專利名稱：一種通過cd226基因檢測胃癌易感性的試劑盒及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，具體地說是一種通過⑶226基因檢測胃癌易感性的試劑盒及其用途，其通過檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4(CD226)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點來預測胃癌的易感性，屬于醫(yī)療研究技術領域。
背景技術：
胃癌發(fā)病率居消化道腫瘤的首位，列全部惡性腫瘤的第三位。我國每年死于胃癌者約為16萬人。癌癥的發(fā)生是一個多因素、多階段、多基因變異的過程。腫瘤細胞和機體免疫系統(tǒng)的相互作用一直貫穿于整個過程中。作為調(diào)節(jié)T細胞和NK細胞功能的關鍵分子，CD226參與了對機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的調(diào)控。大量的研究表明，腫瘤免疫調(diào)控相關基因的單核苷酸多態(tài)可以通過改變這些基因的表達水平的方式，影響這些基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。SNP(Single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性,是人類基因組作圖的第三代遺傳標記，主要是指一類基于單堿基變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組最廣泛存在的一類多態(tài)性標記，已成為研究基因組多態(tài)性和識別、定位疾病相關的一種工具。1996年成功研制了 SNP檢測的實時熒光定量PCR技術，實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，還實現(xiàn)了判斷結果的自動性?？衫脽晒舛縋CR技術研發(fā)檢測疾病易感性的試劑盒。⑶226是由Shibuya等人于1996克隆成功的，并在2000年第七屆人類白細胞分化抗原協(xié)作組大會上獲得了⑶226的編號。人⑶226基因定位于染色體18q22_23上，成熟的蛋白由318個氨基酸組成。該分子為一個67kD大小的I型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，胞膜外區(qū)由232個氨基酸組成，含有2個V樣結構域；胞漿區(qū)有61個氨基酸，胞漿區(qū)尾部含有一段EIYVNY基序，可作為非受體型蛋白酪氨酸激酶的底物，并可以和蛋白酪氨酸激酶2氨基端的SH2結構域結合。另外，在CD226胞漿區(qū)還存在著酪氨酸激酶II和PKC作用的底物S/T結構。⑶226主要表達于活化的T細胞、NK細胞、巨核/血小板譜系以及活化的血管內(nèi)皮細胞。結合胞漿的上述結構和基序，提示CD226分子可能參與T細胞、NK和血小板活化的信號轉導過程。將⑶226特異性單抗Leo-AlmAb或其F(ab’)2片段加入MCL或T細胞培養(yǎng)體系中能抑制T細胞向細胞毒T細胞分化，且只能在MLC初期發(fā)揮作用。在殺傷階段，針對CD226另一功能表位的特異性單抗DXllmAb能在殺傷相抑制CTL對多種腫瘤細胞的殺傷。此外，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CD226集中分布與T細胞與APC或靶細胞的接觸面，目前所發(fā)現(xiàn)的能與CD226發(fā)生相互作用的分子都是與細胞骨架結構及免疫突觸形成有關的分子，這些都提示⑶226參與了 T細胞免疫突觸的形成。而且研究還發(fā)現(xiàn)，⑶226是一種NK細胞活化性膜受體，主要表達于活化的NK細胞。在重導向殺傷系統(tǒng)中，加入LeoAI-mAb,能明顯提高NK細胞對靶細胞的殺傷率。rs57613010是位于第18號染色體⑶226基因啟動子區(qū)域的一個T > G多態(tài)。其在世界人群的頻率分布，T占0.62，G占0.38左右。中國人群的分布T占0. 45，G占0. 25左右。分子生物學研究表明，T > G的替代可增加CD226基因啟動子與核蛋白的結合，增加⑶226基因的表達。通過大規(guī)模人群的胃 癌病例對照研究，⑶226基因啟動子區(qū)域的T > G多態(tài)與胃癌發(fā)生相關，并且呈基因劑量-反應關系。即使在調(diào)整年齡、性別、吸煙、腫瘤家族史等多種混雜因素后，這種相關性仍然存在。發(fā)明人的研究還顯示rs57613010與散發(fā)性腸癌及鼻咽癌的發(fā)生相關，均表現(xiàn)為rs57613010基因型為G時腫瘤發(fā)生率降低。這個SNP的多態(tài)可用于評估個體胃癌的易感性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的上述不足，提供一種通過⑶226基因檢測胃癌易感性的試劑盒及其用途，其通過檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4(CD226)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點來預測胃癌的易感性。按照本發(fā)明提供的技術方案一種通過⑶226基因檢測胃癌易感性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內(nèi)的物質(zhì)，其特征在于所述盒體內(nèi)的物質(zhì)包括檢測CD226基因上的rs57613010號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為正義引物5，-AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG-3，，反義引物5’-CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC-3’ ；所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為野生型探針5，-CCATGCATGAGTACATA-3，，突變型探針5，-CCATGCATCAGTACATA-3，。作為本發(fā)明的進一步改進，所述盒體中各物質(zhì)的含量為濃度為IOiiM的特異性引物共0. 45 iil，其中正義引物和反義引物各0. 225 u I ;濃度為5 ii M的特異性熒光探針共0. 2iU，其中野生型探針和突變型探針各0. Iiil ;濃度為5單位/iil的Taq DNA聚合酶0. 02 ill ;濃度為20mM的dNTP混合液0. I ;濃度為25mM的MgCl2溶液0. 5 yl ;5X熒光定量PCR反應緩沖液2 u I ;去離子水4. 73 ill。作為本發(fā)明的進一步改進，所述特異性引物中，正義引物的Tm值為60°C，反義引物的Tm值為58°C ;所述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為66°C，突變型探針的Tm值為67V。作為本發(fā)明的進一步改進，所述試劑盒的保存溫度為-20°C。一種通過⑶226基因檢測胃癌易感性的試劑盒的用途，其物征在于所述試劑盒用于檢測DNA的CD226基因上的rs57613010號SNP位點的基因型。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，優(yōu)點在于本發(fā)明的試劑盒用于檢測DNA的CD226基因上的rs57613010號SNP位點的基因型，試劑盒盒體中的特異性引物是針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對CD226基因上的rs57613010號SNP位點的DNA引物；試劑盒盒體中的特異性熒光探針是針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點的DNA探針；本發(fā)明既適用于檢測個體胃癌的易感性，又適用于對乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌的預后檢測，更可廣泛應用于醫(yī)療研究。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明本發(fā)明所述的通過CD226基因檢測胃癌易感性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內(nèi)的物質(zhì)，所述物質(zhì)包括檢測CD226基因上的rs57613010號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。所述試劑盒的保存溫度為_20°C。所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為正義引物5’-AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG-3’，反義引物5’-CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC-3’(序列表SEQ ID NO :2所示)；所述特異性引物是針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點的DNA引物；其中正義引物的Tm值為60°C，反義引物的Tm值為58。。。所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為野生型探針5’ -CCATGCATGAGTACATA-3’ (序列表SEQ ID NO 3所示)，突變型探針5’-CCATGCATCAGTACATA-3’(序列表SEQ ID NO :4所示)；所述特異性熒光探針是針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點的DNA探針；其中野生型探針的Tm值為66°C，突變型探針的Tm值為 67V。所述Taq DNA聚合酶、dNTP (脫氧核糖核苷三磷酸)混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水，均采用外購的常規(guī)標注產(chǎn)品，本發(fā)明實施例中，上述藥品及試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。本發(fā)明中，所述盒體(供一人份使用)中各物質(zhì)的含量如下濃度為IOyM的特異性引物共0. 45 iil，其中正義引物和反義引物各0. 225 u I ;濃度為5 ii M的特異性熒光探針共0. 2iU，其中野生型探針和突變型探針各0. Iiil ;濃度為5單位/iil的Taq DNA聚合酶0. 02 ill ;濃度為20mM的dNTP混合液0. I ;濃度為25mM的MgCl2溶液0. 5 yl ;5X熒光定量PCR反應緩沖液2 u I ;去離子水4. 73 ill。本發(fā)明中所述的特異性引物是針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點的DNA引物；所述特異性引物的設計與合成均采用常規(guī)的技術，可以理解的是，本發(fā)明的保護范圍并不限于序列表SEQ ID NO :1和2所示的引物。對于本領域的普通技術人員來說，利用本發(fā)明所給予的技術啟示設計出來的所有可用于熒光定量PCR檢測⑶226基因上的rs57613010號SNP位點的引物均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明所述的特異性熒光探針是針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶226基因上的rs57613010號SNP位點的DNA探針。所述特異性熒光探針的設計與合成均采用常規(guī)的技術，可以理解的是，本發(fā)明的保護范圍并不限于序列表SEQ ID NO :3和4所示的熒光探針。對于本領域的普通技術人員來說，利用本發(fā)明所給予的技術啟示設計出來的所有可用于熒光定量PCR檢測CD226基因上的rs57613010號SNP位點的熒光探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。試劑盒使用說明步驟I :DNA模板的提取用硅膠吸附法提取血液標本的基因組DNA ；步驟2 熒光定量PCR反應熒光定量PCR反應體系總體積為10 ill，包括濃度為20ng/ U I的DNA模板2 yl、濃度為IOuM的特異性引物共0. 45 iil，其中正義引物和反義引物各0. 225 u I ;濃度為5 u M的特異性熒光探針共0. 2 u I，其中野生型探針和突變型探針各0. I ;濃度為5單位
/ 的Taq DNA聚合酶0. 02 ;濃度為20mM的dNTP混合液0. I ;濃度為25mM的MgCl2溶液0. 5 ill ;5X熒光定量PCR反應緩沖液2 u I ;去離子水4. 73 ill。在ABI 7900HT型熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為50°C下2min，95°C下lOmin，再進行40 55個PCR循環(huán)(92°C下15s，60°C下Imin)，反應結束后在ABI 7900HT型熒光定量PCR儀讀取熒光量。步驟3 :基因型分析及確定基因型米用ABI 7900HT 型突光定量 PCR 儀自帶軟件 SDS (Sequence DetectionSystems)V2. 3判讀基因型，自動分析結果。被檢測DNA的⑶226基因上的rs57613010號SNP位點攜帶有T時，為胃癌易感型。本發(fā)明可以指導人們主動預防胃癌，先對被檢測者進行服務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習慣問卷表。常規(guī)方法抽取被檢測者EDTA抗凝血5ml。用硅膠吸附法提取血液標本的基因組DNA。再使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的⑶226基因上的rs57613010號SNP位點進行熒光定量PCR檢測，確定該位點的基因型。最后通過對被檢測者基因型的分析，出具基因分型檢測報告和對被檢測者個體化健康指導報告?；蚍中蜋z測報告詳細說明了被檢測者胃癌易感程度的高低以及患病概率大小。個體化健康指導報告以被檢測者的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問卷調(diào)查結果，評估被檢測這胃癌遺傳易感的相對風險。同時制定出針對被檢測者的個性化健康行動方案，包括在飲食習慣、生活方式生活的改進建議等，并為被檢測者普及預防胃癌的健康知識。序列表〈110〉無錫市第二人民醫(yī)院〈120〉一種通過⑶226基因檢測胃癌易感性的試劑盒及其用途<160>4<210>SEQ ID NO 1〈211 >31<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉正義引物〈400〉Iaactagtatc taaggtagac cttgggtagt g 31<210>SEQ ID NO 2
<211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉正義引物
<400>2ccttctctcg cagaccaaag ac22<210>SEQ ID NO 3〈211〉17<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉野生型探針<400>3ccatgcatga gtacata17<210>SEQ ID NO 4〈211〉17<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉突變型探針<400>4ccatgcatca gtacata 1權利要求
1.一種通過CD226基因檢測胃癌易感性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內(nèi)的物質(zhì)，其特征在于所述盒體內(nèi)的物質(zhì)包括檢測⑶226基因上的rs57613010號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水； 所述特異性引物中的正義引物和反義弓I物的序列為 正義引物5’ - AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG -3’， 反義引物5’ - CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC -3’ ； 所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為 野生型探針5’ - CCATGCATGAGTACATA -3’， 突變型探針5’ - CCATGCATCAGTACATA -3’。
2.如權利要求I所述的通過CD226基因檢測胃癌易感性的試劑盒，其特征在于所述盒體中各物質(zhì)的含量為濃度為10 μ M的特異性引物共O. 45 μ 1，其中正義引物和反義引物各O. 225 μ I ;濃度為5μ M的特異性熒光探針共O. 2 μ 1，其中野生型探針和突變型探針各O. I μ I ;濃度為5單位/ μ I的Taq DNA聚合酶O. 02 μ I ;濃度為20mM的dNTP混合液O.1μ I ;濃度為25mM的MgCl2溶液O. 5μ I ;5Χ熒光定量PCR反應緩沖液2 μ I ;去離子水4.73 μ I。
3.如權利要求I所述的通過CD226基因檢測胃癌易感性的試劑盒，其特征在于所述特異性引物中，正義引物的Tm值為60 °C，反義引物的Tm值為58 °C;所述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為66 °C，突變型探針的Tm值為67 °C。
4.如權利要求I所述的通過CD226基因檢測胃癌易感性的試劑盒，其特征在于所述試劑盒的保存溫度為_20°C。
5.一種通過CD226基因檢測胃癌易感性的試劑盒的用途，其物征在于所述試劑盒用于檢測DNA的CD226基因上的rs57613010號SNP位點的基因型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過CD226基因檢測胃癌易感性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內(nèi)的物質(zhì)，其特征在于所述盒體內(nèi)的物質(zhì)包括檢測CD226基因上的rs57613010號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。本發(fā)明的試劑盒用于檢測DNA的CD226基因上的rs57613010號SNP位點的基因型，既適用于檢測個體胃癌的易感性，又適用于對乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌的預后檢測，更可廣泛應用于醫(yī)療研究。
文檔編號C12Q1/68GK102660643SQ201210124430
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權日2012年4月25日
發(fā)明者呂國強, 周萍, 張淳, 李建平, 李成萬 申請人:無錫市第三人民醫(yī)院