專利名稱：多能性干細(xì)胞的非致瘤性增殖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于人類多能性干細(xì)胞的增殖，尤其是關(guān)于人類胚胎干(hES)細(xì)胞的非致瘤性增殖。
背景技術(shù)：
人類胚胎干(hES)細(xì)胞是多能性的，且其具有分化為成人大多數(shù)細(xì)胞種類的強(qiáng)大能力。因此，該細(xì)胞是再生醫(yī)學(xué)的強(qiáng)大保證。該hES細(xì)胞令人向往的特殊性質(zhì)包含不死性、多能性及無(wú)限制的未分化生長(zhǎng)。傳統(tǒng)上，在滋養(yǎng)層(feeder layer)細(xì)胞(如小鼠胚胎纖維母細(xì)胞(MEFs))上培養(yǎng)多能性胚胎干細(xì)胞，以將該細(xì)胞維持于未分化狀態(tài)。該滋養(yǎng)層對(duì)于維持該等細(xì)胞是必要的；且通常在該滋養(yǎng)層上培養(yǎng)hES細(xì)胞直到需要分化時(shí)為止。不幸地，該小鼠滋養(yǎng)層維持細(xì)胞經(jīng)常與hES細(xì)胞接觸而受到污染，雖對(duì)于小鼠滋養(yǎng)層維持細(xì)胞 不會(huì)造成多大功能上的影響，仍因此使小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)的hES細(xì)胞不適用于臨床。已有報(bào)告指出，無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)的人類多能性干(hPS)細(xì)胞會(huì)很快死亡，或者分化為定型細(xì)胞(committed cells)的異源性群體(heterogeneous population)。許多報(bào)告已證實(shí)，嘗試使用無(wú)細(xì)胞的成分或是至少避免非人類的成分或細(xì)胞，來(lái)取代該滋養(yǎng)層或維持細(xì)胞。該取代物無(wú)法展現(xiàn)長(zhǎng)期保證的結(jié)果，且這樣的嘗試已證實(shí)不足以維持細(xì)胞穩(wěn)固(robust)且繼續(xù)增殖(propagation)。再者,該取代方式還展現(xiàn),于無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)中，生長(zhǎng)于培養(yǎng)基取代物中的hES細(xì)胞的確在hES細(xì)胞群落周圍形成已分化細(xì)胞，這是沒(méi)有實(shí)現(xiàn)最理想情況的標(biāo)志。因此，需要開(kāi)發(fā)使用不造成污染及形成畸胎瘤(teratomas)的另一種滋養(yǎng)層細(xì)胞源來(lái)培養(yǎng)hES細(xì)胞的替代方案。

發(fā)明內(nèi)容
一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種人類多能性干細(xì)胞的增殖方法，共同培養(yǎng)人類多能性干細(xì)胞與臍帶衍生干細(xì)胞。該臍帶衍生干細(xì)胞于培養(yǎng)基中形成滋養(yǎng)層，用于增殖該人類多能性干細(xì)胞，且將該人類多能性干細(xì)胞維持于未分化狀態(tài)。一實(shí)施方式中，該人類多能性干細(xì)胞的增殖為非致瘤性增殖，使得該人類多能性干細(xì)胞不會(huì)形成畸胎瘤。另一實(shí)施方式中，該人類臍帶衍生干細(xì)胞對(duì)于⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、CD166 及 HLA-ABC 為陽(yáng)性，但對(duì)于 CDlq、CD3、CD34、CD45、CD56、CD117 及 HLA-DR 為陰性。該人類臍帶衍生干細(xì)胞具有成骨(osteogenic)或成脂(adipogenic)細(xì)胞分化能力。另一實(shí)施方式中，該臍帶衍生干細(xì)胞為人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs)，且衍生自人類臍帶的華頓氏膠(Wharton’ s jelly)。另一實(shí)施方式中，該人類多能性干細(xì)胞對(duì)于堿性磷酸酶(AP)、Oct-4、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG, S0X2、NF-200、短尾突變型(brachyury)、ATBFl 或 MAP2 為陽(yáng)性，且表達(dá)⑶F9、GATA4、HANDl或TUJ-I基因。又，于該人類多能性干細(xì)胞中MYC被降低調(diào)控。另一實(shí)施方式中，該人類多能性干細(xì)胞為人類胚胎干(hES)細(xì)胞，并形成類胚胎體(embryoid bodies)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于增殖人類多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基包含在培養(yǎng)基中形成滋養(yǎng)層的臍帶衍生干細(xì)胞。一實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中的該臍帶衍生干細(xì)胞為人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于增殖人類多能性干細(xì)胞的試劑盒，其中，該試劑盒包括包含臍帶衍生干細(xì)胞的培養(yǎng)基，及其使用說(shuō)明書。在一實(shí)施方式中，該試劑盒的培養(yǎng)基中的該臍帶衍生干細(xì)胞為人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs)。



圖I顯示HUCMSC的形態(tài)、免疫表型(immunotyping)及體外分化。生長(zhǎng)自組織培養(yǎng)物的華頓氏膠細(xì)胞為類纖維母細(xì)胞，且具有紡錘狀型態(tài)(圖1A)。流式細(xì)胞儀快速地區(qū)分HUCMSCs，顯示其對(duì)于 CDlq、CD3、CD34、CD45、CD56、CDl 17 及 HLA-DR 為陰性，而對(duì)于 CD10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、CD 166及HLA-ABC為陽(yáng)性(圖1B)。待成脂細(xì)胞分化后，該細(xì)胞形成中性脂肪空泡，并含有復(fù)數(shù)對(duì)于油紅染料為陽(yáng)性的脂肪小滴(圖1C，上)。于成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中，該細(xì)胞延展而形成礦化基質(zhì)，該礦化基質(zhì)于三至四周的培養(yǎng)(cultivation)后被茜紅染料顯著染色(圖1C，下)。通過(guò)RT-PCR分析(以GAPDH作為陽(yáng)性控制組)顯示對(duì)于成脂(PPARy)及成骨(骨橋蛋白，osteopontin)細(xì)胞分化具有專一性的基因表達(dá)(圖1D)。圖IA左的比例尺表示lOOOiim，而圖IA及圖IC右的比例尺表示100 y m。圖2顯示生長(zhǎng)于HUCMC及MEF滋養(yǎng)層上的未分化人類ES細(xì)胞群落的形態(tài)。生長(zhǎng)于HUCMC上的hES群落圖(圖2A)及生長(zhǎng)于MEF上的hES群落圖(圖2B)。生長(zhǎng)于HUCMC上的群落放大圖顯示典型的hES細(xì)胞形態(tài)具有高核質(zhì)比(圖2C及圖2D)。圖2A及圖2B的比例尺表示lOOOiim，而圖2C及圖2D的比例尺表示100 y m。圖3顯示生長(zhǎng)于HUCMC上的人類ES細(xì)胞表現(xiàn)型(phenotype)。使用專一性抗體的該hES群落的免疫染色(immnostaining)顯示堿性磷酸酶(圖3A)、Oct-4(圖3B)、SSEA-4 (圖3C)、TRA-l-60 (圖3D)、及TRA-1-81 (圖3E)的高度表達(dá)。于HUCMC上持續(xù)培養(yǎng)并繼代20次后，在ES細(xì)胞中觀察到代表性的正常染色體組型(46，XX)(圖3F)。比例尺表示 1000 Ii m。圖4顯示衍生自hES的類胚胎體(FB)的螢光免疫染色。相位差顯微鏡下顯示的類胚胎體(圖4A)，及使用NF-200抗體(圖4B)、短尾突變型抗體(圖4C) ,ATBFl (圖4D)、及MAP2 (圖4E)的免疫染色。比例尺表示1000 u m。圖5顯示不同滋養(yǎng)層上hES細(xì)胞的不同分化標(biāo)記的表達(dá)。圖5A為通過(guò)RT-PCR手段說(shuō)明對(duì)于生殖細(xì)胞(GDF9)、內(nèi)胚層(GATA4)、中胚層(HANDl)及外胚層(TUJ-I)有專一性的基因表達(dá)。GAPDH作為控制組。圖5B說(shuō)明圖5A所顯示的基因表達(dá)的半定量分析。圖6顯示當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞由HUCMSC變?yōu)镸EF的發(fā)展自hES細(xì)胞的畸胎瘤。圖6A顯示待NOD-SCID小鼠上的滋養(yǎng)層由HUCMSC變?yōu)镸EF后，畸胎瘤(箭頭指示)快速發(fā)展自hES細(xì)胞。組織切片顯示黑色素細(xì)胞(melanocyte)的帶狀物,其具有似視網(wǎng)膜(retina-like)結(jié)構(gòu)(圖6B)、似神經(jīng)管(neurotube-1 ike)結(jié)構(gòu)(圖6C-圖6E)、生牙上皮(odontogenicepithelium)(圖6F)、神經(jīng)上皮(圖6G)、未成熟的軟骨(圖6H)及未成熟的鱗狀上皮(squamoid epithelium)(圖 61)。比例尺表不 100 U m。圖7顯示培養(yǎng)于HUCMSC及MEF上的hES細(xì)胞的多能性基因表達(dá)。圖7A說(shuō)明培養(yǎng)于 HUCMSC(WJ)及 MEF 上的 hES 細(xì)胞(ES)的 0CT4、NANOG, S0X2 及 MYC 的 RT-PCR 分析，并以GAPDH作為內(nèi)部控制組。圖7B說(shuō)明圖7A所顯示的基因表達(dá)的半定量分析。圖7C說(shuō)明通過(guò)西方點(diǎn)墨法分析測(cè)量C-MYC蛋白質(zhì)。圖7D說(shuō)明通過(guò)RT-PCR測(cè)量的MYC的mRNA等級(jí)，以該內(nèi)部控制組的倍數(shù)顯示。FB表示類胚胎體。
具體實(shí)施例方式本文所提供的多種具體細(xì)節(jié)用以更詳細(xì)了解本發(fā)明。實(shí)施例該基因與其它分化標(biāo)記基因的RT-PCR及定量RT-PCR 機(jī)械性地移除并以RLT裂解溶液(lysis buffer) (Qiagen)處理培養(yǎng)于HUCMSCs或MEF滋養(yǎng)層上的未分化或已分化的hES細(xì)胞。依照制造商說(shuō)明書使用SuperScript IIIOne-Step RT-PCR試劑盒(invitrogen)合成第一條cDNA。表I顯示每對(duì)引物的序列、粘合溫度及產(chǎn)物大小。所有的PCR樣本通過(guò)含有0. 5 u g/ml溴化乙啶(Sigma)的2%瓊脂膠電泳分析。關(guān)于定量 RT-PCR(qRT-PCR),是在 ABIStepOne Plus 系統(tǒng)(Applied Biosystems)中使用 FastStart universal SYBR green master (ROX, Roche,USA)基因表達(dá)試驗(yàn)，以 GAPDH作為內(nèi)部控制組。引物的序列及粘合溫度顯示于表I。表I
權(quán)利要求
1.一種增殖人類多能性干細(xì)胞的方法，包括共同培養(yǎng)該人類多能性干細(xì)胞及臍帶衍生干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該臍帶衍生干細(xì)胞在培養(yǎng)基中形成滋養(yǎng)層，以增殖該人類多能性干細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該臍帶衍生干細(xì)胞為人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞衍生自人類臍帶的華頓氏膠。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細(xì)胞用以將該人類多能性干細(xì)胞維持于未分化狀態(tài)。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細(xì)胞對(duì)于CD10、CD13、 CD29、CD44、CD73、CD90、CD166 及 HLA-ABC 的一種或多種為陽(yáng)性。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細(xì)胞對(duì)于CDlq、CD3、⑶34、⑶45、⑶56、⑶117及HLA-DR的一種或多種為陰性。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細(xì)胞具有成骨細(xì)胞分化能力或成脂細(xì)胞分化能力。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細(xì)胞為人類胚胎干細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細(xì)胞對(duì)于堿性磷酸酶、Oct-4、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG、S0X2及分化標(biāo)記的一種或多種為陽(yáng)性，且其特征在于，該分化標(biāo)記為NF-200、短尾突變型、ATBFl及MAP2的一種或多種。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細(xì)胞表達(dá)一種或多種分化基因，且其特征在于，該分化基因?yàn)棰荈9、GATA4、HANDl或TUJ-I基因。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在該人類多能性干細(xì)胞中，MYC被降低調(diào)控。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細(xì)胞的增殖無(wú)致瘤增殖性。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細(xì)胞的增殖不會(huì)形成畸胎瘤。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細(xì)胞形成類胚胎體。
16.一種用于增殖人類多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括臍帶衍生干細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該臍帶衍生干細(xì)胞在該培養(yǎng)基中形成滋養(yǎng)層。
18.如權(quán)利要求16所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該臍帶衍生干細(xì)胞為人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞。
19.一種用于增殖人類胚胎干細(xì)胞的試劑盒，包括包含臍帶衍生干細(xì)胞的培養(yǎng)基，及其使用說(shuō)明書。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其特征在于，該臍帶衍生干細(xì)胞為人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在包含人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs)的培養(yǎng)基中增殖人類胚胎干(hES)細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)基作為滋養(yǎng)層。在培養(yǎng)基中，該人類胚胎干(hES)細(xì)胞維持胚胎干細(xì)胞的特性，如多能性、無(wú)限制的未分化增殖及正常的染色體組型。本發(fā)明還提供一種該人類胚胎干(hES)細(xì)胞的非致瘤性增殖方法，且該方法不會(huì)形成畸胎瘤。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102747032SQ20121011698
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者丁大清, 朱堂元 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人佛教慈濟(jì)綜合醫(yī)院