專利名稱：抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY47及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗稻瘟病菌的水稻基因及該基因的用途。
背景技術(shù)：
水稻(Oryza sativa L.)是全球重要的糧食作物，稻瘟病是危害最嚴(yán)重的水稻病害，長(zhǎng)年均有不同程度的發(fā)生，能導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10-30%，如何防治稻瘟病就成了關(guān)系各國(guó)尤其是水稻主產(chǎn)國(guó)糧食安全的重大問(wèn)題。選用抗病品種是防治稻瘟病的重要手段通過(guò)傳統(tǒng)的遺傳育種，國(guó)內(nèi)外獲得了一些具有較好稻瘟病抗性的水稻品種，然而傳統(tǒng)育種周期太長(zhǎng)且效率低下，并且由于抗病品種的單一化和稻瘟病菌生理小種遺傳的復(fù)雜性、致病的多樣性，往往造成抗病品種在推廣種植三到五年后抗性消失，引起稻瘟病暴發(fā)和流行，不能有效的防止稻瘟病。化學(xué)防治是防止稻瘟病的另一種方法，但該方法既昂貴又缺乏長(zhǎng)期有效 的殺菌劑，而且污染環(huán)境。通過(guò)分子生物學(xué)方法研究水稻的稻瘟病抗性并進(jìn)行分子育種有望克服傳統(tǒng)防治方法的種種弊端。水稻-稻瘟病菌相互作用的研究作為研究植物-真菌病理分子機(jī)制的模型，近十年來(lái)受到植物學(xué)家的廣泛關(guān)注。在水稻-稻瘟病菌的相互作用中，研究比較多的有兩類基因一是識(shí)別病原菌的抗性基因，二是與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的基因，這兩類基因在水稻的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能。其中抗性基因的作用是介導(dǎo)植物對(duì)稻瘟病菌無(wú)毒基因產(chǎn)物的識(shí)另O，并引起的水稻對(duì)稻瘟病菌的特異性的抗性。它們的相互作用模式遵循基因?qū)蚣僬f(shuō)，植物與病原微生物的相互作用取決于寄主的抗性基因與病原菌的無(wú)毒基因，只有當(dāng)它們同時(shí)存在時(shí)植物才表現(xiàn)出抗性。當(dāng)抗性基因產(chǎn)物與無(wú)毒基因產(chǎn)物相互識(shí)別后，首先在病菌侵入部位的植物細(xì)胞及鄰近的細(xì)胞中會(huì)迅速誘導(dǎo)形成超敏反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)水稻的其它防衛(wèi)反應(yīng)，如活性氧的釋放、植物細(xì)胞壁的加固、植保素、植物防御素、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶抑制劑的合成以及其他病程相關(guān)蛋白和防衛(wèi)相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)合成，以求最快的控制或殺死侵入的病菌。植物超敏反應(yīng)的啟動(dòng)及其引起的防衛(wèi)信號(hào)的傳導(dǎo)，最終使寄主的其它組織對(duì)隨后的病原菌產(chǎn)生廣譜抗性，即系統(tǒng)獲得性抗性。除了以上兩類基因外，還有一些參與水稻信號(hào)途徑的基因也參與水稻對(duì)稻瘟病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。2006年Reyna等人對(duì)水稻中的17個(gè)MAPK進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中有9個(gè)基因可以被稻瘟病菌誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明這些MAPK可能在水稻的防衛(wèi)反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)中具有一定功能(Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006, vol. 19 :530-540)。2009 年，Li 等人研究了 OsWAKl基因的功能，該基因可以被傷害、SA、MeJA還有稻瘟病菌誘導(dǎo)表達(dá)，在水稻中組成型表達(dá)OsWAKl可以使轉(zhuǎn)基因植株對(duì)稻瘟病菌致病小種產(chǎn)生抗性，說(shuō)明該基因在水稻防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要作用(Plant Molecular Biology, 2009, vol. 69 :337-346)。此夕卜，在水稻中過(guò)表達(dá)0sWRKY31或0sWRKY53基因，都會(huì)增強(qiáng)植物對(duì)稻瘟病菌的抗性(CellResearch,2008,vol. 18 :508-521 ；Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Structure andExpression，2007，vol. 1769 :497-505)。這些基因編碼參與水稻防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)控，初步的研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)谒究共∵^(guò)程中具有重要功能，它們的具體功能以及作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。通過(guò)各種方法找到的參與水稻防衛(wèi)反應(yīng)的基因都具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，而借助成熟的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以快速 的得到大量轉(zhuǎn)基因株系。20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著生物工程技術(shù)的興起與完善，特別是基因工程技術(shù)在作物改良方面的廣泛應(yīng)用，為培育抗病品種提供了新的手段。植物抗病轉(zhuǎn)基因成為生物技術(shù)人員的研究熱點(diǎn)，高效穩(wěn)定的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為外源基因轉(zhuǎn)化水稻創(chuàng)造了條件。具體說(shuō)來(lái)，水稻抗病的基因工程主要從抗性(R)基因和防衛(wèi)基因兩個(gè)方面進(jìn)行。Mackil等人培育出了一套以C039作為遺傳背景的帶有Pi_l、Pi-2, Pi-3, Pi-4a和Pi-4b稻瘟病抗性基因的近等基因系(Phytopathology, 1994，vol. 84 :1278-1283)，實(shí)驗(yàn)者用這套近等基因系進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攜Pi-3的近等基因系C104PKT抗病時(shí)間長(zhǎng)、病斑數(shù)少并且與其他基因組合的累加系也對(duì)稻瘟病有很高的抗性。進(jìn)而利用C104PKT與帶有Pi-1、2的近等基因系A(chǔ)57-119雜交培育出BL13 (攜帶Pi_l、3)、BL_23 (攜帶Pi_2、3)和BL-123(攜帶Pi-1、2、3)的近等基因系，目前已引種到美國(guó)、越南、菲律賓、印尼、日本等國(guó)，經(jīng)3到5年的種植均表現(xiàn)出很高的抗性。而Nishizawa等人將水稻的幾丁質(zhì)酶基因Cht_2、Cht-3分別轉(zhuǎn)入粳稻Nippobare和Koshihikari,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中Cht_2在細(xì)胞內(nèi)積累，而Cht-3在細(xì)胞外積累。Cht-2或Cht-3轉(zhuǎn)基因植株的RO及Rl代對(duì)稻瘟菌致病小種的抗性提高，而且抗性與幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量具有相關(guān)性(Theoretical and Applied Genetics,1999，vol. 99 :383-390)。Lin等人和Datta等人將水稻中的I類幾丁質(zhì)酶基因Chill轉(zhuǎn)入秈稻，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)紋枯病表現(xiàn)出一定抗性，而且?guī)锥≠|(zhì)酶的含量和活性與抗性呈正相關(guān)(Biotechnology, 1995, vol. 13 :686-691)。Feng 等人將水稻幾丁質(zhì)酶基因 RC24 和首猜β-1,3-葡聚糖酶基因同時(shí)轉(zhuǎn)入水稻，部分Rl代植株對(duì)廣東省稻瘟菌5個(gè)代表小種表現(xiàn)出不同程度的抗性增強(qiáng)(ActaBotanica Sinica, 1999, vol. 41 :1187-1191)。現(xiàn)有的研究證明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行分子育種有望找到具有實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因水稻品種。但是現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因成果還極少有投入到生產(chǎn)應(yīng)用中，而且現(xiàn)在參與水稻抗稻瘟病的關(guān)鍵基因還有待發(fā)現(xiàn)，如何發(fā)現(xiàn)這些基因并且大規(guī)模的轉(zhuǎn)化水稻進(jìn)行鑒定還有待深入研究。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因，其在感病水稻品種中過(guò)量表達(dá)后，增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗稻瘟病的基因及其編碼蛋白，用于提高水稻等植物的抗病性能。本發(fā)明所提供的抗稻瘟病基因，名稱為0sWRKY47，來(lái)源于水稻(Oryza sativa)，編碼具有下述氨基酸序列之一的蛋白質(zhì)I)序列表中的 SEQ ID No 3 ；2)序列表中的SEQ ID No :3氨基酸序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有抗稻瘟病的功能。序列表中的SEQ ID No 3序列由333個(gè)氨基酸殘基組成，其中從122位至183位為保守的WRKY結(jié)構(gòu)域。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非保守區(qū)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或添加的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常是利用基因工程的手段對(duì)其編碼基因進(jìn)行突變，然后再表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。通過(guò)在植物中表達(dá)所述蛋白，并測(cè)試這些植物的稻瘟病抗性，可以判斷發(fā)生這些變化后的蛋白是否還具有抗稻瘟病菌的功能。本發(fā)明的抗稻瘟病基因0sWRKY47可以是所述基因的cDNA序列，也可以是所述基因的基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO I所不的基因組DNA序列和SEQ ID NO 2所不的cDNA序列。本發(fā)明還提供了包含上述核酸序列以及與該核酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述表達(dá)調(diào)控序列包括組成型高表達(dá)的調(diào)控序列。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了一種提高植物對(duì)稻瘟病菌的抗性的方法，包括將所述抗稻瘟病的水稻基因0sWRKY47導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，得到對(duì)稻瘟病菌抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。在上述提高植物抗稻瘟病性的方法中，抗稻瘟病的水稻基因0sWRKY47既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組DNA序列，或者是與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA序列或基因組DNA序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓姆椒ǎ约皽y(cè)試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明抗稻瘟病的水稻基因0sWRKY47或其同源序列可通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pUC系列載體或pBluescript系列載體等。使用本發(fā)明抗稻瘟病的水稻基因0sWRKY47或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)其表達(dá)。所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子例如水稻actinl啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子和玉米Ubiquitin I啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可為根特異性表達(dá)啟動(dòng)子、葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子、維管特異性表達(dá)啟動(dòng)子、種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng)子等；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受低溫、干旱、ΑΒΑ、乙烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此夕卜，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子和/或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、羧芐青霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。攜帶有本發(fā)明抗稻瘟病的水稻基因0sWRKY47或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過(guò)將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明抗稻瘟病的水稻基因0sWRKY47或其同源序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對(duì)該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的抗病性進(jìn)一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁包 括無(wú)性繁殖和/或種子繁殖。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述植物為水稻。在使本發(fā)明的0sWRKY47基因在水稻中過(guò)量表達(dá),并接種水稻最主要的真菌病害——稻瘟病菌的檢測(cè)后，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)0sffRKY47基因具有提高抗稻瘟病性的功能。過(guò)量表達(dá)的0sWRKY47基因cDNA的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病的抗性增強(qiáng)。因此，本發(fā)明涉及的0sWRKY47基因在植物抗病性基因工程中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖I顯示了實(shí)施例3中通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)0sWRKY47基因在部分轉(zhuǎn)基因水稻植株中的表達(dá)情況。圖2顯示了實(shí)施例3中0sWRKY47轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對(duì)稻瘟病菌的抗性鑒定和分子鑒定代表結(jié)果，其中A為TP309(未轉(zhuǎn)基因的臺(tái)北309水稻)、0sWRKY47轉(zhuǎn)基因水稻I號(hào)株系和16號(hào)株系幼苗葉片接種稻瘟病菌96-4-1A小種后7天的表型；B為0sWRKY47基因在TP309和轉(zhuǎn)基因水稻I號(hào)、16號(hào)株系幼苗中的表達(dá)情況；C為抗病標(biāo)志性基因PRla在TP309和轉(zhuǎn)基因水稻I號(hào)、16號(hào)株系幼苗中的表達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)((Molecular Cloning A Laboratory Manual))(Sambrook, J. ,Russell,David ff. ,MolecularCloning ALaboratory Manual,3rd edition,2001, NY, Cold Spring Harbor)。實(shí)施例I、基因的克隆( 一 ) 0sffRKY47 基因 cDNA 序列的克隆0sWRKY47 基因的基因組 DNA 序列(SEQ ID No :1)、cDNA 序列(SEQ ID No 2)和氨基酸序列(SEQ ID No 3)從MSU/TIGR水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得(http://rice,plantbiology. msu. edu/)。根據(jù)0sWRKY47基因的cDNA序列設(shè)計(jì)基因特異的PCR引物Fl :5，-ATG GCG TCT CCT GAT GGT GG-3’ (SEQ ID No 4)；
Rl :5，-TTAAGGATC GAAGCCAAACA-3’ (SEQ IDNo :5)。用這對(duì)引物從水稻粳稻(Oryza sativa L. ssp. japonica)近等基因系品種IRBL22 (由國(guó)際水稻所培育)的cDNA中克隆0sWRKY47基因的cDNA序列。由于0sWRKY47基因的cDNA序列中部分區(qū)域GC含量高達(dá)80%以上，用普通高保真酶克隆不到，在多次實(shí)驗(yàn)后，本發(fā)明者利用GC緩沖液I (Takara)與Pfu高保真酶擴(kuò)增得到0sWRKY47基因的全長(zhǎng)cDNA序列。PCR產(chǎn)物用T4連接酶連入pBluescript載體，篩選帶有正向插入片段(基因的ATG靠近T7測(cè)序引物)載體并測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pBS-0sWRKY47用于構(gòu)建0sWRKY47基因的植物表達(dá)載體。( 二)0sffRKY47基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建為了構(gòu)建0sWRKY47基因的植物表達(dá)載體，本發(fā)明者改造了植物表達(dá)載體 P麗101用于水稻轉(zhuǎn)化。具體的，將P麗101用Hindlll/Kpnl做酶切并回收酶切質(zhì)粒，將玉米Ubiquitinl啟動(dòng)子序列克隆連入pBS載體，得到的pBS-pUbi載體的質(zhì)粒DNA用Hindlll/Spel酶切，回收帶有啟動(dòng)子序列的DNA片斷。再將0sWRKY47基因的cDNA序列從pBS-0sffRKY47載體Spel/Kpnl切下。以上三個(gè)核酸片段回收純化后，用T4連接酶4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，使用基因特異引物Fl和Rl進(jìn)行PCR篩選，從篩選得到的陽(yáng)性克隆中提取帶有0sWRKY47基因序列的P麗101載體質(zhì)粒，用BamHI酶切驗(yàn)證正確后用于水稻的愈傷轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2、組成型表達(dá)0sWRKY47基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得(一 )水稻愈傷誘導(dǎo)選取飽滿的臺(tái)北309水稻種子，剝?nèi)シN皮，滅菌洗滌后，均勻的點(diǎn)入在帶有2毫克/升2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)的滅菌NB固體培養(yǎng)基，32°C持續(xù)光照5天誘導(dǎo)愈傷形成。( 二)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將帶有0sWRKY47基因cDNA片段的pWMlOl載體用電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，涂布帶有50微克/升卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基，28°C黑暗培養(yǎng)2天后，用基因特異引物Fl和Rl篩選陽(yáng)性克隆。得到的陽(yáng)性克隆在含有50毫克/升卡那霉素的固體AB培養(yǎng)基28 °C黑暗培養(yǎng)3天，用于水稻轉(zhuǎn)化。(三)水稻愈傷轉(zhuǎn)化用過(guò)濾滅菌的含有100微摩爾/升乙酰丁香酮的液體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基從AB培養(yǎng)基上將農(nóng)桿菌洗下，菌液濃度調(diào)至0D600在O. 08左右。選取生長(zhǎng)狀況良好的愈傷組織，在菌液中浸泡2分鐘，之后在無(wú)菌濾紙上晾干，再將愈傷組織移至含有100微摩爾/升乙酰丁香酮的NB共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25 °C黑暗下共培養(yǎng)3天。(四)篩選水稻愈傷共培養(yǎng)3天后，用無(wú)菌水洗滌愈傷5次，再用200毫升的含有500毫克/升羧芐青霉素鈉的無(wú)菌水洗一遍，小心倒去液體，用無(wú)菌鑷子將愈傷組織夾取至無(wú)菌濾紙上，晾干后轉(zhuǎn)移至NB篩選培養(yǎng)基上(含有2毫克/升的2，4-D、50毫克/升的潮霉素和400毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32°C持續(xù)光照2周。(五)陽(yáng)性愈傷的分化選取生長(zhǎng)良好呈嫩黃色的陽(yáng)性愈傷組織，用無(wú)菌鑷子移至NB預(yù)分化培養(yǎng)基(含有I毫克/升萘乙酸(NAA)、5毫克/升脫落酸(ABA)、2毫克/升激動(dòng)素(kinetin)、25毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32°C持續(xù)光照培養(yǎng)。2周后挑選生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)入MS分化培養(yǎng)基(含有O. 02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin、50毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32°C持續(xù)光照培養(yǎng)。待分化出來(lái)的幼苗長(zhǎng)至2至5毫米，轉(zhuǎn)入不含激素和抗生素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)2到3周，之后移入土中置于溫室中生長(zhǎng)(溫度28-30°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)。實(shí)施例3、組成型表達(dá)0sWRKY47基因?qū)Φ疚敛〉目剐栽鰪?qiáng)(一 )轉(zhuǎn)基因水稻中0sWRKY47基因表達(dá)水平的檢測(cè)剪取轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的葉片,用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取植物總RNA,DNaseI (Takara公司)處理消化DNA后,用Invitrogen公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到轉(zhuǎn)基因植株的cDNA。根據(jù)0sWRKY47基因的cDNA序列設(shè)計(jì)基因特異的實(shí)時(shí)定量PCR引物realF和realR，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)0sWRKY47基因在轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)水平，內(nèi)參基因選用水稻的UBQ基因(引物使用realF2和realR2)。各引物序列如下 realF 5/ -GCG CGA GCA CAA GCA GAG TC-3' (SEQ ID No 6)；realR 5/ -CAG TTG GCGAAG CTG CAG GA-3' (SEQ ID No 7)；realF2 5/ -GTG GCC AGT AAG TCC TCA GC-3' (SEQ ID No 8)；realR2 5/ -ACAATG AAA CGG GAC ACG AC-3' (SEQ ID No :9)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)0sWRKY47基因在轉(zhuǎn)基因水稻植株中的表達(dá)情況如圖I所示，其中基因過(guò)表達(dá)倍數(shù)超過(guò)60倍的有3株，分別是第7、13和16號(hào)轉(zhuǎn)基因株系；TP309代表未轉(zhuǎn)基因的臺(tái)北309水稻植株。( 二)轉(zhuǎn)基因水稻的稻瘟病接種實(shí)驗(yàn)選擇稻瘟病菌毒性小種96-4-la，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗進(jìn)行離體葉片接種。稻瘟病菌96-4-1A在燕麥培養(yǎng)基上28°C黑暗培養(yǎng)I周左右，用無(wú)菌水洗下表面菌絲，涂布到一塊新的燕麥培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)I天后,用無(wú)菌棉簽輕輕刮去表面菌絲,置于日光燈下產(chǎn)孢。24小時(shí)后用含有O. 02% Tween-20的無(wú)菌水洗下孢子,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度,將孢子濃度調(diào)整至I X IO5孢子/毫升。取四葉期水稻幼苗，進(jìn)行稻瘟病菌孢子的噴霧接種，每株苗噴霧2-4mL，待所有幼苗的葉片表面均勻的覆蓋有一層細(xì)小的孢子懸浮液滴后，將其置于100%濕度，26°C的黑暗培養(yǎng)箱中24h。一天后恢復(fù)正常光周期培養(yǎng)，7天后觀察表型。結(jié)果如圖2所示。圖2中，A為TP309、0sffRKY47轉(zhuǎn)基因水稻I號(hào)株系和16號(hào)株系幼苗葉片接種稻瘟病菌96-4-1A小種后7天的表型；B為0sWRKY47基因在TP309和轉(zhuǎn)基因水稻I號(hào)、16號(hào)株系幼苗中的表達(dá)情況；C為抗病標(biāo)志性基因PRla在TP309和轉(zhuǎn)基因水稻I號(hào)、16號(hào)株系幼苗中的表達(dá)情況?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)0sWRKY47基因的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對(duì)稻瘟病小種96-4-1A的抗性增強(qiáng)，表明0sWRKY47基因的組成型表達(dá)增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟病的抗性。
權(quán)利要求
1.水稻0SWRKY47基因在提高植物對(duì)稻瘟病菌的抗性中的應(yīng)用，所述水稻0SWRKY47基因編碼下述氨基酸序列I)或2)所示的蛋白質(zhì) 1)序列表中的SEQID No 3 ； 2)序列表中的SEQID No :3氨基酸序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添力口，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有抗稻瘟病的功能。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻OsWRKY47基因的序列是該基因的cDNA序列或基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻OsWRKY47基因的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 所示。
4.如權(quán)利要求I 3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述水稻OsWRKY47基因?qū)胫?細(xì)胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，得到抗稻瘟病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻OsWRKY47基因通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物表達(dá)載體包含所述水稻OsWRKY47基因的序列和與該基因序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述表達(dá)調(diào)控序列是驅(qū)動(dòng)該基因組成型高表達(dá)的調(diào)控序列。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于,所述植物表達(dá)載體中，用玉米UbiquitinI啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述水稻OsWRKY47基因的表達(dá)。
9.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY47及其應(yīng)用。該基因編碼序列表SEQ IDNo3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其基因組DNA序列和cDNA序列分別如序列表中SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示。OsWRKY47基因具有提高植物抗稻瘟病性的功能，利用該基因轉(zhuǎn)化水稻，獲得抗病植物品系，使水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102676540SQ20121012484
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者瞿禮嘉, 秦跟基, 顧紅雅, 魏桐 申請(qǐng)人:北京大學(xué)