專利名稱：一種黃酒用氨基甲酸乙酯降解酶產(chǎn)生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種黃酒用氨基甲酸乙酯(EC)降解酶產(chǎn)生菌，涉及該菌的鑒定及所產(chǎn)酶的基本特性，具體的說是從小鼠的腸道中分離出一株可以產(chǎn)生EC降解酶產(chǎn)生菌，通過ITS序列法鑒定其種屬。對提取獲得的粗酶分析其最適pH、最適溫度、pH值和溫度穩(wěn)定性范圍、底物的特異性以及乙醇耐受性等基本特性，并考察其在黃酒中的初步應(yīng)用效果。屬于與食品質(zhì)量提升相關(guān)的小酶種產(chǎn)生菌及酶特性研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱為EC)可以引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚 癌等。一般認(rèn)為EC主要的致癌機(jī)理是約0. 1%的氨基甲酸乙酯被細(xì)胞色素P450氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，后者能夠誘導(dǎo)Cu2+調(diào)控的DNA損傷，這種損傷多發(fā)生于胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的殘基上，進(jìn)而影響生物的遺傳物質(zhì)，引發(fā)癌變。國內(nèi)外對酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途徑為尿素途徑，我國黃酒及日本清酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是來源于酒中所含尿素與乙醇的反應(yīng)
H2NCONH2 + C2H5OH- C2H5OCONH2 +NH3
通過氨基甲酸乙酯的形成途徑的分析可知，發(fā)酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、醬油等)和酒精飲料(如葡萄酒、蘋果酒、中國黃酒和日本清酒等)中EC的形成主要來自尿素和乙醇的反應(yīng)。降低黃酒中EC含量的方法可分為傳統(tǒng)工藝的改良和酶解法。目前，利用酶解法去除黃酒中EC已成為現(xiàn)在及將來的發(fā)展趨勢。尿素是生成氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)，利用酸性脲酶處理黃酒，可以除去黃酒中大部分尿素，因而減少生成氨基甲酸乙酯的可能性。而氨基甲酸乙酯降解酶則能直接作用于氨基甲酸乙酯，有效分解其為尿素和氨，減少黃酒中已經(jīng)產(chǎn)生的EC含量。本發(fā)明中一株EC降解酶產(chǎn)生菌株的發(fā)現(xiàn)和對其相關(guān)的研究，為未來黃酒中EC含量更好的減少和控制提供較好的補(bǔ)充手段。隨著生活水平的日益提高，國內(nèi)對酒飲料的消費(fèi)量日趨上升，尤其是葡萄酒、米酒、黃酒、啤酒等含酒精飲料更是成為人們消費(fèi)的熱點，因此有效的降低酒精飲品中的EC含量水平勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)EC降解酶的菌株，該EC降解酶在清酒、黃酒、米酒等發(fā)酵食品的生產(chǎn)條件下具有較好的活性；本發(fā)明提供該菌以及該菌所產(chǎn)的EC降解酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)及該酶在黃酒中應(yīng)用的結(jié)果。本發(fā)明的技術(shù)方案一種氨基甲酸乙酯EC降解酶產(chǎn)生菌，是從小鼠的腸道中分離得到一株產(chǎn)EC降解酶的菌株，其分類命名為變幻青霉variabile)JN-A525，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為=CGMCCNo.5763。
所述的EC降解酶產(chǎn)生菌，本菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，其氨基酸序列為SEQ IDNO: I。菌株CGMCC No. 5763所產(chǎn)酶的最適pH為4. 0-6. 0，最適溫度為50°C左右；該酶在40-50°C之間，pH值7-9之間，酶具有較好的穩(wěn)定性。本發(fā)明的菌株CGMCC No. 5763是從小鼠的腸道組織及內(nèi)容物中分離獲取。菌株的鑒定
(1)設(shè)計特異性引物，引物名稱ITS1,ITS4
(2)提取基因組DNA。 (3)合成引物，擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。(4) PCR 產(chǎn)物純化。(5) PCR產(chǎn)物測序。本菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，其氨基酸序列為SEQ ID NO: I。(6)系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所不。將EC分解酶產(chǎn)生菌CGMCC No. 5763的rDNA ITS序列的測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站上的Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)和Penicillium variabile的rDNAITS序列相似性達(dá)97%，同時EC分解酶產(chǎn)生菌CGMCC No. 5763與Penicillium variabile在基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于同一分支，且二者的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)特征相同，生理生化特征基本一致，因此鑒定該菌株為是青霉屬中變幻青霉(PeniciIlium variabile) JN—A525。該菌株在察氏培養(yǎng)基上，菌落質(zhì)地絨狀，致密，平坦，較??；邊緣菌絲體黃色，略帶綠色；菌落反面呈橙黃色至紅棕色；在電鏡中觀察分生孢子為卵圓形或橢圓形，壁光滑或稍粗糙。粗酶液的制備及研究
斜面培養(yǎng)基蔗糖 30g/L、NaNO3 3 g/L、K2HPO4 I g/L、KCl 0. 5 g/L、MgSO4 0. 5 g/L、FeSO4 0. 01 g/L、瓊脂 15-20 g/L、pH 自然；
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、pH 6. 0 ；
孢子懸浮液的制備用適量的無菌水洗下瓊脂斜面上新鮮、生長旺盛的孢子，然后移入裝有玻璃珠的三角瓶中，在振蕩器上充分振蕩，使孢子均勻分散。將該菌的孢子懸液以3%的接種量接種于含有70 mL發(fā)酵液的錐形瓶中，置于恒溫調(diào)速搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為30°C。發(fā)酵培養(yǎng)3d后，將發(fā)酵液離心，所得的菌絲體利用超聲波破碎，10000X^,4°C, 20 min。將獲得的上層清液置于4°C保存。通過離心獲得發(fā)酵液中的菌體量為13. 87g/L，測得總酶活為340. 8U/L，從而可以測量得到單位菌體的產(chǎn)酶量為24. 57u/g。酶活測定方法和粗酶酶學(xué)性質(zhì)
(I)酶活測定方法
①原理在一定條件下，該菌株的粗酶液與底物(3% EC，pH4.4)反應(yīng)后，利用終止劑、顯色劑I、顯色劑II分別作用后。在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與酶的活力成正比，故在625nm的波長下進(jìn)行比色，計算酶活力。②酶反應(yīng)體系稀釋后的粗酶液；顯色劑I :稱取15g苯酚和0.625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL ;顯色劑II :稱取13. 125g NaOH和7. 5mL NaClO用超純水定容至250mL ;終止劑稱取IOg三氯乙酸用超純水定容至100mL。 ③NH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液制備
ImL氨水溶于底物反應(yīng)液(3% EC，pH4. 4)并定容至145mL，配成0. lmol/L的NH4+溶液，并以此為母液，用相同的底物反應(yīng)液(3% EC, pH4. 4)配制成0. I mmol/L、0. 2 mmol/L、0. 3mmol /1,.0. 4 mmol /1,.0. 5 mmol/L 的 NH4+ 標(biāo)準(zhǔn)溶液。④氨離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用移液管準(zhǔn)確移取ImL NH4+標(biāo)準(zhǔn)梯度液分別置于順序編號的IOmL比色管中。37°C下恒溫保溫30min，立即用吸ImL終止劑于比色管中，振蕩混勻。再依次加入ImL顯色劑I和顯色劑II，強(qiáng)烈振蕩，使之充分混勻，反應(yīng)20min。超純水定容至10mL，在625nm下比色測定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，NH4+梯度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑤酶活的測定步驟
取兩支IOmL比色管，在兩管中分別加入ImL底物反應(yīng)液(3% EC, pH4. 4)，再在一支比色管中加入ImL酶液，在另一支比色管中加入ImL超純水。然后,在50°C恒溫水浴箱中反應(yīng)30min后,在兩管中各加入ImL終止劑,混勻后加入ImL的顯色劑I和ImL顯色劑II,強(qiáng)烈震蕩，繼續(xù)在50°C恒溫水浴箱中保溫15 min后取出，用超純水稀釋至10mL，625nm處比色，并記錄OD值。酶活計算公式
酶活力=A OD625 XnXkX 10/30
式中AOD625 :酶反應(yīng)后樣品測定與空白試驗光密度值之差；n :酶活測定液稀釋倍數(shù)；k :標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；10 lmL樣品液稀釋至IOmL的倍數(shù)；30 :酶反應(yīng)的時間(min)。酶活力定義在常壓、37°C、pH4. 4條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生IMfflol氨為一個酶活力單位。(2)粗酶酶學(xué)性質(zhì)(見圖4、圖5)
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明分離得到的菌株，經(jīng)鑒定為變幻青霉菌，其產(chǎn)的EC降解酶在pH 7. 0-9. 0之間很穩(wěn)定，但當(dāng)pH高于10. 0或低于3. 0時，酶的活力開始迅速降低直到失去活性。經(jīng)試驗測定該菌產(chǎn)酶的最適PH為4. 0-6.0，說明其作用范圍相對較寬。溫度在40-500C的范圍內(nèi)，酶活性變化不大，且酶很穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于60°C，酶的活性開始迅速降低直到失活。經(jīng)試驗測定該菌產(chǎn)酶的最適溫度為50°C。并對該菌產(chǎn)生的酶在不同酒精度中進(jìn)行試驗，測得該酶對1%_15%濃度的酒精有一定耐受性。在模擬黃酒(15%乙醇、3% EC、PH4. 4)條件下，該酶對EC有相對較強(qiáng)的降解作用，并對氨基甲酸甲酯(MC)也有一定的作用，但對氨基酸類不能作用。故該變幻青霉{Penicillium rariahVe」JN-A525所產(chǎn)EC降解酶有在清酒、黃酒、米酒等發(fā)酵食品中去除已產(chǎn)生的微量EC與MC的應(yīng)用潛力。固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定酶液對黃酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響。頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析酶處理前后的黃酒中EC的含量，考察酶在黃酒中去除EC的初步應(yīng)用效果(見表I)。生物材料樣品保藏一種氨基甲酸乙酯EC降解酶產(chǎn)生菌，是從小鼠的腸道中分離得到一株產(chǎn)EC降解酶的菌株，其分類命名為變幻青霉variabile ) ]^~A525,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia :北京中國科學(xué)院微生物研究所，其保藏編號為=CGMCC No. 5763，保藏日期2012年2月16日。

圖I氨離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2菌株所產(chǎn)EC降解酶的底物的特異性。圖3合成引物，擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，擴(kuò)增結(jié)果。圖4酶反應(yīng)的最適溫度。圖5酶反應(yīng)的最適pH。
圖6系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實施方式
實施例I
I、菌株的分離
從小鼠腸道中一株EC降解酶產(chǎn)生菌。所用的分離培養(yǎng)基0. 23%羥乙基哌嗪乙酸、0. 1%維生素混合物(30g/L膽堿鹽酸、10mg/L煙酰胺、2. 5mg/L泛酸I丐、2. 5mg/L鹽酸硫胺、I. 25mg/L核黃素、0. 75mg/L卩比卩多醒鹽酸、0. 6mg/L對氨基苯甲酸、0. 5mg/L葉酸、0. lmg/L生物素)、0. 02%礦物質(zhì)混合物(0. 25%氨基甲酸乙酯、0. 2%乙酰胺)。菌株的鑒定
該菌株在察氏培養(yǎng)基上，菌落質(zhì)地絨狀，致密，平坦，較薄；邊緣菌絲體黃色，略帶綠色；菌落反面呈橙黃色至紅棕色；在電鏡中觀察分生孢子為卵圓形或橢圓形，壁光滑或稍粗糙。將EC降解酶產(chǎn)生菌JN-A525的rDNA ITS序列的測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站上的Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)觀取Penicillium variabile的rDNAITS序列相似性達(dá)97%,同時EC分解酶產(chǎn)生菌與variabile在基于rDNAITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于同一分支，且二者的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)特征相同，生理生化特征基本一致，因此鑒定該菌株為是青霉屬中變玄]著霉QPeniciIIiutnvariabile、。粗酶液的制備及研究
斜面培養(yǎng)基蔗糖 30g/L、NaNO3 3 g/L、K2HPO4 I g/L、KCl 0. 5 g/L、MgSO4 0. 5 g/L、FeSO4 0. 01 g/L、瓊脂 15-20 g/L、pH 自然；
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、pH 6. 0 ；
孢子懸浮液的制備用適量的無菌水洗下瓊脂斜面上新鮮、生長旺盛的孢子，然后移入裝有玻璃珠的三角瓶中，在振蕩器上充分振蕩，使孢子均勻分散。將該菌的孢子懸液以3%的接種量接種于含有70 mL發(fā)酵液的錐形瓶中，置于恒溫調(diào)速搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為30°C。發(fā)酵培養(yǎng)3d后，將發(fā)酵液離心，得到的菌絲體利用超聲波破碎，10000Xg，4°C，20 min。將獲得的上層清液置于4°C保存。通過離心獲得發(fā)酵液中的菌體量為13. 87g/L，測得總酶活為340. 8U/L，從而可以測得單位菌體的產(chǎn)酶量為24. 57u/g。對該菌產(chǎn)生的EC降解酶分別進(jìn)行溫度、pH穩(wěn)定性的實驗；最適溫度及pH的實驗；底物特異性及酒精耐受度實驗。
酶反應(yīng)的最適溫度和熱穩(wěn)定性用所產(chǎn)的酶液分別在不同溫度下(30_70°C)測定模擬酒樣(酒精度為15%、EC含量為3%、pH4. 4)中EC分解酶酶活，50°C時酶活達(dá)到最高。在40-50°C之間，酶活表現(xiàn)有較高的相對活力，55°C以上，酶活失活較快。將酶液分別置于40-75°C的恒溫水浴鍋中保溫，于Ih同時取樣測定酶活，與未加熱處理的酶對比，結(jié)果得出EC降解酶在40-50°C有較好的穩(wěn)定性。酶反應(yīng)的最適pH和pH穩(wěn)定性測定不同pH值下,酶液的酶活,結(jié)果酶作用的最適pH值約6. O。以不同pH值的緩沖液將菌體稀釋適當(dāng)倍數(shù)，4°C保溫lh，標(biāo)準(zhǔn)條件下測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，可知該酶pH值7-9之間酶具有較好的穩(wěn)定性。EC降解酶底物的特異性分別以甘氨酸、谷氨酸、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、Y-氨基丁酸為底物，相同條件下，測定酶活。由圖2可知，該酶對氨基甲酸乙酯有相對較強(qiáng)的水解釋放氨離子的能力，而對氨基甲酸甲酯也可以作用，但作用較弱，對一些氨基酸則基本沒什么作用。 乙醇耐受性分別取酒精含量為0、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%，EC含量3%，pH4. 5的底物ImL于標(biāo)記好的比色管中，各加入ImL酶液，50°C水浴反應(yīng)30min，測定OD值。實驗結(jié)果為EC分解酶酶活隨著酒精含量的增加而降低。3、酶液對黃酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響
采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定酶液對黃酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響。樣一為對照，經(jīng)GC-MS檢測，對照品種含有36種風(fēng)味物質(zhì)，其中包括18種酯類、5種酸類、4種醇類、2種酚類、I種酮類、2種烷類化合物、I種呋喃化合物。樣二是經(jīng)酶液處理的黃酒，含有38種風(fēng)味物質(zhì)，其中酚類增加了一種2，6- 二特丁基-4-甲苯酚，醇類增加了一種2-甲基丁醇，酸類增加了一種胺鮮酯酸，少了一種呋喃類化合物。樣三是經(jīng)滅活的酶液處理的黃酒，含37中風(fēng)味物質(zhì)，其中多了一種醇類即2，3-丁二醇。其余基本和對照保持一樣。該實驗說明了酶液對黃酒中的風(fēng)味物質(zhì)沒有吸附作用，經(jīng)過酶液作用的黃酒風(fēng)味物質(zhì)有極微小的變化，基本不影響黃酒的整體風(fēng)味和質(zhì)量。酶在黃酒中去除EC的初步應(yīng)用效果
用頂空固相微萃取技術(shù)富集黃酒中的EC，再用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定量分析。頂空固相微萃取吸取處理過的酒樣8ml置于20mL的頂空瓶中，用微量進(jìn)樣器加入8MLPC內(nèi)標(biāo)溶液，再加入3. IgNaCl,旋緊瓶蓋，插入萃取頭，在70°C下250r/min恒溫攪拌萃取45min。氣質(zhì)色譜-質(zhì)譜連用檢測萃取完畢后將萃取頭取出，插入氣相色譜進(jìn)樣口 250°C熱解吸5min,載氣為高純He,流速2mL/min ;不分流進(jìn)樣。黃酒被酶處理的樣品條件
對照按每mL黃酒加0. 7mL超純水37°C處理Ih后的黃酒樣品；
樣一按每mL黃酒加0. IU粗酶液37°C處理Ih后的黃酒樣品；
樣二 將樣一經(jīng)100°C沸水浴滅酶處理Ih ；
樣三按每mL黃酒加0. 3U粗酶液37°C處理Ih后的黃酒樣品；
樣四將樣三經(jīng)100°C沸水浴滅酶處理Ih ；
樣五按每mL黃酒加0. 5U酶粉37°C處理Ih后的黃酒樣品；
各樣品中EC去除率如表I所示。
表I EC降解酶在黃酒中去除EC的初步應(yīng)用效果
權(quán)利要求
1.一種氨基甲酸乙酯EC降解酶產(chǎn)生菌，其分類命名為變幻青霉variabile) JN-A525,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,其保藏編號為CGMCC No. 5763。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的EC降解酶產(chǎn)生菌，本菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，其氨基酸序列為 SEQ ID NO: I。
全文摘要
一種黃酒用氨基甲酸乙酯降解酶產(chǎn)生菌，屬于與食品質(zhì)量提升相關(guān)的小酶種產(chǎn)生菌及酶特性研究領(lǐng)域。本發(fā)明菌株分類命名為變幻青霉(Penicilliumvariabile)JN-A525，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.5763。本菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列其氨基酸序列為SEQIDNO:1。該菌所產(chǎn)的EC降解酶，最適pH相對較寬為4.0-6.0，最適溫度為50℃，該菌產(chǎn)生的酶在模擬黃酒(乙醇15%，EC3%，pH4.4)條件下對氨基甲酸乙酯(EC)有相對較強(qiáng)的水解能力，所產(chǎn)EC降解酶有在清酒、黃酒、米酒等發(fā)酵食品中去除已產(chǎn)生的微量EC與MC的應(yīng)用潛力，可與酸性脲酶聯(lián)合使用，使許多發(fā)酵食品的質(zhì)量品質(zhì)和安全性得到較好的提升。
文檔編號C12R1/80GK102676399SQ201210125030
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者吳延濤, 田亞平, 谷曉蕾 申請人:江南大學(xué)