箱繼續(xù)培養(yǎng)5d后，棄上清液，用無水乙醇固定細(xì)胞，三免后收集的血清用3% BSA做200倍稀釋作為一抗，室溫孵育Ih，PBST洗3遍，熒光二抗用3% BSA做200倍稀釋，避光反應(yīng)lh，PBST洗3遍，靜置5min。每孔加入少量PBS，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)多抗效價(jià)將純化的ALVp27抗原蛋白以4ug/ml濃度包被聚苯乙烯板，4°C過夜，然后每孔加入洗滌液(含 O. 05% Tween-20,0. 01mol/L pH 7. 4PBS,PBST)洗滌 3 次。加入封閉液(5%脫脂奶粉)，37°C孵育2h，甩干，洗板。加入倍比稀釋的三免后兔血清，對(duì)照組加入正常大白兔血清作為陰性對(duì)照，兔抗自然P27蛋白陽性血清作為陽性對(duì)照，37°C孵育lh，洗滌同前。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37°C孵育lh，洗板同上。加底物液TMB顯色。加入終止液(2mol/L硫酸)。于Bio-Rad酶標(biāo)儀450nm下測(cè)定光密度值(OD)。4、結(jié)果4. I間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，獲得的兔多抗能很好地與不同亞群的ALV病毒反應(yīng)產(chǎn)生 熒光，而陰性對(duì)照沒有熒光(見圖5)。2. 4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)多抗效價(jià)結(jié)果將獲得的抗原按4ug/ml稀釋進(jìn)行包被。進(jìn)行ELISA檢測(cè)后，結(jié)果見表1，在血清1 1000稀釋所得到的值約為I. 500，與陰性對(duì)照組相比較差異極顯著，且P/N值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2，因此可以鑒定為陽性，同時(shí)可以判斷血清具有很高的抗體效價(jià)(見表I)。表I多克隆抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.檢測(cè)禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于包括包被抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板； 所述的單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細(xì)胞株命名為雜交瘤細(xì)胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.5961。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的單克隆抗體的包被量為2μ g/ML。
3.如權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于還包括抗禽白血病病毒p27蛋白的多杭、酶標(biāo)抗兔ニ抗、封閉液以及稀釋液，所述的封閉液優(yōu)選為含有50g/L的脫脂奶粉的IOmMPH 7. 2的磷酸緩沖液；所述的稀釋液優(yōu)選為IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備檢測(cè)禽白血病群特異性抗原試劑中的應(yīng)用。
5.利用權(quán)利要求1-3所述的試劑盒檢測(cè)禽白血病病毒群特異性抗原的方法，其特征在于按照雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，具體的包括以下步驟 (1)包被抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板4°C過夜后用含O.5%吐溫20的磷酸緩沖液洗滌，37°C封閉液封閉4h，洗板； (2)加入待檢樣品，室溫孵育，洗板； (3)加入純化的多抗，室溫孵育，洗板； (4)加入酶標(biāo)抗兔ニ抗,室溫孵育,洗板； (5)加入TMB顯色液，室溫顯色，最后加2mol/L硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定0D450nm值。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的單克隆抗體的包被量為2μ g/ML,待檢樣品原倍，多抗的濃度為4 μ g/ML，酶標(biāo)抗兔ニ抗的稀釋度為I : 3000，待檢樣品、多抗、酶標(biāo)抗兔ニ抗及TMB的作用時(shí)間分別為lh，lh, Ih和20min，封閉液為含有50g/L的脫脂奶粉的IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液。
7.ー種分泌權(quán)利要求I所述的抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為雜交瘤細(xì)胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其微生物保藏號(hào)為CGMCC No. 5961。
8.由權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
9.權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測(cè)或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。
10.權(quán)利要求8所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒。所述試劑盒中包括由保藏編號(hào)為CGMCC No.5961的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體包被的酶標(biāo)板。本發(fā)明還公開了利用所述單克隆抗體建立的一種快速有效的檢測(cè)ALV的雙抗體夾心ELISA方法，其以原核表達(dá)的HLJ09MDJ-1p27蛋白制備的單克隆抗體作為包被抗體，p27蛋白制備的多抗作為檢測(cè)抗體。該方法對(duì)p27的最小檢出量為1.25ng/ml，且與禽類常見的病毒不反應(yīng)，特異性好。利用該方法檢測(cè)蛋清和肛拭子樣品，與PCR方法符合率分別為96.5％和88.9％。結(jié)果表明，該方法具有方便、快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，可用于ALV的檢測(cè)與種群凈化。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102636644SQ20121011367
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者王永強(qiáng), 王笑梅, 祁小樂, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龍 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所