專利名稱：一種高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
竹黃如ffi/wsicoJa)又名竹花、竹赤團(tuán)子、竹三七、竹苗等,系一種特異寄生于某些竹子嫩枝上的真菌，藥用為其子座，是一種民間藥材，具有止咳祛痛、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)利濕、補(bǔ)中益氣、活血補(bǔ)血、散瘀通經(jīng)等功效，可用于治療虛寒胃痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氣管炎、百日咳、坐骨神經(jīng)痛、跌打損傷及貧血頭痛等病癥。竹紅菌素是竹黃最主要生物活性成分，竹紅菌素的生理功能主要有抗菌消炎，抗病毒和抗腫瘤。竹紅菌素在光照下可以抑制多咱革蘭氏陽(yáng)性菌(如枯草桿菌Bacillus subtil is、短小芽孢桿菌Bacillus pumi lusdb京棒狀桿菌Corynebacterium pekinensis、黃色八疊球菌Staphyococcus flava、白色葡萄球菌Staphylococcus albus)的生長(zhǎng)。竹紅菌素能明顯殺滅HIV病毒,且具有良好的抗單純性皰疹I(lǐng)型病毒和Sindbis病毒活性。竹紅菌素及其衍生物對(duì)于Hela細(xì)胞、EMT-6、內(nèi)植S-180、肝腫瘤細(xì)胞和人體惡性上皮癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞均有顯著的殺滅作用。目前可以通過液態(tài)發(fā)酵或者固態(tài)發(fā)酵來獲得竹紅菌素，但報(bào)道較少，且產(chǎn)量不高。雖然人們已經(jīng)篩選出了一些產(chǎn)茈醌類色素的菌株并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但產(chǎn)量還是普遍較低，中國(guó)發(fā)明專利200510010612. X分離了一株真菌Ascomycetes Hypomyces,其固態(tài)發(fā)酵10天的產(chǎn)量?jī)H為0. 2%左右。中國(guó)發(fā)明專利200910237409. 4分離得到的一株毛竹種子內(nèi)生真菌菌株26°C液態(tài)發(fā)酵144小時(shí)的產(chǎn)量約為0. 17%。中國(guó)發(fā)明專利200710132510. 4竹紅菌素72小時(shí)的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量約為0. 07%,固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量約為0. 8%。黃坤和李聰?shù)热搜芯苛酥顸S人工培養(yǎng)，但其固態(tài)發(fā)酵7天后的產(chǎn)量?jī)H為0. 05%左右(黃坤，李聰，陳遠(yuǎn)騰，朱洪友，陳永寬.微生物發(fā)酵產(chǎn)生茈醌類化合物和甘露醇的工藝研究.云南化工，2003，30: 31-34.)。陳佳佳等人進(jìn)行了無性型竹黃菌株產(chǎn)竹紅菌素的研究，其每升產(chǎn)量為色價(jià)52的粗品Sg，折合成純品濃度小于0. 01 %，而且發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)96h(陳佳佳，李兆蘭，焦慶才.竹黃無性型菌株產(chǎn)竹紅菌素的研究.中草藥，2006，37: 48-50.)。林海萍等人對(duì)竹黃菌生物學(xué)性狀和人工培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了探索性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可能由于培養(yǎng)基中缺少某些竹子特有的成分，竹黃菌在人工培養(yǎng)條件下無法合成竹紅菌素(林海萍，陳聲明.一種值得開發(fā)利用的藥用真菌一竹黃.浙江林業(yè)科技，2002，22:77-80.)。綜上所述，現(xiàn)有的菌種產(chǎn)量還較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。針對(duì)當(dāng)前的問題，本發(fā)明從浙江安吉竹林中篩出一株高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株并對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定和產(chǎn)物分析，結(jié)果表明固態(tài)最高產(chǎn)量可達(dá)3%，液態(tài)發(fā)酵72小時(shí)產(chǎn)量可達(dá)0. 35%，具有顯著的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株，可通過固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)竹紅菌素，同時(shí)還能產(chǎn)生痂囊腔菌素。它們的結(jié)構(gòu)參見如下論文
[1]Lousberg,R. J. ,C. A. Salemink,U. Weiss,and Batterha. Tj (1969) Pigmentsof Elsinoe species. Part II. Structure of elsinochromes A,B, and C. Journal ofthe Chemical Society C-Organic. 1219-1227.
[2]Lousberg, R. J. ,C. A. Salemink,and U. Weiss (1970) Pigments of Elsinoespecies. Part V. The structure of elsinochrome D. Journal of the ChetnicalSociety C-Organic. 2159-2162.
[3]Diwu, Z. J. , and J. ff. Lown (1990) Hypocrellins and their use inphotosensitization. Photochem. Photobiol. 52: 609-616.
本發(fā)明的技術(shù)方案一株高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株，其分類命名為竹黃菌{Shiraiabambusicola WW67)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC M 2012127，保藏日期為4月22日。進(jìn)一步地，該菌株的核苷酸序列為SEQ ID NO : I。更進(jìn)一步地，該菌株的主要代謝產(chǎn)物為竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。進(jìn)一步地，該菌株可利用的碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、纖維素、大米中的一者或幾者的組合。更進(jìn)一步地，該菌株可利用的氮源為無機(jī)銨鹽、無機(jī)硝酸鹽、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米漿、豆餅粉中的一者或幾者的組合。采集浙江安吉竹林著生于短蕙竹上的竹黃子實(shí)體。要求個(gè)體肥大，表面呈淺粉紅色，沒有龜裂、無膠質(zhì)分泌的幼嫩子實(shí)體作為分離材料。將大小合適的竹黃子實(shí)體首先用無菌水洗滌干凈，然后用預(yù)先配置好的75%濃度的酒精溶液浸泡I 一 2分鐘，待酒精揮發(fā)干后，將竹黃子實(shí)體進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌的解剖刀將其內(nèi)部組織切割成綠豆大小的顆 粒植于分離瓊脂平板表面，在無菌條件下將其輕輕壓入瓊脂中培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)后真菌以植入點(diǎn)為中心向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)而分離。分離用培養(yǎng)基為馬鈴薯200g、葡萄糖10g、瓊脂20g、水lOOOmL、青霉素20mg，竹葉汁20g，pH值自然。26°C恒溫，培養(yǎng)4_5天。初篩后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)竹紅菌素的能力相差很大。選擇菌落色澤較深的菌落進(jìn)行復(fù)篩培養(yǎng)。最終得到產(chǎn)竹紅菌素能力最強(qiáng)的竹黃新菌株{Shiraia bambusicola WW67)。本發(fā)明涉及到的菌種有如下特征
I.竹黃菌{Shiraia bambusicola WW67)的培養(yǎng)條件
該菌種的培養(yǎng)常規(guī)條件是好氣培養(yǎng)。用于培養(yǎng)菌種的糖質(zhì)原料碳源可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、玉米、甜菜、纖維素或大米等材料。培養(yǎng)用氮源可以是無機(jī)銨鹽、無機(jī)硝酸鹽或蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿、豆餅粉等有機(jī)氮源。該菌種的生長(zhǎng)溫度范圍為10°C _33°C，最佳生長(zhǎng)溫度為26°C -28°C。pH范圍為4_9，最佳pH范圍為5. 5-7. 3。在菌種培養(yǎng)過程中還可添加磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鈣、氯化鈉等無機(jī)鹽類。竹黃菌{Shiraiabambusicola WW67)的形態(tài)描述
平板培養(yǎng)形態(tài)Shiraia bambusicola 在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)3d，菌落呈圓形，干燥，疏松，邊緣較平整，直徑平均為4. 2cm ;氣生菌絲白色，絨毛狀，中間的氣生菌絲較邊緣發(fā)達(dá)；菌落基部培養(yǎng)基呈紅色，外緣白色；菌落邊緣較平整；背面培養(yǎng)基中間部分呈紅色，系菌體分泌的色素。色素在培養(yǎng)基上呈暗紅色，可形成環(huán)狀同心圓，中間顏色較深，邊緣顏色較淺。色素圈的直徑約占菌落直徑的40% 95%。顯微鏡下可見菌絲有隔，間距不等，呈管狀，直徑2. 8 5.5 iim，有分支。孢子約I. Iiim左右。竹黃菌{Shiraia bambusicola WW67)的分子生物學(xué)特征見序列表。竹黃菌{Shiraiabambusicola WW67)的產(chǎn)物說明
Shiraia bambusicola WW67主要代謝產(chǎn)物為竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D?？刹捎贸Ｒ?guī)的固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵方法，利用上述菌種產(chǎn)生竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、 痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。培養(yǎng)基可用含有不同碳源、氮源、無機(jī)離子等普通培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中也添加適量的對(duì)所使用的微生物生長(zhǎng)特別需要的營(yíng)養(yǎng)物。一般情況，這些營(yíng)養(yǎng)物存在于上述的天然營(yíng)養(yǎng)源中。該菌株固態(tài)發(fā)酵過程中，I天后開始產(chǎn)茈醌類化合物，10天后產(chǎn)量達(dá)最高峰。液態(tài)發(fā)酵過程中，24小時(shí)后開始產(chǎn)茈醌類化合物，72小時(shí)產(chǎn)量達(dá)最高。竹黃菌bambusicola f勝7),已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC M 2012127，保藏日期為4月22日。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。實(shí)施例I
發(fā)酵菌株為竹黃菌bambusicola WW67)，采用液態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基組為葡萄糖2%、酵母膏0.5%、]\%504*71120 0. 05%,K2HPO4 0. 05%、pH 為 6. 0，接種量 10%，發(fā)酵溫度28°C，250ml三角瓶裝液量20%。3天發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分別為0. 22%，0. 032%, 0. 02%,0. 014%, 0. 12%,0. 021%。實(shí)施例2
發(fā)酵菌株為竹黃菌bambusicola WW67)，采用液態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基組為果糖2%、蛋白胨 0. 5%、MgS04 7H20 0. 05%, KH2PO4 0. 05%、pH 為 7. 0，接種量 10%，發(fā)酵溫度30°C，250ml三角瓶裝液量20%。3天發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分別為0. 38%，0. 02%, 0. 015%，0. 01%, 0. 11%，0. 03%。實(shí)施例3
發(fā)酵菌株為竹黃菌bambusicola WW67)，采用液態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基組為蔗糖3%、牛肉膏 0. 5%, MgSO4 7H20 0. 03%, KH2PO4 0. 04%、pH 為 5. 0，接種量 10%，發(fā)酵溫度26°C，250ml三角瓶裝液量20%。3天發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分別為0. 22%, 0. 01%, 0. 014%，0. 02%, 0. 10%,0. 023%。
實(shí)施例4
發(fā)酵菌株為竹黃菌CS6iraia bambusicola WW67),采用液態(tài)發(fā)酵,培養(yǎng)基組為乳糖4%, NH4NO3 0. 6%,MgSO4 7H20 0. 03%, KH2PO4 0. 04%、pH 為 9. 0，接種量 10%，發(fā)酵溫度33°C，250ml三角瓶裝液量20%。2天發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分別為0. 09%, 0. 01%, 0. 01%,0. 02%, 0. 05%, 0. 013%。實(shí)施例5
發(fā)酵菌株為竹黃菌bambusicola WW67),采用液態(tài)發(fā)酵,培養(yǎng)基組為半乳糖I %、尿素 0. 6%、MgSO4 7H20 0. 03%, KH2PO4 0. 02%、pH 為 4. 0，接種量 10%，發(fā)酵溫度IO0C，250ml三角瓶裝液量20%。2天發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分別為0. 04%, 0. 005%, 0. 002%,0. 01%, 0. 02%, 0. 003%。 實(shí)施例6
發(fā)酵菌株為{Shiraia bambusicola WW67)，采用固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基組成(重量％) :30目的玉米粉68. 7，麩皮8，米糠20，葡萄糖1，KH2P040. 25，MgS047H20 0. 05 ;加水拌料潤(rùn)濕，裝入廣口瓶中，0. IMPa滅菌45-60min，冷卻后接入液體種子拌均。發(fā)酵溫度28°C，pH6，10天發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵培養(yǎng)基中竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分別為2. 2%, 0. 5%, 0. 3%, 0. 11%，I. 1%, 0. 02%。實(shí)施例7
發(fā)酵菌株為{Shiraia bambusicola WW67)，采用固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基組成(重量％) :60目的大米粉68. 7，麩皮8，米糠20，果糖1，KH2P040. 25，MgS047H20 0. 05 ;加水拌料潤(rùn)濕，裝入廣口瓶中，0. IMPa滅菌45-60min，冷卻后接入液體種子拌均。發(fā)酵溫度30°C，pH6，10天發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵培養(yǎng)基中竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素 D 的含量分別為2. 5%, 0. 1%, 0. 2%, 0. 21%，I. 1%, 0. 12%。上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株，其分類命名為竹黃菌CSXiraia bambusicola■”，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2012127。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的竹黃菌株，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的竹黃菌株，其特征在于其主要代謝產(chǎn)物為竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的竹黃菌株，其特征在于其可利用的碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、纖維素、大米中的一者或幾者的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的竹黃菌株，其特征在于其可利用的氮源為無機(jī)銨鹽、無機(jī)硝酸鹽、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米漿、豆餅粉中的一者或幾者的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株，其分類命名為竹黃菌(ShiraiabambusicolaWW67)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC No.M2012127，保藏日期為4月22日。該菌株的核苷酸序列為SEQ ID NO1。該菌株的主要代謝產(chǎn)物為竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102703328SQ201210127338
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者崔佳龍, 曹軍, 蔡宇杰, 金大勇 申請(qǐng)人:蘇州維因生物科技有限公司