專利名稱：調(diào)控斑馬魚卵黃蛋白原mRNA水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種檢驗(yàn)有機(jī)污染物對(duì)水生生物毒害或干擾的方法，尤其涉及到一種檢驗(yàn)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的方法，屬于水生生物類雌激素干擾物的檢驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生態(tài)環(huán)境中的化學(xué)污染物質(zhì)干擾人類和野生動(dòng)物的內(nèi)分泌功能，從而對(duì)個(gè)體的生殖、發(fā)育和性行為等產(chǎn)生多方面的影響，甚至?xí)绊懙饺祟惖纳娣毖?Tilghman S L，Nierth-Simpson E N， Wallace R， et al.Environmental hormones !Multiple pathwaysfor response may lead to multiple disease outcomes[J]. Steroids,2010,75 (8-9)520-523)。因而國(guó)際組織和發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)內(nèi)分泌干擾危害效應(yīng)監(jiān)控實(shí)行強(qiáng)制管理，如聯(lián)合國(guó) GHS(全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度)和歐盟REACH(化學(xué)物質(zhì)注冊(cè)、評(píng)估、授權(quán)和限制)法規(guī)1907/2006 (EC)中均對(duì)內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)提出了明確管控要求。VTG是卵黃蛋白的前體，通常受循環(huán)的內(nèi)源性雌激素刺激，由雌性卵生脊椎動(dòng)物肝臟產(chǎn)生，由血流進(jìn)入卵巢，并被發(fā)育中的雌性配子吸收并改變。它是直接通過雌激素受體調(diào)節(jié)途徑來合成的，一般只在成熟雌魚體內(nèi)合成，而在幼魚或成年雄魚體內(nèi)含量很低，難以檢測(cè)出。但在受外源性的雌激素的刺激下，肝臟能夠合成并分泌VTG ;而芳香酶通過抑制轉(zhuǎn)化內(nèi)源性雄激素為天然雌激素170-雌二醇，會(huì)引起VTG水平的降低。因此，通過測(cè)量VTG水平的變化，能夠探索不同化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾作用機(jī)制。全氟碳化合物(PFCs)已成為重要的持久性有機(jī)污染物(POPs)，廣泛分布于環(huán)境、野生動(dòng)物和人類中。其中代表性的全氟辛燒磺酰基化合物(PerfIuorooctanesulphonate,PF0S)、全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PF0A)以及它們的衍生物已成為新型持久性有機(jī)污染物質(zhì)，可以通過呼吸和食物被生物體攝取，有很高的生物蓄積性，可能具有內(nèi)分泌干擾毒性、遺傳毒性、肝臟毒性等(Jensen A A, Leffers H. Emerging endocrine disrupters perfluoroalkylated substances [J]. International Journal of Andrology,2008,31(2) :161-169 ；Clarke B 0, Smith S R. Review of ‘emerging’organic contaminantsin biosolids and assessment of international research priorities for theagricultural use of biosolids [J]. Environment International,2011,37 (I)226-247)，其工業(yè)生產(chǎn)已于2000年禁止。在2009年5月4日-8日在瑞士日內(nèi)瓦召開的“有關(guān)持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約”會(huì)議上，鑒于PF0S，其鹽化合物以及全氟辛烷磺酰氟等的劇毒性和持久性，將它們列入斯德哥爾摩公約新增受控化學(xué)物質(zhì)范圍。當(dāng)水生生物處于高濃度類雌激素干擾物的外源環(huán)境的毒害或污染下，將顯現(xiàn)出較為明顯的形態(tài)特征變化或生理變化，再結(jié)合采用多種生物標(biāo)記物，可以非常準(zhǔn)確和靈敏的檢驗(yàn)出水生生物是否受到外源環(huán)境中高濃度類雌激素干擾物的毒害或污染。水生生物受到低濃度的類雌激素干擾物的毒害或污染時(shí)，無論是外部的形態(tài)特征還是內(nèi)部的生理指標(biāo)都不會(huì)顯現(xiàn)出較為明顯的變化，此外，現(xiàn)有的用于評(píng)價(jià)類雌激素干擾物對(duì)于水生生物內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的生物標(biāo)志物均不同程度的存在敏感性較差、準(zhǔn)確率較低的缺陷。迄今為止，缺乏一種高靈敏、高準(zhǔn)確率的檢驗(yàn)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究，發(fā)現(xiàn)，在暴露于低劑量的諸如全氟辛燒磺酰基化合物(Perfluorooctanesulphonate, PF0S)或全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PF0A)等類雌激素干擾物時(shí),雖然斑馬魚，特別是雄性斑馬魚體征沒有發(fā)生明顯變化，但其卵黃蛋白原的VTGl和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水平明顯升高，通過這種方法可以靈敏、準(zhǔn)確地確定斑馬魚是否受到外源環(huán)境中低劑量類雌激素干擾物毒害或干擾，由此完成本發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供了一種檢驗(yàn)水生生物是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激 素干擾物毒害或干擾的方法，包括以下步驟(I)分別提取待檢測(cè)水生生物肝臟的總RNA以及對(duì)照水生生物肝臟的總RNA ；(2)對(duì)所提取的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水
平進(jìn)行定量；(3)如果待檢測(cè)樣品卵黃蛋白原的VTG ImRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照樣品卵黃蛋白原的VTGl mRNA的表達(dá)水平，以及/或者待檢測(cè)樣品卵黃蛋白原的VTG3 mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照樣品卵黃蛋白原的VTG3 mRNA的表達(dá)水平，則待檢測(cè)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干染；其中，，待檢測(cè)水生生物與對(duì)照水生生物是同一種水生生物,所述的對(duì)照水生生物是沒有遭受類雌激素干擾物毒害或污染的水生生物。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述的水生生物優(yōu)選為水生魚類，更優(yōu)選為斑馬魚(Brachydanio rerio);特別優(yōu)選的，所述的斑馬魚是雄性斑馬魚(Brachydanio rerio)。斑馬魚(Brachydanio rerio)是淡水水族箱觀賞魚,原產(chǎn)于亞洲,體長(zhǎng)約4公分，具暗藍(lán)與銀色條紋。斑馬魚基因與人類基因的相似度達(dá)到87%，在其身上做藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體，因此廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的研究，日益受到生物學(xué)家的重視。斑馬魚的胚胎是透明的，所以生物學(xué)家很容易觀察到藥物對(duì)其體內(nèi)器官的影響。此外，雌性斑馬魚可產(chǎn)卵200枚，胚胎在24小時(shí)內(nèi)就可發(fā)育成形，這使得生物學(xué)家可以在同一代魚身上進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而研究病理演化過程并找到病因。本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)斑馬魚暴露于低濃度類雌激素干擾物如全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸全氟碳化合物時(shí)，雄性斑馬魚的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水平升高程度比雌性斑馬魚的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水平升高程度更高，表明雄性斑馬魚對(duì)于低濃度類雌激素干擾物更為敏感，因此通過雄性斑馬魚的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水平更易于判定斑馬魚是否受到低濃度類雌激素的毒害或干擾。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述的類雌激素干擾物包括全氟碳化合物、對(duì)特辛基苯酚或17 3 -雌二醇；所述的全氟碳化合物優(yōu)選為全氟辛烷磺?；衔锘蛉了崛蓟衔铮贿M(jìn)一步優(yōu)選的，所述全氟辛烷磺酰基化合物是全氟辛烷磺酸。
在本文中，所用術(shù)語“低濃度類雌激素干擾物”的含義是指濃度為0. I u g .I^1-IOOOii g *L_1的類雌激素干擾物,進(jìn)一步優(yōu)選為濃度為0. I y g L^1-IOO u g .171的類雌激素干擾物，特別優(yōu)選為濃度為IOy g L^l-IOOug L—1的類雌激素干擾物，最優(yōu)選為濃度為10 ii g L—1的類雌激素干擾物。優(yōu)選地，當(dāng)水生生物為斑馬魚時(shí)，斑馬魚的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl的核苷酸序列為SEQ ID No. I所示；斑馬魚的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTG3的核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示。為了對(duì)水生生物肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和VTG3的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量，可以采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR或半定量RT-PCR等方法對(duì)VTGl或VTG3的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量；也可以采用組織芯片和原位雜交技術(shù)檢測(cè)點(diǎn)陣石蠟組織芯片中VTGl或VTG3的mRNA的表達(dá)，再用LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)定量測(cè)試VTGl或VTG3的mRNA表達(dá)水平，這些定量方法或手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通曉。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)所提取的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和VTG3的 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量；其中，所述熒光定量PCR的方法中用于擴(kuò)增目的基因的3對(duì)引物分別如下第I對(duì)引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示；第2對(duì)引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示；第3對(duì)引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示；所述熒光定量PCR的方法中的探針序列分別為SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 10 和 SEQ ID No. 11 所示。本發(fā)明的另一目的在于提供了將水生生物肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGlmRNA和/或VTG3 mRNA的表達(dá)水平作為檢驗(yàn)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌是否受到低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的生物標(biāo)記物的用途；優(yōu)選的，所述的水生生物是水生魚類；進(jìn)一步優(yōu)選為斑馬魚(Brachydanio rerio);更優(yōu)選的,所述的斑馬魚是雄性斑馬魚Orachydaniorerio)。卵黃蛋白原(VTG)是由內(nèi)源性雌激素或外源性雌激素作用下，刺激卵生動(dòng)物肝細(xì)胞(作用于肝雌激素受體)而產(chǎn)生的，經(jīng)血運(yùn)輸?shù)铰殉?，?jīng)過修飾后以卵黃蛋白形式儲(chǔ)存于卵母細(xì)胞，為胚胎的發(fā)育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素、磷和硫等營(yíng)養(yǎng)和功能性物質(zhì)。本發(fā)明將斑馬魚(Brachydanio rerio)暴露于各種不同濃度全氟辛燒磺酸(PFOS)的環(huán)境中，測(cè)定斑馬魚體內(nèi)肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量的PFOS暴露均不同程度地引起雄性和雌性斑馬魚肝臟中VTG mRNA水平升高，說明低濃度PFOS暴露對(duì)斑馬魚的內(nèi)分泌干擾作用明顯，斑馬魚肝臟中VTGl mRNA和/或VTG3 mRNA水平可作為PFOS內(nèi)分泌干擾效應(yīng)評(píng)價(jià)的敏感生物標(biāo)志物；此外，本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露于低濃度全氟辛烷磺酰基化合物后，斑馬魚肝臟中VTG3 mRNA水平響應(yīng)比VTGl更敏感，表明斑馬魚肝臟中VTG3mRNA水平比VTGlmRNA水平更適合作為PFOS內(nèi)分泌干擾效應(yīng)評(píng)價(jià)的敏感生物標(biāo)志物。作為本發(fā)明的一個(gè)具體的應(yīng)用方式，可以分別將斑馬魚體內(nèi)肝臟中所提取的VTGlmRNA和/或VTG3 mRNA作為探針制備成生物芯片，例如基因芯片、組織芯片或細(xì)胞芯片等，采用高通量的方式檢驗(yàn)待檢測(cè)水生生物的肝臟中VTGl mRNA水平和/或VTG3 mRNA水平，再將其與對(duì)照水生生物的肝臟中VTGl mRNA和/或VTG3 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較，從而檢驗(yàn)水生生物內(nèi)分泌是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾?；蛐酒窃谳d體(尼龍膜、玻璃片或硅片等)上按照預(yù)先設(shè)計(jì)的位置高密度有序的排列大批量的核酸探針(也稱DNA芯片或DNA微陣列)，形成高密度點(diǎn)陣，與樣品中的靶分子作用后，通過分子雜交技術(shù)在相同條件下進(jìn)行分子反應(yīng)，采用同位素法、化學(xué)熒光法或化學(xué)發(fā)光法等方法對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行顯示，并采用相應(yīng)的方法進(jìn)行定量。具體到本發(fā)明，可以將水生生物的肝臟中VTGl mRNA或VTG3 mRNA作為探針采用原位點(diǎn)樣法或直接點(diǎn)樣法等方式將探針按照預(yù)先設(shè)計(jì)的位置高密度有序的排列或點(diǎn)樣到尼龍膜載體(或玻璃片、硅片等載體)上，得到基因芯片；從待檢測(cè)的水生生物的肝臟中提取VTGl mRNA或VTG3 mRNA，將所提取的VTGl mRNA或VTG3 mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物的末端用熒光標(biāo)記后與芯片上的探針分子進(jìn)行分子雜交，采用共聚焦熒光掃描儀進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，定量待測(cè)樣品中VTGl mRNA或VTG3 mRNA的表達(dá)水平，再與對(duì)照樣品中的VTGl mRNA或VTG3 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較，就可快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)出待檢測(cè)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾。 組織芯片，又稱組織微陣列，是將大量的組織片有序的排列于載體上而得到的微縮組織切片，用于研究同一基因或蛋白質(zhì)分子在不同細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況，具有體積小、高通量、豐富樣本、快速省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。組織芯片還可以與免疫組化、熒光核酸原位雜交、RNA原位雜交等技術(shù)相結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考以下方法制備組織芯片，包括待測(cè)樣品的收集、芯片的制備、染色及染色后掃描、數(shù)據(jù)處理。其中，制作組織芯片時(shí)多采用石蠟組織芯片，石蠟組織芯片的制作是采用組織芯片制作機(jī)的活檢細(xì)針，從大量供體蠟塊組織中鉆取若干個(gè)圓柱形的組織芯，然后將樣本整齊的放到受體蠟塊中制作組織芯片蠟塊，對(duì)組織芯片蠟塊進(jìn)行切片，再將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上。利用顯微鏡精密的機(jī)械控制功能，進(jìn)行打孔、取樣、點(diǎn)樣、觀察與定位、通過化學(xué)染色或原位雜交，載玻片上所有標(biāo)本的信號(hào)可以同時(shí)顯現(xiàn)出來。與普通切片相比，組織芯片的單次可以同時(shí)對(duì)上百個(gè)樣本進(jìn)行免疫組織化和原位雜交，可以大規(guī)模分析樣本，并具有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)精確性和高效性等優(yōu)點(diǎn)。


圖I示出低濃度PFOS暴露對(duì)雄性斑馬魚肝臟VTGl和VTG3 mRNA水平的影響。圖2示出低濃度PFOS暴露對(duì)雌性斑馬魚肝臟VTGl和VTG3 mRNA水平的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚明確。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。試驗(yàn)例低濃度的全氟辛烷磺酸暴露對(duì)于斑馬魚肝臟VTGl mRNA和VTG3 mRNA表汰水平的影響試驗(yàn)I材料與方法I. I儀器與試劑
儀器熒光定量PCR儀(ABI-7500，ABI公司，美國(guó))，混合型球磨儀(MM400，RETSCH公司，德國(guó))，冷凍離心機(jī)(3_18K，Sigma公司，德國(guó))，渦旋混勻器(IKA MS3 digital，北京德泉興貿(mào)有限公司)；紫外分光光 度計(jì)(UNIC 4802 UV/Vis Spectrophotometen北京德泉興貿(mào)有限公司)；peqSTAR梯度PCR儀(德國(guó)peQLab，北京德泉興貿(mào)有限公司)；微型離心機(jī)(BAYGENE Qspin ，北京德泉興貿(mào)有限公司)。試劑全氟辛焼磺酸(AssayLC-MS 98%，Sigma-Aldrich 公司，美國(guó))；Trizol試劑(CAS 15596-026，Invitrogen Beijing Office);三氯甲焼，異丙醇，乙醇(北京化工廠，分析純)；氧化錯(cuò)(3mm，BioLAB Materials Institute) ；01igo dT (10 u mo I L"1),dNTP (99 % 以上，2. 5mmol L—0，Quant Reverse Transcriptase, IOXRT Buffer,RNase-free H20(TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO. , LTD) ；Taqman Mixture(2X) ROXII (TakaRa,寶生物工程(大連)有限公司)，目的基因和內(nèi)參基因引物和探針(Invitrogen英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)。基因引物和探針設(shè)計(jì)分別如表I。表I目的基因和內(nèi)參基因引物和探針序列
權(quán)利要求
1.一種檢驗(yàn)水生生物是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的方法，其特征在于，該方法包括 (1)分別提取待檢測(cè)水生生物肝臟的總RNA以及對(duì)照水生生物肝臟的總RNA； (2)對(duì)所提取的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGlmRNA和/或VTG3 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量； (3)如果待檢測(cè)樣品卵黃蛋白原的VTGlmRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照樣品卵黃蛋白原的VTGl mRNA的表達(dá)水平，以及/或者待檢測(cè)樣品卵黃蛋白原的VTG3 mRNA的表達(dá)水平高于對(duì) 照樣品卵黃蛋白原的VTG3 mRNA的表達(dá)水平，則待檢測(cè)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾； 其中，待檢測(cè)水生生物與對(duì)照水生生物是同一種水生生物，所述的對(duì)照水生生物是沒有遭受類雌激素干擾物毒害或干擾的水生生物。
2.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的水生生物是水生魚類，優(yōu)選為斑馬魚(Brachydanio rerio);更優(yōu)選的，所述的斑馬魚是雄性斑馬魚(Brachydanio rerio)。
3.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述低濃度類雌激素干擾物的濃度為 0. I ii g L^-1000 U g L—1 ;優(yōu)選為 0. I ii g L^1-IOO U g L—1 ;進(jìn)一步優(yōu)選為10 u g L^1-IOO u g L-1 ;最優(yōu)選為 10 u g L^10
4.按照權(quán)利要求I或3所述的方法，其特征在于所述的類雌激素干擾物包括全氟碳化合物、對(duì)特辛基苯酚或17 3 -雌二醇。
5.按照權(quán)利要求I或4所述的方法，其特征在于所述的全氟碳化合物包括全氟辛烷磺?；衔锘蛉了峄衔?；優(yōu)選的，所述全氟辛烷磺酰基化合物是全氟辛烷磺酸。
6.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的水生生物肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl的核苷酸序列為SEQ ID No. I所示；所述的水生生物肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTG3的核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示。
7.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于在步驟(2)中，采用熒光定量PCR的方法對(duì)所提取的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述熒光定量PCR的方法中用于擴(kuò)增目的基因的3對(duì)引物的核苷酸序列分別為第I對(duì)引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 3和SEQID No. 4所示；第2對(duì)引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示；第3對(duì)引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示；所述熒光定量PCR的方法中的探針序列分別為 SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10 或 SEQ ID No. 11 所示。
9.水生生物肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGlmRNA和/或VTG3 mRNA的表達(dá)水平作為檢驗(yàn)水生生物是否受到低劑量類雌激素干擾物毒害或干擾的生物標(biāo)記物的用途。
10.按照權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述水生生物肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTGl和VTG3的核苷酸序列分別為SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示；所述的水生生物是水生魚類，優(yōu)選為斑馬魚(Brachydanio rerio);更優(yōu)選的,所述的斑馬魚是雄性斑馬魚(Brachydanio rerio);所述的類雌激素干擾物包括全氟碳化合物、對(duì)特辛基苯酹或17 3-雌二醇；所述的全氟碳化合物包括全氟辛烷磺?；衔锘蛉了峄衔?；優(yōu)選的，所述全氟辛烷磺?；衔锸侨镣榛撬?。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)控斑馬魚卵黃蛋白原mRNA水平的方法，用來檢驗(yàn)低濃度類雌激素干擾物對(duì)水生生物毒害或干擾，該方法包括(1)分別提取待檢測(cè)水生生物以及對(duì)照水生生物肝臟的總RNA；(2)對(duì)所提取的肝臟總RNA中的卵黃蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量；(3)如果待檢測(cè)樣品卵黃蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照樣品卵黃蛋白原的VTG1mRNA或VTG3mRNA的表達(dá)水平，則待檢測(cè)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾。本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確、靈敏的檢驗(yàn)出水生生物是否受到外源環(huán)境中低濃度的類雌激素干擾物的毒害或干擾，具有靈敏性好、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于水生生物類雌激素干擾物的檢驗(yàn)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102660644SQ201210126800
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者于文蓮, 周新, 崔媛, 程艷, 謝文平, 陳會(huì)明 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院