專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)基因玉米mir604及其衍生品種的lamp檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因植物品種的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，具體涉及轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織近期發(fā)表的《2010年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)》報(bào)告顯示，由于轉(zhuǎn)基因作物帶來(lái)的巨大益處，過(guò)去15年內(nèi)大約有I億人次的農(nóng)民做出種植決定。自轉(zhuǎn)基因作物投入商業(yè)化種植15年來(lái),全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積累計(jì)已經(jīng)超過(guò)10億公頃。2010年,全球29個(gè)國(guó)家的1540萬(wàn)農(nóng)民種植了共I. 48億公頃的轉(zhuǎn)基因作物。自1996年至2010年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了 87倍。種植轉(zhuǎn)基因作物排名前十位的國(guó)家種植面積首次均超過(guò)了 100萬(wàn)公頃。這些國(guó)家按照作物種植面積的大小排列分別是美國(guó)(6680萬(wàn)公頃)、巴西(2540萬(wàn)公頃)、阿根廷(2290萬(wàn)公頃)、印度(940萬(wàn)公頃)、加拿大(880萬(wàn)公頃)、中國(guó)(350萬(wàn)公頃)、巴拉圭(260萬(wàn)公頃)、巴基斯坦(240萬(wàn)公頃)、南非(220萬(wàn)公頃)和烏拉圭(110萬(wàn)公頃)。目前，世界各國(guó)已進(jìn)行田間試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因作物超過(guò)5000種，批準(zhǔn)商品化的轉(zhuǎn)基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、木瓜、甜菜、煙草、水稻等。轉(zhuǎn)基因玉米作為目前世界上最主要的轉(zhuǎn)基因作物之一，占全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積的30%以上，僅次于轉(zhuǎn)基因大豆。從世界范圍看，轉(zhuǎn)基因玉米的推廣已經(jīng)帶來(lái)了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。然而轉(zhuǎn)基 因玉米在帶來(lái)巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也存在許多問(wèn)題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性方面，包括對(duì)人和動(dòng)物健康的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)非目標(biāo)生物的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)第一種風(fēng)險(xiǎn)，1993年，聯(lián)合國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與合作組織(OECO)提出了食品安全性評(píng)估的“實(shí)質(zhì)等同性”原則。如果準(zhǔn)基因作物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實(shí)質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的。最早提出對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一個(gè)法案，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)簽說(shuō)明；1999年，要求出口到歐盟的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有1%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標(biāo)識(shí)的最低限量降低到O. 9%。日本，澳大利亞，新西蘭對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同規(guī)定，域值從I 5%不等。我國(guó)于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，于2002年I月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)，標(biāo)識(shí)和進(jìn)口安全管理三個(gè)配套管理辦法，確定了第一批實(shí)施標(biāo)識(shí)管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實(shí)施。為了能夠?qū)D(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品做出綜合評(píng)價(jià)，除了需要各國(guó)政府和國(guó)際機(jī)構(gòu)制定科學(xué)的安全評(píng)價(jià)體系以及嚴(yán)格的管理法規(guī)外，建立有效的方法體系對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測(cè)也很重要，這是對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)和實(shí)施監(jiān)管的基礎(chǔ)，也是農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易健康發(fā)展的重要保障。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)要求方法要快速，準(zhǔn)確，靈敏，并且還得考慮適應(yīng)大樣品量，目標(biāo)基因種類(lèi)多等特點(diǎn)。因此，目前轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)主要是檢測(cè)樣品是否含有外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)產(chǎn)物)和是否含有外源基因(DNA)。轉(zhuǎn)基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試紙條檢測(cè)、Western雜交等方法檢測(cè)，主要從待測(cè)樣品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基質(zhì)，利用與目的蛋白(抗原)特異性結(jié)合的特性，通過(guò)偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，但是這種方法要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，只能作為輔助檢測(cè)手段。轉(zhuǎn)基因作物的核酸檢測(cè)方法主要有兩種核酸分子雜交技術(shù)(Sourthernblot) ,PCR檢測(cè)技術(shù)。其中PCR檢測(cè)方法是最主要,最準(zhǔn)確地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR方法，熒光定量PCR方法等等。目前，國(guó)內(nèi)外推廣使用的是定性PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。通過(guò)聚合酶的作用，在體外快速特異地?cái)U(kuò)增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增到百萬(wàn)倍，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后很容易觀察，因而具有快速 靈敏等優(yōu)點(diǎn)。然而，PCR方法反應(yīng)體系和操作過(guò)程比較復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)人員；所需PCR儀價(jià)格在5萬(wàn)元左右，擴(kuò)增時(shí)間2 3小時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果的電泳時(shí)間需要I小時(shí)左右；電泳常用染料EB為強(qiáng)致癌物質(zhì)，有較強(qiáng)毒性，且難以實(shí)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。所以，在科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中均需要一種快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermal Amplification,以下簡(jiǎn)稱(chēng)LAMP法)是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社于2000年前后開(kāi)發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未有將LAMP法應(yīng)用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試引物組。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種基于上述檢測(cè)引物組與檢測(cè)試劑盒的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組，包括外引物I、外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示
外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No 1)；
外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No 2)；
內(nèi)引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3);
內(nèi)引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分
(!)引物液含有上述的引物組，濃度分別為4 6μ M外引物1、4 6μΜ外引物2，32 48μΜ內(nèi)引物1、32 48 μ M內(nèi)引物2 ；
(2)反應(yīng)液含有IOmMdNTPUOXThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是7 9 :4 6 :2 ;
(3)DNA聚合酶濃度為7 9υ/μ I ;
(4)對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
優(yōu)選的，所述引物液中含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2。優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I。優(yōu)選的，所述反應(yīng)液中，IOmM dNTP : 10XThermoPol反應(yīng)緩沖液150mM MgS04 =8 5 2體積比。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒中還可以含有顯色齊U，所述顯色劑為熒光染料SYBRGreen I。利用以上所述的試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的方法，包括如下步驟
(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化樣品DNA；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù)2min ；
(3)結(jié)果判斷通過(guò)觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。在試劑盒中含有顯色劑的情況下，在(2)得到的產(chǎn)物中加入I 2μ I顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。其中，常規(guī)CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR604 DNA的方法為
(1)取轉(zhuǎn)基因玉米MIR604約IOOmg,放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎,液氮反復(fù)加入3 4次，磨碎成粉末為止；
(2)加入I.5ml預(yù)熱至65°C的CTAB提取緩沖液，充分混合、懸浮試樣，65°C保育30min，期間不停顛倒混勻；
(3)約12000g離心lOmin。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管,加入I倍體積的苯酹氯仿異戍醇(25:24:1)，充分混合，約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；
(4)加入I倍體積的氯仿異戊醇(24:1)，充分混合，約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清
至一新離心管中；
(5)加入2倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫靜置保育60min；12000g離心15min，棄上清；加入350 μ I氯化鈉溶液溶解沉淀；12000g離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管；
(6)加入O.6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min，12000g離心15min，棄上清，加入500 μ 170%乙醇溶液，并顛倒離心管數(shù)次，12000g離心lOmin，棄上清；
(7)干燥DNA沉淀，加100μ ITE緩沖液溶解DNA。本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP法)，根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的四條引物能特異性識(shí)別靶基因序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖一環(huán)DNA混合物。采用4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63 65°C對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)需在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間依據(jù)模板DNA質(zhì)量變化,一般為90min或更少,在60 90min的短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率可以達(dá)到IO9 101°個(gè)拷貝數(shù)。加入模板DNA，在63 65°C反應(yīng)60 90min后,在80°C保藏2min,終止反應(yīng)。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需要熱循環(huán),且由于擴(kuò)增是在恒溫條件下進(jìn)行，因此不需要PCR儀等昂貴儀器。在反應(yīng)中，在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中Mg離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀。本發(fā)明具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等有益效果
(1)快速高效整個(gè)擴(kuò)增只用60 90min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9 101°個(gè)拷貝；
(2)操作簡(jiǎn)便不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒定溫度儀就能反應(yīng)和檢測(cè)，條件比較溫和；
(3)高特異性本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處設(shè)計(jì)了四條特異性引物，應(yīng)用上述四條引物，擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)域，具有很強(qiáng)的品系特異性，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行；
(4)高靈敏度最低檢測(cè)極限可達(dá)到10個(gè)拷貝；
(5)鑒定簡(jiǎn)便可通過(guò)觀察觀察加入SYBRGreen I顏色變化或者是否存在焦磷酸鎂沉淀來(lái)判斷擴(kuò)增與否，無(wú)需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。


圖I是實(shí)施例I的檢測(cè)結(jié)果圖(1-4 :待檢樣品；5 :陽(yáng)性對(duì)照；6 :陰性對(duì)照)；
圖2是實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果圖(1、2 :待檢樣品；3 :陰性對(duì)照，4 :陽(yáng)性對(duì)照)；
圖3是實(shí)施例3的檢測(cè)結(jié)果圖(1-6依次為5%、0· 5%、0· 1%、005%、0· 01%、O. 005%的樣品DNA，7 :陰性對(duì)照8 :陽(yáng)性對(duì)照)；
圖4是實(shí)施例4的檢測(cè)結(jié)果圖(1-20依次為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、BT176、BTlUEVENT98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21，轉(zhuǎn)基因大豆 M0N89788，轉(zhuǎn)基因水稻BT63，轉(zhuǎn)基因土豆EH92-527-1，轉(zhuǎn)基因油菜T45，轉(zhuǎn)基因棉花GHB614，非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、小麥、油菜、棉花)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。如無(wú)特殊說(shuō)明，以下實(shí)施例中的“％”均指質(zhì)量百分比。
實(shí)施例I含顯色劑的試劑盒及其檢測(cè)方法
轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括引物液、反應(yīng)液、DNA聚合酶、對(duì)照和顯色劑(1)引物液:含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μ M內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2，四條引物為
外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No :1)
外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No :2)
內(nèi)引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3)
內(nèi)引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)
(2)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I ;
(4)對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液；
(5)顯色劑熒光染料IX SYBR Green I。用上述試劑盒按以下方法對(duì)待測(cè)玉米品種進(jìn)行檢測(cè)
(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化待測(cè)樣品DNA；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于65°C反應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)2min ；
(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入2μI顯色劑，混勻，若顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，橙色則為陰性。本實(shí)施例中，陰性對(duì)照顯現(xiàn)橙色，陽(yáng)性對(duì)照顯現(xiàn)綠色，待檢樣品1、2的PCR管顯綠色(圖I中管1、2)，表明待檢玉米種子樣品1、2中含有或全部為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種，含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR604成分，待檢樣品3、4的PCR管顯橙色(圖I中管3、4)，則表明待檢樣品3、4中不含轉(zhuǎn)基因玉米MIR604成分。參照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中檢測(cè) MIR604 品系的引物 MIR604 primer F: GCGCACGCAATTCAACAG (SEQ ID No 5), MIR604 primer R:GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT (SEQ ID No :6)和探針 MIR604 Probe: FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA (SEQ ID No :7)進(jìn)行熒光定量PCR檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果與上述LAMP方法
結(jié)果相一致。實(shí)施例2不含顯色劑的試劑盒及其檢測(cè)方法
試劑盒中除缺少實(shí)施例I中的顯色劑外，其余同實(shí)施例I。用上述試劑盒按以下方法對(duì)待測(cè)玉米品種進(jìn)行檢測(cè)
(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化待測(cè)樣品DNA；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于65°C反應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)2min ；(3)結(jié)果判斷將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng)，觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則為陽(yáng)性，無(wú)沉淀則為陰性。本實(shí)施例中，陰性對(duì)照無(wú)沉淀，陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生沉淀，待檢樣品I的PCR管出現(xiàn)沉淀(圖2管1)，表明待檢玉米種子樣品I中含有或全部為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種，含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR604成分。待檢樣品2的PCR管沒(méi)有出現(xiàn)沉淀(圖2管2)，表明待檢樣品2中不含轉(zhuǎn)基因玉米MIR604成分。參照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中檢測(cè) MIR6O4 品系的引物 MIR604 primer F: GCGCACGCAATTCAACAG (SEQ ID No 5), MIR604 primer R:GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT (SEQ ID No :6)和探針 MIR604 Probe: FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA (SEQ ID No :7)進(jìn)行熒光定量PCR檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果與上述LAMP方法
結(jié)果相一致。實(shí)施例3 PCR反應(yīng)與本發(fā)明檢測(cè)方法靈敏度的比較
按下列配方制備轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒 Cl)引物液:含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40 μ M內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2，四條引物為
外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No :1)
外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No :2)
內(nèi)引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3)
內(nèi)引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)
(2)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I ;
(4)對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液；
(5)顯色劑熒光染料IX SYBR Green I。用上述試劑盒按以下方法對(duì)確定為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的待測(cè)玉米品種進(jìn)行檢測(cè)
(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化待測(cè)樣品DNA，分別稀釋成5%、0.5%、O. 1%、0· 05%、O. 01%、O. 005% 的樣品 DNA ；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于65°C反應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)2min ；
(3)結(jié)果判斷將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng)，觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則有擴(kuò)增，無(wú)沉淀則無(wú)擴(kuò)增。也可以在(2)中得到產(chǎn)物中加入I μ I顯色劑，混勻，肉眼觀察。無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈現(xiàn)黃色，有擴(kuò)增反映的管子變成綠色。本實(shí)施例中，陽(yáng)性對(duì)照、5%、0· 5%、0· 1%、0· 05%,0. 01%、0· 005%均出現(xiàn)沉淀顯示為有擴(kuò)增，陰性對(duì)照無(wú)沉淀顯示為無(wú)擴(kuò)增；加入顯色劑后，陽(yáng)性對(duì)照、5%、0. 5%、0. 1%、0. 05%、O. 01%,O. 005%的PCR管顯綠色，陰性對(duì)照管子呈現(xiàn)黃色(見(jiàn)圖3)。
PCR反應(yīng)引物采用上述LAMP反應(yīng)中的外引物I和外引物2。PCR反應(yīng)為25 μ I體系，10XPCR Buffer (PCR 反應(yīng)緩沖液，Promega 公司)2· 5 μ 1，IOmM dNTPs (Promega 公司)O. 5μ 1，上、下游引物分別對(duì)應(yīng)外引物I和外引物2，各O. 5μ l，Taq酶(5υ/μ I ,Promega公司)0. 5 μ 1，DNA模板I μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)至25 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸30s，72 °C延伸7min。PCR產(chǎn)物取10 μ I與2%瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下40min，通過(guò)凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，對(duì)應(yīng)條帶分別為M，DL600 DNAMarker (DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，最大DNA片段為600堿基對(duì))；1，陽(yáng)性對(duì)照；2，5% ； 3,0. 5% ；4，O. 1% ； 5,0. 05% ； 6,0.01%； 7,0. 005% ； 8，陰性對(duì)照。其中 PCR 方法的靈敏度為O. 05%,而6，7顯示為陰性結(jié)果。由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的試劑盒的靈敏度的結(jié)果可以達(dá)到O. 005%的濃度，而PCR方法的靈敏度為O. 05%，而O. 01%或以下顯示為陰性結(jié)果；經(jīng)比對(duì)，本發(fā)明的試劑盒及方法靈敏度明顯高于PCR方法的敏感度，能檢測(cè)出更低含量的樣品。實(shí)施例4特異性實(shí)驗(yàn)
用實(shí)施例I的鑒定方法分別對(duì)分離純化的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、BT176、BTlUEVENT98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21，轉(zhuǎn)基因大豆 M0N89788，轉(zhuǎn)基因水稻BT63，轉(zhuǎn)基因土豆EH92-527-1，轉(zhuǎn)基因油菜T45，轉(zhuǎn)基因棉花GHB614，非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、小麥、油菜、棉花進(jìn)行鑒定，同時(shí)參照EU Reference Laboratory for GM Food andFeed 中檢測(cè) MIR604 品系的引物 MIR604 primer F: GCGCACGCAATTCAACAG(SEQ ID No 5),MIR604 primer R: GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT (SEQ ID No :6)和探針 MIR604 Probe:FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA (SEQ ID No :7)進(jìn)行熒光定量 PCR 檢驗(yàn)。鑒定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因玉米BT176、BTlU EVENT98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21，轉(zhuǎn)基因大豆 M0N89788，轉(zhuǎn)基因水稻 BT63，轉(zhuǎn)基因土豆 EH92-527-1，轉(zhuǎn)基因油菜T45，轉(zhuǎn)基因棉花GHB614，非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、小麥、油菜、棉花反應(yīng)管均為橙色，即無(wú)擴(kuò)增；轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的反應(yīng)管為綠色，即有擴(kuò)增(見(jiàn)圖4)。本結(jié)果與EUReference Laboratory for GM Food and Feed中的突光定量PCR結(jié)果相一致，顯不出良好的特異性。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組，包括外引物I、外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No 1)；外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No 2)；內(nèi)引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3);內(nèi)引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)。
2.轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分 Cl)引物液含有權(quán)利要求I所述的引物組，濃度分別為4 6μΜ外引物1、4 6μΜ外引物2,32 48μΜ內(nèi)引物1、32 48μΜ內(nèi)引物2 ； (2)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是7 9 :4 6 :2 ; (3)DNA聚合酶濃度為7 9υ/μ I ; (4)對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述引物液中含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/ μ I。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)液中，IOmM dNTP : 10XThermoPol反應(yīng)緩沖液150mM MgS04 = 8 :5 :2體積比。
6.利用權(quán)利要求2 5任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的方法，包括如下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化樣品DNA； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù)2min ； (3)結(jié)果判斷通過(guò)觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 5任一項(xiàng)所述的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于還含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYBRGreen I。
8.利用權(quán)利要求7所述的試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化樣品DNA； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù)2min ；(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入I 2μ I顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。檢測(cè)引物組包括四條特異性引物；檢測(cè)試劑盒包括引物液、反應(yīng)液、DNA聚合酶和對(duì)照；試劑盒還可以有顯色劑。其檢測(cè)方法是通過(guò)提取待檢玉米品種的DNA、采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63～65℃對(duì)樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，短時(shí)間擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010個(gè)拷貝，其鑒定采用加入SYBRGreenI觀察顏色變化或者利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化判斷擴(kuò)增與否，確定待檢玉米品種是否含有或?yàn)檗D(zhuǎn)基因玉米MIR604及其衍生品種。本發(fā)明具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102634588SQ20121012876
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者凌莉, 劉津, 莊陽(yáng)陽(yáng), 李志勇, 石磊, 肖艷文 申請(qǐng)人:廣州迪澳生物科技有限公司