專利名稱：一種從雞血中提取大量高純度dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及，尤其涉及的是一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法。
背景技術(shù)：
提取高質(zhì)量、高濃度和高純度的基因組DNA是開展分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要技術(shù)步驟，從動(dòng)物血液中提取基因組DNA，具有不殺死動(dòng)物，經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。常規(guī)血液DNA的提取方法多采用苯酚氯仿法提取，這種方法具有耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)試劑毒性大，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。而試劑盒提取費(fèi)用相對(duì)較高，提取的DNA純度和濃度均低，只適合近期實(shí)驗(yàn)的需要，提取的DNA量較少不利于多次反復(fù)使用；且由于提取量少，提取的DNA容易降解不易長(zhǎng)期保存利 用，時(shí)間稍長(zhǎng)就不能進(jìn)行下游PCR擴(kuò)增反應(yīng)。為了更有效、快速地提取高質(zhì)量高濃度的雞血基因組DNA，在借鑒和改進(jìn)前人工作的基礎(chǔ)上，研究建立了一種從雞血中快速大量提取高質(zhì)量基因組DNA的方法，現(xiàn)將試驗(yàn)過(guò)程報(bào)道如下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法，包括以下步驟吸取100 ill解凍的DNA保存液保存的雞血樣品100 u I到含300 u I試劑X的I. 5ml離心管中；用移液槍反復(fù)垂懸，直到使原血樣變?yōu)槌吻宓囊后w狀；4000rpm離心5min，棄掉上清液；加入Iml的試劑Y,輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入I的Rnase A,混勻后，37°C溫浴30min ;加入250 V- I的5mol/L高氯酸鈉，手動(dòng)振蕩混合IOmin ;55°C水浴20min,期間每隔5min手工晃動(dòng)一次；加入300 ill預(yù)冷的三氯甲烷，混合5min ；12000r/min離心5min，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動(dòng)，即可見(jiàn)絮狀DNA ;用預(yù)冷的75%乙醇洗滌2次，晾干，用適量的TE溶解，4°C存放一周，轉(zhuǎn)至_20°C長(zhǎng)期保存；所述的DNA 保存液TrisCl 3. 03g,,Na2EDTA 9. 31g，SDS 2. 50g 加水?dāng)嚢枞芙?，定容?50ml ；所述的試劑X配制方法將lmol/LTrisCl (pH 8. 0), lmol/LMgCl2,體積百分比10%的Triton X-100按比例混合，再加入一定量的蔗糖，使混合液中各成分的終濃度為10mmol /T, Tris Cl ；0. 32mol/L 鹿糖；5mmoI /T, MgCl2 ； I % Triton X-100 ;然后用 NaOH 調(diào)整pH值至8.0，高壓滅菌；所述的試劑Y配制方法將lmol/LTrisCl、pH 8. 0,0. 5moI/LNa2EDTA按比例混合，再加入一定量的NaCl固體和水，使混合液中各成分的終濃度為400mmol/L TrisCl ；60mmol/L Na2EDTA ；150mmol/L NaCl。然后高壓滅菌。再加入一定量的10% SDS，使SDS在試劑Y混合液中的質(zhì)量百分比濃度為I%。采用上述方案提取DNA耗時(shí)較短、提取的DNA樣品純度高，A260Jk280rm在I.696-1. 857，濃度大(100 yl雞血可提取46. 317 iig DNA)、質(zhì)量好，能完全滿足下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。


圖I為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雞血中提取的基因組DNA結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的方法為一種快速、高效的從雞血中提取高純度、大濃度的基因組DNA的方法。I、雞血樣品的制備雞翅下靜脈采血后與等體積的DNA保存液(配方見(jiàn)主要試劑的配制部分)混勻，-20°C低溫保存。2、提取DNA的主要試劑及配制所用試劑為:TrisCl，Sucrose,MgCl2, Triton X-100, NaOH, Na2EDTA, NaCl，SDS,NaClO4 H2O, RNaseA0(1)0嫩保存液1'1^8(1 3. 03g,,Na2EDTA 9.31g，SDS 2. 50g加水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?50ml。(2) lmol/LTrisCl :在800ml水中溶解121g Tris堿，用濃鹽酸調(diào)pH值到8. 0，加水至1L。(3) lmol/L MgCl2 :20. 3g MgCl2 6H20 加水至 100ml。(4) 0. 5moI/LNa2EDTA (pH 8.0):在 800ml 水中加入 186. Ig 的 EDTA,用 NaOH (約20g)調(diào)pH值至8. 0,定容至1L。高壓滅菌。(5)10% SDS :在 900ml 水中加入 100g SDS，加熱至 68°C助溶，加 HCl 調(diào) pH 為 7. 2，
定容至1L，用濾器過(guò)濾以除菌。(6)試劑 X 配制將 lmol/L TrisCl (pH 8. 0)，lmol/L MgCl2,10% (體積百分比)的Triton X-100按比例混合,再加入一定量的固體鹿糖(Sucrose),使混合液中各成分的終濃度為:10mmol /T, Tris Cl ；0. 32mol/L Sucrose 5mmol/L MgCl2 ； I % TritonX-IOO0 然后用NaOH調(diào)整pH值至8. 0，高壓滅菌。(7)試劑 Y 配制將 lmol/LTrisCl (pH 8. 0)，0. 5moI/LNa2EDTA 按比例混合，再加入一定量的NaCl固體和水，使混合液中各成分的終濃度為400mmol/L TrisCl ；60mmol/LNa2EDTA ；150mmol/L NaCl。然后高壓滅菌。再加入一定量的10% SDS，使SDS在試劑Y混合液中的質(zhì)量百分比濃度為1%。(8) 5mol/L 高氯酸鈉(NaClO4) :70. 24g NaClO4 H2O 溶解于 IOOml 水中。(9) 10mg/ml RNaseA IOOmg RNaseA 加水到 10ml,分裝后忙存在 _20°C冰箱中。(10) TE (pH 8.0) :2ml I. 0mol/L TrisCl (pH 8. 04)和 400 y I 0. 5mol/LNa2EDTA(pH 8.0)混合，加水定容至200ml。高壓滅菌。3基因組DNA的提取方法與步驟吸取100 U I解凍的DNA保存液保存的雞血樣品100 Ul到含300 U I試劑X的、I.5ml離心管中；用移液槍反復(fù)垂懸，直到使原血樣變?yōu)槌吻宓囊后w狀；4000rpm離心5min，棄掉上清液；加入Iml的試劑Y,輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入I的RnaseA,混勻后，37°C溫浴30min ;加入250 的5mol/L高氯酸鈉，手動(dòng)振蕩混合IOmin ;55°C水浴20min,期間每隔5min手工晃動(dòng)一次；加入300ii I預(yù)冷的三氯甲燒,混合5min ；12000r/min離心5min，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動(dòng)，即可見(jiàn)絮狀DNA ；用預(yù)冷的75% (v v)乙醇洗滌2次，晾干，用100-200 ill的TE溶解，4°C存放一周，轉(zhuǎn)至-20°C長(zhǎng)期保存。4提取的DNA的濃度和純度的檢測(cè)結(jié)果參考圖1，圖I為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雞血中提取的基因組DNA結(jié)果，可見(jiàn)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶單一，清晰，無(wú)拖尾及掛孔等現(xiàn)象，表明提取的DNA純度較高。參考表I，采用本方法提取的雞血基因組DNA的純度A26cimiA28cinm在I. 696-1. 857之間，平均值為I. 791，本方法用雞血量?jī)H100 iil，但可一次提取到31. 3-58. 2 ii g左右的基因組DNA，平均值為46. 317。利用提取的雞血DNA進(jìn)行PCR特異性基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增效果理想，該方法提取的DNA樣品能滿足雞基因組方面研究的要求。與傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法相比，該方法提取DNA耗時(shí)短(平均I. 2h)、提取的DNA純度高、濃度大、實(shí)驗(yàn)試劑以及成本低，是一種較好的雞血DNA提取方法。表I本方法提取的100份雞血基因組DNA純度和提取總量結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟吸取IOOiU解凍的DNA保存液保存的雞血樣品100 u I到含300 u I試劑X的I. 5ml離心管中；用移液槍反復(fù)垂懸，直到使原血樣變?yōu)槌吻宓囊后w狀；4000rpm離心5min,棄掉上清液；加入Iml的試劑Y,輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入5 ii I的RnaseA,混勻后,37°C溫浴30min ;力口A 250 ii I的5mol/L高氯酸鈉，手動(dòng)振蕩混合IOmm ;55°C水浴20min,期間每隔5min手工晃動(dòng)一次；加入300 ill預(yù)冷的三氯甲烷，混合5min ；12000r/min離心5min，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動(dòng)，即可見(jiàn)絮狀DNA ;用預(yù)冷的75%乙醇洗滌2次，晾干，用適量的TE溶解，4°C存放一周，轉(zhuǎn)至_20°C長(zhǎng)期保存； 所述的DNA保存液=TrisCl 3. 03g,，Na2EDTA9. 31g，SDS 2. 50g加水?dāng)嚢枞芙?，定容?50ml ； 所述的試劑X配制方法:將ImoVLTrisCl (pH 8. 0)，lmol/LMgCl2，體積百分比10%的Triton X-100按比例混合，再加入一定量的蔗糖，使混合液中各成分的終濃度為10mmol/LTris Cl ;0. 32mol/L 蔗糖；5mmol/L MgCl2 ；1% Triton X-100 ;然后用 NaOH 調(diào)整 pH 值至.8.0,聞壓滅囷； 所述的試劑Y配制方法將lmol/L TrisCUpH 8.0,0. 5mol/L Na2EDTA按比例混合，再加入一定量的NaCl固體和水，使混合液中各成分的終濃度為400mmol/LTriSCl ；60mmol/LNa2EDTA ；150mmol/L NaCl。然后高壓滅菌。再加入一定量的10% SDS，使SDS在試劑Y混合液中的質(zhì)量百分比濃度為1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法，包括以下步驟吸取解凍的DNA保存液保存的雞血樣品到含試劑X的離心管中；用移液槍反復(fù)垂懸，直到使原血樣變?yōu)槌吻宓囊后w狀；離心，棄掉上清液；加入試劑Y，輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入Rnase A，混勻后，37℃溫浴30min；加入5mol/L高氯酸鈉，手動(dòng)振蕩混合10min；水浴，期間每隔5min手工晃動(dòng)一次；加入預(yù)冷的三氯甲烷，混合5min；離心，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動(dòng)，即可見(jiàn)絮狀DNA；用預(yù)冷的75％乙醇洗滌2次，晾干，用適量的TE溶解，4℃存放一周，轉(zhuǎn)至-20℃長(zhǎng)期保存；本發(fā)明提取DNA耗時(shí)較短、提取的DNA樣品純度高，濃度大、質(zhì)量好，能完全滿足下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102660537SQ20121012692
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者劉麗仙, 苗永旺, 霍海龍, 霍金龍 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)