專利名稱：解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種熒光定量檢測方法，具體涉及ー種解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法。
背景技術：
脲原體(Ureaplasma)是從人體中分離的能自身繁埴的13種支原體之一,屬硬壁菌門柔膜體綱支原體目支原體科脲原體屬。脲原體介于病毒和細菌之間，是在人工培養(yǎng)基上能繁殖的最小的原核細胞型微生物，無細胞壁，能自我復制，呈球桿狀，大小為125 250nm,分子量為4. 5X IO8,具高度多形性。脲原體根據(jù)分子生物學特征分為兩個生物群和14個血清型，兩個生物群包括微小脲原體(Ureaplasmaparvum, Up)和解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum, Uu), 14個血清型中，基因組較小的血清型1、3、6、14屬于微小脲原體，占脲原體感染的90% 92% ;基因組較大的血清型2、4、5、8 13屬于解脲脲原體，占脲原體感染的8% 10%。脲原體兩個生物型在人群中的分布及致病性存在差異，常用的脲原體血清學分型方法操作比較繁瑣，易出現(xiàn)交叉反應，結果難以準確判斷。因此，為了克服現(xiàn)有技術的缺點和不足，本發(fā)明提供ー種操作簡便、檢測效率高的基因定量分析方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法，利用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術，可同時對標本中的解脲脲原體和微小脲原體兩種基因進行鑒別與定量分析，獲得更為準備的 實驗結果，該方法對樣品需求量少，操作簡便，檢測效率高。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)—種解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法，該方法包括以下步驟步驟ー，樣本處理和DNA提??；步驟ニ，將與解脲脲原體的拓撲異構酶IV DNA互補的寡核苷酸序列作為PCR反應中的正向引物、反向引物和熒光標記探針加入ー個PCR擴增管中；步驟三，將與微小脲原體的拓撲異構酶IV DNA互補的寡核苷酸序列作為PCR反應中的正向引物、反向引物和熒光標記探針加入另ー個PCR擴增管中；步驟四，在相同的擴增條件下，同時分別擴增上述兩個擴增管中所述解脲脲原體和所述微小脲原體的DNA靶序列；步驟五，檢測所述反應體系中不同熒光信號的變化，通過標準曲線來判斷待測樣品中是否含有解脲脲原體、微小脲原體或混合感染，并確定其相應含量。優(yōu)選的，在所述步驟一中，所述樣本處理和DNA提取的具體過程包括將標本管置于振蕩器上振蕩，自管壁擠干棉試子，吸取全部液體轉至潔凈的離心管中，12000rpm/min離心10分鐘，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37°C保溫60min，沸水浴保溫5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE緩沖液。優(yōu)選的，在所述步驟ニ中，所述正向引物與所述解脲脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列上游位點雜交；所述反向引物與所述解脲脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列下游位點雜交；所述熒光標記探針與所述解脲脲原體的拓撲異構酶IV基因對應靶序列雜交。優(yōu)選的，在所述步驟ニ中，所述熒光標記探針的序列選自SEQ ID No. 4所示的序列或其互補序列，或由該序列或其互補序列衍生出的差別不大于3個堿基的核苷酸序列。優(yōu)選的，在所述步驟三中，所述正向引物與所述微小脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列上游位點雜交；所述反向引物與所述微小脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列下游位點雜交；所述熒光標記探針與所述微小脲原體的拓撲異構酶IV基因對應靶序列雜交。優(yōu)選的，在所述步驟三中，所述熒光標記探針的序列選自SEQ ID No. 8所示的序列或其互補序列，或由該序列或其互補序列衍生出的差別不大于3個堿基的核苷酸序列。優(yōu)選的,所述突光標記探針為TaqMan探針,所述探針5'端標記有突光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團。進ー步優(yōu)選的，所述熒光報告基團選自FAM、TAT、J0E、R0X、VIC、TAMRA, CY3或CY5，所述熒光淬滅基團選自TAMRA、DABCYL或NFQ。本發(fā)明的有益效果如下一般熒光定量PCR僅檢測脲原體，而沒有對它們進行分群鑒定。本發(fā)明通過對脲原體的拓撲異構酶IV A亞單位編碼基因(ParC)進行比對，發(fā)現(xiàn)解脲脲原體中ParC的部分序列在其10個血清型之間同源性為100 %，但是與微小脲原體的ParC基因序列同源性僅87% ;同樣微小脲原體的ParC基因中部分序列在其4個血清型之間同源性為100 %，但與 解脲脲原體序列同源性僅87 %。本發(fā)明根據(jù)解脲脲原體ParC和微小脲原體ParC的該部分序 列 分別合成ー對引物和熒光標記探針，分別置于兩個不同的PCR擴增管中，在相同的擴增條件下(包括變性、退火、延伸和循環(huán)擴増)對解脲脲原體和微小脲原體分別進行熒光定量PCR擴增。經對比試驗和測序分析，該熒光定量PCR檢測方法的解脲脲原體擴增和微小脲原體擴增是分開進行的，解脲脲原體和微小脲原體之間無交叉擴增，而且與其它陰道常見病原菌也無交叉擴增，因此具有良好的特異性。經與脲原體培養(yǎng)進行比較，本發(fā)明的檢測敏感性高于培養(yǎng)法。本發(fā)明操作簡便，檢測效率高，能夠獲得準備的實驗結果。


圖1為用解脲脲原體特異性引物和探針擴增的曲線圖。圖2為用微小脲原體特異性引物和探針擴增的曲線圖。圖3為解脲脲原體陽性質控品和陰性質控品的PCR產物電泳圖。圖4為微小脲原體陽性質控品和陰性質控品的PCR產物電泳圖。圖5為陰性質控品和其它陰道常見病原菌的PCR產物電泳圖。圖6為解脲脲原體標準品的擴增曲線圖。圖7為微小脲原體標準品的擴增曲線圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克隆實驗室手冊■ (New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例熒光定量檢測解脲脲原體和微小脲原體步驟一，引物和探針的設計與合成引物和探針的序列如序列表所示，引物和探針在對應核苷酸序列表中的位置與擴增產物的長度如表I所不。引物與探針用設計軟件設計后合成，引物和探針均為PAGE級純化。其中微小脲原體探針的5'端標記報告基團FAM，3'端標記淬滅基團TAMRA;解脲脲原體探針的5'端標記報告基團R0X，3'端標記淬滅基團TAMRA。表I
權利要求
1.一種解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 步驟一，樣本處理和DNA提??； 步驟ニ，將與解脲脲原體的拓撲異構酶IV DNA互補的寡核苷酸序列作為PCR反應中的正向引物、反向引物和熒光標記探針加入ー個PCR擴增管中； 步驟三，將與微小脲原體的拓撲異構酶IV DNA互補的寡核苷酸序列作為PCR反應中的正向引物、反向引物和熒光標記探針加入另ー個PCR擴增管中； 步驟四，在相同的擴增條件下，同時分別擴增上述兩個擴增管中所述解脲脲原體和所述微小脲原體的DNA靶序列； 步驟五，檢測所述反應體系中不同熒光信號的變化，通過標準曲線來判斷待測樣品中是否含有解脲脲原體、微小脲原體或混合感染，并確定其相應含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述樣本處理和DNA提取的具體過程包括將標本管置于振蕩器上振蕩，自管壁擠干棉試子，吸取全部液體轉至潔凈的離心管中，12000rpm/min離心10分鐘，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37°C保溫60min，沸水浴保溫5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE緩沖液。
3.根據(jù)權利要求1所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟ニ中，所述正向引物與所述解脲脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列上游位點雜交；所述反向引物與所述解脲脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列下游位點雜交；所述熒光標記探針與所述解脲脲原體的拓撲異構酶IV基因對應靶序列雜交。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟ニ中，所述熒光標記探針的序列選自SEQ ID No. 4所示的序列或其互補序列，或由該序列或其互補序列衍生出的差別不大于3個堿基的核苷酸序列。
5.根據(jù)權利要求1所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述正向引物與所述微小脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列上游位點雜交；所述反向引物與所述微小脲原體的拓撲異構酶IV基因對應的靶序列下游位點雜交；所述熒光標記探針與所述微小脲原體的拓撲異構酶IV基因對應靶序列雜交。
6.根據(jù)權利要求1、2或5所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述熒光標記探針的序列選自SEQ ID No. 8所示的序列或其互補序列，或由該序列或其互補序列衍生出的差別不大于3個堿基的核苷酸序列。
7.根據(jù)權利要求1、2、3或5所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，所述熒光標記探針為TaqMan探針,所述探針5'端標記有突光報告基團,3'端標記有突光淬滅基團。
8.根據(jù)權利要求7所述的熒光定量檢測方法，其特征在干，所述熒光報告基團選自FAM、TAT、JOE、ROX、VIC、TAMRA, CY3 或 CY5。
9.根據(jù)權利要求7所述的熒光定量檢測方法，其特征在干，所述熒光淬滅基團選自TAMRA、DABCYL 或 NFQ。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法，該方法包括樣品處理和DNA提??；將與解脲脲原體和微小脲原體拓撲異構酶IV DNA互補的寡核苷酸序列作為PCR反應中的正向引物、反向引物和熒光標記探針分別加入兩個不同的PCR擴增管中，利用相同的擴增條件同時分別擴增上述兩個擴增管中的解脲脲原體和微小脲原體的DNA靶序列；根據(jù)檢測反應體系中不同熒光信號的變化，通過標準曲線來判斷待測樣品中是否含有解脲脲原體、微小脲原體，并確定其相應含量。對于解脲脲原體和微小脲原體的鑒定和定量分析，本發(fā)明提供的方法具有快速、靈敏、特異性高和成本低的特點。
文檔編號C12Q1/68GK103045721SQ201210124339
公開日2013年4月17日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權日2011年9月23日
發(fā)明者趙縝, 劉璐, 平亞芬 申請人:上海國興醫(yī)療器械有限公司