專利名稱：人工合成Bt抗蟲基因Cry1F-t及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和生物防治領(lǐng)域，具體涉及ー種人工合成Bt抗蟲基因Cry IF-1及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Bt基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringHansis),為革蘭氏陽性土壌桿菌。它在芽孢形成過程中產(chǎn)生稱為S-內(nèi)毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白(控制合成這種蛋白質(zhì)的基因在質(zhì)粒上)，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。其作用原理為這種抗蟲蛋白能被堿性腸液溶解，水解為更小的活性毒素片段-核心片段(Hofte and ffhiteley,1989)。活性片段能抗蛋白酶的進(jìn)一歩水解，被激活的蛋白質(zhì)結(jié)合在昆蟲腸道上的刷狀小泡上，引起穿孔從而影響滲透平衡，細(xì)胞膨脹并溶解，靶標(biāo)生物停止取食并最后死亡。研 究表明許多Bt蛋白，靶標(biāo)害蟲的腸道上皮細(xì)胞都具有高親和性的結(jié)合位點(diǎn)(Hofte andffhiteley, 1989)在過去的幾十年里，已確定數(shù)十種蘇云金芽孢桿菌菌系及130多種它們編碼的殺蟲晶體蛋白。研究證明，Bt晶體蛋白對(duì)人體、哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類以及很多有益昆蟲均無毒害作用，不污染環(huán)境，所以Bt制劑已作為ー種無公害的天然微生物殺蟲劑在農(nóng)業(yè)、林業(yè)及環(huán)境衛(wèi)生等方面應(yīng)用了近50年。Bt晶體蛋白質(zhì)必須被昆蟲取食到才能發(fā)揮殺蟲功能，但自然環(huán)境下Bt晶體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差，殺蟲效果受天氣影響大，太陽照后則易降解，也不能滲透到植物組織內(nèi)部，易被雨水、露水沖刷掉，這些因素極大的限制了其發(fā)展應(yīng)用。1987年，比利時(shí)Vaeck等人首次獲得轉(zhuǎn)Bt殺蟲蛋白抗蟲煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草只能檢測(cè)到微弱的抗蟲性，其表達(dá)蛋白幾乎檢測(cè)不到，只占可溶性蛋白的O. 001%。在我國，1992年，郭三堆等人采用植物優(yōu)化密碼子方法首先在國內(nèi)人工合成全長1824bp的GFMCrylA殺蟲基因，獲得了中國第一代單價(jià)抗蟲棉；丁群星等(1993)和王國英等(1995)分別用子房注射法和基因槍法將PB48. 415質(zhì)粒轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織中獲得轉(zhuǎn)基因植株，抗蟲性測(cè)定表明其具有一定抗蟲性；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)于1994年在國內(nèi)外首次用子房注射的方法把抗蟲基因Bt轉(zhuǎn)入玉米并獲得轉(zhuǎn)基因植株；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院周逢勇等在1998年將GFM殺蟲基因構(gòu)建到PMG6質(zhì)粒上，導(dǎo)入到玉米中，后代檢測(cè)表明Bt基因以孟德爾遺傳方式遺傳到下一代(LIU YJ等，2003)。當(dāng)前，全世界已轉(zhuǎn)化成26種以上Bt轉(zhuǎn)基因植物，包括棉花、玉米、水稻等主要農(nóng)作物。盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)可打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)不同物種間的基因轉(zhuǎn)移。但在某一物種內(nèi)可聞效表達(dá)的基因，被轉(zhuǎn)化到另一物種后，表達(dá)量不一定聞，也未必一定具有其本來的功能，尤其是對(duì)于差異較大的物種。其中，物種密碼子偏好性是影響外源基因表達(dá)量的諸多因素之一。不同的物種往往具有不同的偏好密碼子。分析這種偏好性，在轉(zhuǎn)基因之前，對(duì)需要轉(zhuǎn)化的目的基因進(jìn)行密碼子的重新設(shè)計(jì)或改造，對(duì)于提高外源基因在受體生物中的表達(dá)量具有重要作用。1983年美國華盛頓大學(xué)宣布成功將卡那霉素抗性基因?qū)霟煵菁?xì)胞，以及同年4月美國威斯康星大學(xué)宣布成功將大豆基因轉(zhuǎn)入向日葵共同標(biāo)志著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生。1986年，首批轉(zhuǎn)基因植物(抗蟲、抗除草剤)被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)。1989年哺乳動(dòng)物抗體重鏈和輕鏈基因在煙草中成功表達(dá)并正確組裝成有功能的抗體。1990年Gordon-Kamm首次報(bào)道用基因槍轉(zhuǎn)化玉米懸浮細(xì)胞系獲得了可育的轉(zhuǎn)化體。隨后，玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)開始迅猛發(fā)展，大量轉(zhuǎn)基因植物陸續(xù)研制開發(fā)成功。KozHal (1993)等培育出了抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)基因植株能高水平表達(dá)CryIA(b)抗蟲基因。張秀君(1999)等用基因槍法將兩個(gè)含高賴氨酸蛋白質(zhì)基因?qū)胗衩椎呐咝杂鷤M織。劉大文(2000)等將Zml3-Barnase基因轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織，經(jīng)過除草劑篩選得到陽性植株。Ishida(1996)等首次利用超雙元載體建立了根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米自交系的幼胚，F(xiàn)rame (2002)等成功實(shí)現(xiàn)了根瘤農(nóng)桿菌利用普通的雙元載體轉(zhuǎn)化幼胚。張艷貞(2002)等對(duì)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt殺蟲基因?qū)雰?yōu)良玉米自交系進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，Huang (2005)、Frame (2006)和Lee (2007)等分別利用農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化了常規(guī)玉米自交系。我國在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究方面，已建立較成熟的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。如中國農(nóng)業(yè)大學(xué)在國內(nèi)較早的開展了玉米遺傳轉(zhuǎn)化的工作，于1994在國內(nèi)外首次用子房注射的方法把抗蟲基因Bt轉(zhuǎn)入玉米并獲得轉(zhuǎn)基因植株，以自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)基因Bt為代表的抗蟲玉米已展示了良好的開發(fā)前景。同時(shí)，在無選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記基因刪除和目標(biāo)基因產(chǎn)物定時(shí)降解、植物組織特異性優(yōu)勢(shì)表達(dá)等核心技術(shù)創(chuàng)新方面已具有較強(qiáng)的創(chuàng)新能力。目前已分離的 抗蟲基因很多，主要包括①細(xì)菌來源的抗蟲基因，主要是Bt毒蛋白基因(CryIAb、CryIAc、Cry2、Cry3等)植物來源的蛋白酶抑制劑基因，特點(diǎn)在于抗蟲譜廣、來源于植物本身易于被公眾接受；③細(xì)菌來源的營養(yǎng)殺蟲蛋白(Vipl、Vip2、Vip3等)，廣譜抗鱗翅目，特別是對(duì)小地老虎、粘蟲和甜菜葉蛾具有較強(qiáng)作用。由于基因抗蟲能力及昆蟲耐受性的影響，轉(zhuǎn)基因抗蟲產(chǎn)品主要通過獲得更多更有效的抗蟲基因、改造已有基因、雙抗植物體等途徑獲得。玉米既是重要的糧食作物，又是重要的飼料和エ業(yè)原料，當(dāng)前玉米蟲害(以玉米螟為主)嚴(yán)重，造成玉米大量減產(chǎn)，因此采取有效措施控制其危害對(duì)提高玉米產(chǎn)量、增加農(nóng)民收入具有重要的意義。由于缺乏合適的抗蟲品種，目前解決蟲害的主要方法是在生長過程中噴施化學(xué)殺蟲劑；但是化學(xué)殺蟲劑同時(shí)殺死害蟲及其天敵，造成生態(tài)不平衡和環(huán)境污染。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將Bt抗蟲基因?qū)胗衩灼贩N中，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲性，降低農(nóng)藥的使用量，節(jié)省人力、物力及社會(huì)資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可在作物中穩(wěn)定表達(dá)、且表達(dá)量高、抗蟲效果好的人工合成抗蟲基因CrylF-t及其編碼蛋白，并將其應(yīng)用于載體、宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化構(gòu)建等方面。本發(fā)明的另一目的是將改造抗蟲基因CrylF-t轉(zhuǎn)化玉米等其他植物，從而提高玉米等植物的抗蟲性。通過轉(zhuǎn)基因及常規(guī)育種手段，把抗蟲基因Bt轉(zhuǎn)入生產(chǎn)中普遍應(yīng)用的骨干自交系中，為解決玉米等植物生產(chǎn)中的蟲害提供一條有效途徑。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)CrylF-t基因是在野生型CrylF基礎(chǔ)上進(jìn)行改造的，只留下部分缺失的N端1809bp的一段堿基序列(如SEQ ID NO :5所示)，并且在保持該段序列的氨基酸組成總體不變的情況下，用植物偏愛的密碼子置換序列SEQID No. 5相對(duì)應(yīng)的密碼子，排除DNA序列中存在的造成植物轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的富含AT序列以及常用限制性酶切位點(diǎn)(SacI和XbaI)，然后通過置換密碼子的方法進(jìn)行改正消除，并在3端加上終止密碼子TAG，獲得ー個(gè)改造的Cry IF-1基因序列(如SEQ ID NO : I所示)，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示；另夕卜，在改造的抗蟲基因5端前面加上了 AdhI的增強(qiáng)子序列SEQ ID No. 3。然后確定并化學(xué)合成Adhl-CrylF-t如序列表SEQ. ID NO 4所示的編碼序列；根據(jù)基因功能分析的需要，進(jìn)ー步對(duì)合成的產(chǎn)物進(jìn)行PCR克隆并測(cè)序，合成的基因裝載在質(zhì)粒載體PUC57上。將本發(fā)明基因與原核表達(dá)載體可操作地連接，能夠快速初步檢測(cè)本發(fā)明合成的Bt抗蟲基因CrylF-t表達(dá)產(chǎn)物對(duì)玉米螟的毒性。將本發(fā)明基因與植物表達(dá)載體可操作地連接，將表達(dá)載體導(dǎo)入相應(yīng)農(nóng)桿菌中(LBA4404)，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行玉米愈傷組織和幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)人工合成CrylF-t基因的玉米轉(zhuǎn)化子，培育抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米。也可以 對(duì)其它農(nóng)作物或者果樹等進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使其具備抗蟲活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明公開的基因，以其轉(zhuǎn)化玉米、棉花、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以將本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化細(xì)菌或真菌，通過大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)Bt蛋白，并將其制備成殺蟲劑，用于農(nóng)作物害蟲的防治。本發(fā)明具有積極有益的效果本發(fā)明抗蟲基因CrylF-t序列與原始CrylF序列比較，改造后的基因設(shè)計(jì)了缺失和DNA序列改變，并在基因的前面加上AdhI增強(qiáng)子，大大增強(qiáng)了其在植物中的表達(dá)。使用植物偏愛性密碼子，減少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重復(fù)序列以及不明確的真核DNA序列內(nèi)含子序列。對(duì)于改造后的CrylF-t基因，與原始CrylF基因序列相比，G+C含量為由37. 65%提高到59. 04%。CrylF-t基因與原始DNA序列的同源性為69%。本發(fā)明抗蟲基因CrylF-t能在植物細(xì)胞中高效穩(wěn)定的表達(dá)。此人工改造合成的Adhl-CrylF-t基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、超聲波處理和基因槍轉(zhuǎn)化等手段導(dǎo)入玉米后，可以得到穩(wěn)定遺傳的抗蟲的Adhl-CrylF-t轉(zhuǎn)化子。同時(shí)也可以把該Bt抗蟲基因CrylF-t轉(zhuǎn)化到棉花、水稻、蔬菜等農(nóng)作物中，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，以減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為含有增強(qiáng)子AdhI的新改造抗蟲基因Adhl-CrylF-t的合成及構(gòu)建到質(zhì)粒載體 pUC57 上的構(gòu)建圖譜其中 I :PUC57 Xbal/SacI 雙切，2 PUC57+AdhI-CrylF-t XbaI/SacI 雙切，3 DNA mark SM0331,4 =PUCAdh I-Cry I F-t 質(zhì)粒；圖2為含有增強(qiáng)子AdhI的新改造抗蟲基因AdhI-CrylF-t的合成及構(gòu)建到原核表達(dá)載體PET28b 構(gòu)建圖譜1 :PET28b載體Ndel/Hindlll 雙切，2 :PET28b載體+AdhI-CrylF_tNdel/Hindlll 雙切，3 DNA mark SM0331,4 PET Adhl-CrylF-t 質(zhì)粒；圖3為含有增強(qiáng)子AdhI的新改造抗蟲基因AdhI-Cry lF-t的合成及構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIAl 300-Bar構(gòu)建圖譜I =CPB載體Xbal/SacI雙切，2 =CPB載體+Adhl-CrylF-tXbal/SacI 雙切，3 DNA mark SM0331,4 : CPBAdh I-Cry IF-1 質(zhì)粒；圖4為通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化含有增強(qiáng)子AdhI的新改造抗蟲基因Adhl-CrylF-t轉(zhuǎn)化流程及再生過程:A為浸染后的共培養(yǎng)；B為篩選培養(yǎng)；C為抗性愈傷組織；D為抗性愈傷的再生培養(yǎng)；E為抗性愈傷的分化培養(yǎng)；F為轉(zhuǎn)基因植株的生根培養(yǎng)；G為轉(zhuǎn)基因植株的移栽；H為溫室里的轉(zhuǎn)基因苗。圖5為TO代轉(zhuǎn)化體目的基因CrylF-t的PCR檢測(cè)，M DL2000plus其中CKl :陽性質(zhì)粒對(duì)照，CK2 :非轉(zhuǎn)基因苗陰性對(duì)照，空白雙蒸水對(duì)照，1-6是CrylF-tl到CrylF_t6 ；圖6為TO代轉(zhuǎn)化體目的蛋白Cry lF-t的檢測(cè)圖譜，CKl :未轉(zhuǎn)基因苗陰性對(duì)照；1_6是 CrylF-tl 到 CrylF_t6。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特別說 明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料及試劑，如無特別說明，均購自常規(guī)生化試劑公司。實(shí)施例lCrylF-t基因的設(shè)計(jì)與人工合成Cry IF-1基因是在Bt基因CrylF的原始核苷酸序列的基礎(chǔ)之上，留下部分缺失的N端1809bp的一段堿基序列SEQ ID No. 5，并且在保持保留序列氨基酸組成總體不變的情況下，采用植物基因的偏愛性密碼子置換原始Bt的對(duì)應(yīng)密碼子，消除Bt基因中ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明確的內(nèi)含子序列，并副除基因中存在的大的反向重復(fù)序列和常用限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)出目標(biāo)合成的Bt基因的編碼序列如序列表SEQ IDNo. I所示。含有增強(qiáng)子AdhI的新改造Bt抗蟲基因Adhl-CrylF-t (如序列表SEQ. ID NO 4所示)委托上海生物工程有限公司(2011年I月)合成。所用試劑上海生物工程有限公司。具體方法步驟如下；(I)用DNA work軟件根據(jù)需要合成Adhl-CrylF-t基因序列設(shè)計(jì)引物(寡核苷酸單鏈)58條,姆條35-45bp,姆條約33ug,約為10D。(2) PCR連接引物為雙鏈DNA，兩輪PCR。
權(quán)利要求
1.一種人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.一種含有權(quán)利要求I或2所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t的原核表達(dá)載體。
4.一種增強(qiáng)權(quán)利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t表達(dá)的AdhI增強(qiáng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3o
5.一種含有權(quán)要求I所述增強(qiáng)子AdhI和權(quán)利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因Cry IF-1的Bt抗蟲基因Adhl-CrylF-t，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
6.一種由權(quán)利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t編碼的殺蟲蛋白。
7.一種含有權(quán)利要求6所述殺蟲蛋白的殺蟲劑。
8.一種含有權(quán)利要求I或2所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t的植物表達(dá)載體。
9.一種由權(quán)利要求8所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞LBA4404。
10.權(quán)利要求I或2所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t或權(quán)利要求7所述植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗蟲基因Cry1F-t及其應(yīng)用。對(duì)Cry1F基因進(jìn)行全面改造，得到如SEQ ID NO1所示的Cry1F-t抗蟲基因，在其前面加上AdhI增強(qiáng)子，放在含有強(qiáng)啟動(dòng)子35S的表達(dá)載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將Cry1F-t基因轉(zhuǎn)到玉米基因組中，得到含有Cry1F-t的轉(zhuǎn)基因材料。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明改造合成的Bt毒蛋白對(duì)玉米螟有顯著的殺蟲效果，Cry1F-t及其表達(dá)的目的蛋白能夠在玉米中穩(wěn)定高效表達(dá)，進(jìn)而用于培育轉(zhuǎn)Cry1F-t基因抗蟲玉米。該Bt抗蟲基因Cry1F-t也可以在提高其它農(nóng)作物、果樹或蔬菜等抗蟲性中的得到應(yīng)用，為解決玉米等植物生產(chǎn)中的蟲害提供了一條有效途徑。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102660560SQ20121012475
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者盧彩霞, 岳潤清, 柏松, 王延召, 鐵雙貴, 陳娜, 齊建雙 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院