專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及偽狂犬病毒技術(shù)領(lǐng)域，具體地講，涉及一種重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株及其制備方法，以及用含該重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株的基因工程疫苗。
背景技術(shù)：
偽狂犬病毒(Psedorabiesvirus,PRV)屬于抱疫病毒(Herpesviridac) α 抱疫病毒亞科(Alphaher-pesririnae)水痕病毒屬(Varicello virus)的抱疫病毒 I 型(Porcineherpesvirus Typel),能引發(fā)豬的嚴(yán)重疾病。同時(shí),豬既是偽狂犬病毒的忙存者，也是偽狂犬病毒的傳染源，控制豬偽狂犬病不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)本身，而且對(duì)其它動(dòng)物的養(yǎng)殖也有著十分重要的意義。疫苗免疫接種是預(yù)防控制與消滅偽狂犬病的根本措施。 早期的豬偽狂犬疫苗主要是弱毒疫苗和滅活疫苗。早期弱毒疫苗都是通過(guò)非豬源細(xì)胞的反復(fù)傳代，或雞胚接種傳代，或在某些致突變劑的存在下，在高于通常培養(yǎng)溫度的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)物上反復(fù)繼代獲得。目前常用的豬偽狂犬病弱毒疫苗有匈牙利Bartha-K/61株、羅馬尼亞BC株、美國(guó)的BUK株和Norden株，其它如MK-21、MK-35、ALF0RT-26、NIA-4等。弱毒疫苗(天然基因缺失疫苗)雖然在偽狂犬病免疫防制方面有一定的效果，但是其毒力返強(qiáng)的可能性很大，并能導(dǎo)致疾病的流行。未經(jīng)充分致弱或過(guò)度致弱的疫苗株不僅不能誘導(dǎo)滿(mǎn)意的免疫保護(hù)反應(yīng)，反而可能引起疾病及免疫抑制；弱毒疫苗可建立潛伏感染，并存在散毒的危險(xiǎn)，而且部份接種豬雖然血清中存在中和抗體，但帶毒期卻可持續(xù)數(shù)年。滅活疫苗是將強(qiáng)毒株在BHK-21、IBRS-2等細(xì)胞上培養(yǎng)，用甲醛滅活制得，它克服了弱毒疫苗的缺點(diǎn)。但滅活疫苗用量大，有時(shí)導(dǎo)致注射部位腫脹等不良反應(yīng)。此后，隨著對(duì)偽狂犬病毒研究的深入，特別隨著是分子生物學(xué)理論和技術(shù)的進(jìn)步，從上世紀(jì)80年代初開(kāi)始，世界各國(guó)相繼啟動(dòng)了偽狂犬基因缺失疫苗的研究。偽狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技術(shù)在PRV基因組中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特別是一些毒力基因)不能表達(dá)，從而使PRV的毒力減弱，同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性。第一代基因缺失疫苗主要是缺失TK基因。TK基因是偽狂犬病毒主要的毒力基因，其編碼的胸腺嘧啶核苷激酶是核酸代謝中的重要酶類(lèi)，催化脫氧胸腺嘧啶核苷的磷酸化反應(yīng)，合成dTMP。雖然TK是核苷酸代謝的重要酶類(lèi)，其缺失對(duì)病毒的生長(zhǎng)有一定的影響，但并非病毒DNA復(fù)制所必需的基因。TK缺失不僅不影響病毒的免疫原性，而且還極大地降低了病毒的毒力。此外，TK缺失突變株毒力返強(qiáng)的可能性很低。總之，TK是偽狂犬病毒最重要的毒力基因之一，目前構(gòu)建的偽狂犬病毒基因工程疫苗大多為T(mén)K缺失突變株。第一代基因缺失疫苗的代表毒株有BUK-dl3，NIA-3，ADV_783，Begonia等毒株。其中BUK-dl3是世界上第一個(gè)獲得批準(zhǔn)使用的基因工程缺失疫苗株，它是以PPV BUK株為起始材料，通過(guò)缺失TK基因序列的148bp而獲得。BUK疫苗株是將其親本病毒通過(guò)雞胚細(xì)胞傳代800代以上獲得的，其US區(qū)的gE基因存在缺失。因此，BUK-dl3除了 TK基因缺失外，還有來(lái)自BUK疫苗株的gE缺失。該毒株在細(xì)胞培養(yǎng)物上，即使在含有HAT的選擇條件下也不能回復(fù)為T(mén)K+。第二代基因缺失疫苗是在TK缺失疫苗的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，如TK_/gE_，TKVgr,TK_/gG_等，它們比TK缺失的疫苗更優(yōu)越。原來(lái)的TK缺失疫苗只能采用核酸雜交、限制性?xún)?nèi)切酶指紋圖譜、空斑放射自顯影等技術(shù)同野毒株區(qū)別。第二代基因缺失疫苗除TK缺失夕卜，在編碼非必需糖蛋白的基因內(nèi)引入一個(gè)新的缺失，或插入一個(gè)報(bào)告基因，這樣得到的突變株不能產(chǎn)生缺失糖蛋白，免疫動(dòng)物后不能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，因此可以通過(guò)血清學(xué)方法將免疫按種豬與自然感染野毒的豬相互區(qū)別。Marchioli C C等和Van Zijl M等分別構(gòu)建了缺失TK和gG基因的PRV疫苗株和缺失TK和gE基因的疫苗株(783株)。Mettenleiter T C等報(bào)道，在建立表達(dá)PRV gD基因細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，從PRV的BamHI-7片段中缺失了 5. Ikb的片段(含有g(shù)G、gD、gE、gI基因的編碼序列)，構(gòu)建出了 PRV的gG_/gD7gE7gI_的四基因缺失株P(guān)RV 376株。顏其貴等構(gòu)建了 PRV Fa gI_/gD_基因缺失株，小鼠試驗(yàn)證實(shí)缺失株對(duì)小鼠具有一 定的免疫原性。周復(fù)春等構(gòu)建了一系列基因缺失株(PRV Ea TK—、TK7LacZ+、TK7gG7LacZ+
坐')
寸/ οLiu Z等將LacZ基因表達(dá)試劑盒插入到PRV Ea株基因組的gE區(qū)，通過(guò)藍(lán)斑篩選和純化，得到了 TK_/gE7LacZ+PRV。利用LacZ基因處的EcoRI酶切位點(diǎn)來(lái)消化PRV Ea TK7gE7LacZ+基因組DNA，并與質(zhì)粒pFBBS在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。經(jīng)過(guò)蝕斑純化得到了TKVgEVgDTRV0通過(guò)小鼠試驗(yàn)表明，此TK_/gE_/gD_PRV的毒力明顯減弱。目前國(guó)內(nèi)有兩種豬偽狂犬基因缺失苗已獲新獸藥證書(shū)并投放市場(chǎng)，即四川農(nóng)大郭萬(wàn)柱教授主持研發(fā)的豬偽狂犬活疫苗(S215株)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春教授主持研發(fā)的的豬偽狂犬活疫苗(HB98株)。第三代基因缺失疫苗是以第一、第二代基因缺失苗作為載體，表達(dá)其它病毒抗原性基因，從而可以防治多種疾病。此項(xiàng)研究目前正是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。其首要問(wèn)題是解決安全性和免疫效果的難關(guān)，但其前景受到普遍看好。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，得利于PRV基因缺失苗和相應(yīng)鑒別診斷方法的應(yīng)用，該病已得到控制或根除；但在發(fā)展中國(guó)家，該病仍頻繁發(fā)生，嚴(yán)重制約了這些國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。就我國(guó)的實(shí)際情況看，PRV在我國(guó)的根除顯然不是一個(gè)短期能實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)，PRV基因缺失苗在現(xiàn)在及將來(lái)更長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)都會(huì)有廣闊的市場(chǎng)前景。而且隨著我國(guó)養(yǎng)殖科技化程度的逐步提高和偽狂犬根除計(jì)劃的逐步開(kāi)展，對(duì)PRV疫苗的需求也會(huì)更加旺盛。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上雖然存在數(shù)種豬偽狂犬基因缺失苗，但進(jìn)口疫苗售價(jià)高昂，而國(guó)產(chǎn)疫苗品質(zhì)并不盡如人意，市場(chǎng)對(duì)于物美價(jià)廉的高品質(zhì)國(guó)產(chǎn)疫苗的需求極為迫切。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明分離了和鑒定了豬偽狂犬病毒株，命名為PRV-GDXX，并以豬偽狂犬病毒⑶XX株為母本，通過(guò)分子生物學(xué)手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶(PRV TK)基因和gE基因，獲得重組病毒PRV/TK7gE_，以該重組病毒為疫苗毒株研制生產(chǎn)安全高效的豬用偽狂犬活疫苗。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株，該病毒株的保藏名稱(chēng)為豬偽狂犬病毒GDXX株TK/gE雙基因缺失病毒PRV/TK7gE_ ;保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏日期2012年3月I日；保藏號(hào)為CCTCC V201212所述的重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株的構(gòu)建方法，包括如下步驟(I)分離和鑒定豬偽狂犬病毒株，命名為PRV-GDXX ；(2) TK缺失用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建以PRV-GDXX基因組為模板，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增TK同源重組左臂Ltk ;和右臂Rtk ;用EcoRI酶切pUC19，補(bǔ)平后連接轉(zhuǎn)化，獲得消除EcoRI位點(diǎn)的pUC19/E ；同樣方法消除HindIII，獲得質(zhì)粒PUC19/HE ；以KpnI/Xbal雙酶切Ltk和pUC19/HE，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒pUC19/HE-LTK ;再以Xbal/SphI酶切Rtk和pUC19/HE_LTK，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒PUC19/HE-TK ;消除pUC19/HE-TK中的KpnI位點(diǎn)，即為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PUC19/HEK-TK ;用 XbaI 酶切 pUC19/HEK_TK，補(bǔ)平；同時(shí)依次用 SspI 和 StuI 酶切 pcDNA3/EGFP，補(bǔ)平；將補(bǔ)平后的兩片段連接轉(zhuǎn)化，獲得TK缺失用轉(zhuǎn)移載體pUC19-TK/EGFP。
·
(3) gE缺失用轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建以PRV-GDXX基因組為模板，設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)擴(kuò)增gE同源重組左臂LgE和右臂RgE ；以KpnI/Xbal雙酶切LgE和pUC19/HE，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒pUC19/HE-LgE ;再以Xbal/SphI酶切RgE和pUC19/HE_LgE，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒pUC19/HE-gE ;消除pUC19/HE-gE中的KpnI位點(diǎn)，即為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19/HEK_gE ;用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，補(bǔ)平；同時(shí)依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，補(bǔ)平；將補(bǔ)平后的兩片段連接轉(zhuǎn)化，獲得gE缺失用轉(zhuǎn)移載體pUC19-gE/EGFP ；(4) TK缺失重組病毒拯救轉(zhuǎn)染在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BHK21細(xì)胞，待BHK21細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；取PRV-GDXX病毒基因組約3ug，與約Iug轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19-TK/EGFP混合后轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)僅含轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的對(duì)照組；鑒定PRV_GDXX基因組與pUC19_TK/EGFP共轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變及熒光蛋白表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后盲傳兩代，仍有細(xì)胞病變和綠色熒光，初步判斷重組病毒拯救成功；重組病毒經(jīng)噬斑純化和PCR鑒定，命名為PRV/TK7EGFP。將PRV/TK_/EGFP基因組與pUC19-TK/HEK共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞裂解物盲傳兩代，出現(xiàn)無(wú)綠色熒光細(xì)胞病變可初步判斷重組病毒拯救成功，經(jīng)同樣方法純化、鑒定，獲得重組病毒PRV/TK_ ；(5) TK/gE雙基因缺失重組病毒拯救轉(zhuǎn)染在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；取PRV/TK-病毒基因組約3ug，與約Iug轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)僅含轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的對(duì)照組；鑒定PRV/TK_基因組與pUC19_gE/EGFP共轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變及熒光蛋白表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后盲傳兩代，仍有細(xì)胞病變和綠色熒光，初步判斷重組病毒拯救成功；重組病毒經(jīng)噬斑純化和PCR鑒定，命名為PRV/TK_/gE_/EGFP ;將PRV/TK_/gE_/EGFP基因組與pUC19-gE/HEK共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞裂解物盲傳兩代，出現(xiàn)無(wú)綠色熒光細(xì)胞病變可初步判斷重組病毒拯救成功,經(jīng)同樣方法純化、鑒定,獲得重組病毒PRV/TK_/gE_。


圖I、偽狂犬病毒gE基因CDS序列PCR擴(kuò)增電泳圖，其中M為DL2000 ;1為PCR產(chǎn)物；
圖2、TK缺失轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖；圖3、gE缺失轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖；圖4、左右重組臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，其中A DL-2000 B :左重組臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(Ltk) C :右重組臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(Rtk)；圖5、左右重組臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；A :DL_2000 B :左重組臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(LgE) C :右重組臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(Rse)；圖6、純化后重組病毒感染ST細(xì)胞熒光觀察；A :純化后PRV/TK7EGFP感染ST細(xì)胞B :純化后PRV/TK_感染ST細(xì)胞；圖7、重組病毒感染ST細(xì)胞熒光觀察；A PRV/TK7gE7EGFP感染ST細(xì)胞B =PRV/TK_/gE_感染ST細(xì)胞；圖8、重組病毒 PCR 檢測(cè)；A :DL_2000 Marker B =Regfp 和 Fkfp 引物擴(kuò)增 PRV/TK7gEVEGFP病毒基因組 C RgE和Fse引物擴(kuò)增PRV/TK_/gE_/EGFP病毒基因組D RgE和FgE引物擴(kuò)增PRV/TK_/gE_病毒基因組；圖9、PRV-GDXX, PRV/ΤΓ 和 PRV/TK_/gE_ 感染 ST 細(xì)胞的增殖曲線；圖10、首次免疫后四周免疫豬的全病毒抗體水平；圖11、第二次免疫后二周免疫豬的全病毒抗體水平；圖12、第二次免疫后四周免疫豬的全病毒抗體水平。
具體實(shí)施例方式除另有說(shuō)明外，本申請(qǐng)中所有的科技術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方式，而不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)發(fā)明進(jìn)行改動(dòng)得到的技術(shù)方案都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。在本申請(qǐng)中，如無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施都使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在下了文件中有詳細(xì)描述Sambrook 等人編著的 Molecular Cloning Alaboratory Mannual,第二版(1989) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames 和 S. J. Higgin 編著，1984)；Immnochemical Methods in Cell And Molecular Biology(Academic Press, London)。實(shí)施例一豬偽狂犬病毒⑶XX株的分離和鑒定I材料與方法I. I試驗(yàn)材料2007年6月，廣東省新興縣某豬場(chǎng)發(fā)生疑似偽狂犬感染病例，我們從可疑病料提取病豬腦組織；PRV陽(yáng)性血清，PRV陰性血清和PRV強(qiáng)毒(⑶XX株)、BHK21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。I. 2病料處理無(wú)菌取病豬腦部與PBS (0. 1M，pH7. 2)以I : 5 (V/V)制成勻漿，反復(fù)凍融3次，3000rpm離心15min，取上清加雙抗，37°C作用18h，經(jīng)0. 45um濾膜除菌，得到病料濾液，保存?zhèn)溆谩. 3Babl/c小鼠接種試驗(yàn)與結(jié)果
取10只6周齡Balb/c小鼠，其中4只腹腔注射病料濾液O. 2ml/只，另4只背部脊柱附近皮下注射病料濾液O. 2ml/只。接種后觀察小鼠的采食、飲水、精神狀況和臨床表現(xiàn)。小鼠接種病料濾液后12小時(shí)，表現(xiàn)精神沉郁、扎堆，其中2只出現(xiàn)后肢麻痹，可能是病毒侵入神經(jīng)所致；48小時(shí)后4只小鼠被毛逆立；60小時(shí)后6只小鼠死亡,72小鼠后全
部小鼠死亡。I. 4細(xì)胞接種試驗(yàn)與細(xì)胞病變觀察結(jié)果接種O. 5ml病毒濾液于長(zhǎng)成單層的BHK21細(xì)胞，連續(xù)觀察，直至出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)橹?。病料濾液接種BHK21細(xì)胞后18小時(shí)后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變細(xì)胞腫脹，變圓，逐步空 泡化，48小時(shí)后細(xì)胞脫落。I. 5分離毒的毒價(jià)測(cè)定BHK21細(xì)胞在96孔板上長(zhǎng)成單層。分離病毒做10倍系列稀釋(10-1-10-10)，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔O. 1ml，同時(shí)設(shè)兩孔空白對(duì)照。記錄各個(gè)梯度的病變數(shù)，連續(xù)觀察5天。Karver法計(jì)算出分離毒的TCID50。不同稀釋度的病毒在96孔板BHK21細(xì)胞單層出現(xiàn)CPE，結(jié)果見(jiàn)表3，計(jì)算該病毒毒價(jià)為 107. 5TCID50/0. 1ml。表3分離毒的毒價(jià)測(cè)定結(jié)果
~Si~~SS~~CPEt~~CPEz~ 累計(jì)總數(shù) ~CPEt~稀釋度孔數(shù)CPE+ CPE 一百分比
______ (%)
10—1__8__8__O__60__O__100
10—2__8__8__O__52__O__100
10—3__8__8__O__44__O__100
10—4__8__8__O__36__O__100
Γ 10—588O38O100-------
10—6__8__8__O__20__O__100
10—7__8__8__O__12__O__100
10—8__8__3__5__4__5__44
10—9__8__I__7__I__12__8
-10-1(1 |8|θ|8|θ|2θ|θI. 6微量中和試驗(yàn)鑒定分離毒(固定病毒稀釋血清法)將PRV陰性血清與陽(yáng)性血清分別進(jìn)行10倍系列稀釋(ΚΓ-ΙΟ,)。加入等量200TCID5(I分離毒，37°C感作I小時(shí)。分別接種96孔板單層PK-15細(xì)胞，每孔O. 1ml，每個(gè)稀釋度接種8孔，設(shè)I孔空白對(duì)照和I孔標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒對(duì)照(200TCID5(i)。記錄各個(gè)梯度的細(xì)胞病變數(shù)，連續(xù)觀察5天。PRV陽(yáng)性血清能特異性中和分離毒，抑制細(xì)胞病變，說(shuō)明所分離的病毒為偽狂犬病毒。
I. 7PRV gE基因CDS序列擴(kuò)增設(shè)計(jì)PRV gE基因⑶S序列擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件見(jiàn)表I和表2，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后測(cè)序表I引物序列表
引物571 酶切位大小目的片段---—--—--
Fke GAATTCATGCGGCCCTTTCTGCTGCG EcoRI^
------1734 gE基因CDS序列
RgE GGTACCTTAAGCGGGGCGGGCATTCA KpnI___ 表2 gE基因⑶S擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
_反應(yīng)體系__反應(yīng)條件_
PRV ⑶XX 株基因組 DNA Iul94°C3min I cycle
2XGC Buffer I (5mM Mg2+ plus) 25ul98°CIOsec
FgE 0. 5ul60°C30sec 30 cycles
RgE 0. 5ul72°C2. 5min_
dNTP Mixture (2. 5mM each) 12ul72°C7min I cycleTaKaRa LA Taq (5U/ul) 0. 5ul
dH20_10. 5ulI %瓊脂糖電泳鑒定PCR結(jié)果如圖1，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增片段長(zhǎng)1734bp，與genebank上登錄的gE Q)S序列同源性為97_99%。2結(jié)果與分析本申請(qǐng)人從廣東省新興縣某豬場(chǎng)病豬腦組織提取病科濾液。將該病毒濾液接種Balb/c小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死亡率100% ;接種BHK21細(xì)胞，18小時(shí)后細(xì)胞變圓、空泡化；豬的偽狂犬病毒陽(yáng)性血清能特異性地中和該分離病毒。PRV gE基因引物能擴(kuò)增1734bp gE基因CDS序列,測(cè)序結(jié)果證實(shí)該病毒為豬偽狂犬病毒,其與genebank上登錄的gE CDS序列同源性為97-99%。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，我們分離到一株野生豬偽狂犬強(qiáng)毒，命名為廣東新興株(GDXX)。該毒株是我們進(jìn)行下一步基因缺失活疫苗研制的母本毒株。實(shí)例二豬偽狂犬病毒⑶XX株TK/gE雙基因缺失株P(guān)RV/TK_/gE_的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究本申請(qǐng)人以豬偽狂犬病毒⑶XX株(PRV-GDXX)為母本，通過(guò)分子生物學(xué)手段依次缺失TK、gE基因，構(gòu)建了一株重組偽狂犬病毒PRV/TK_/gE_，并對(duì)該重組病毒的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下I、材料與方法I. I、材料I. I. I、病毒和細(xì)胞豬偽狂犬病毒⑶XX株(PRV-GDXX)，BHK21細(xì)胞、ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。I. I. 2、質(zhì)粒和菌株pcDNA3/EGFP由中山大學(xué)程家森博士惠贈(zèng)；pUC19載體與DH5 α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。I. I. 3、工具酶和其它試劑LA Taq DNA 聚合酶、EcoRI、HindIII、BamHI、KpnI、SspI、StuI、XbaI、SphI、AgaroseGEL DNA Purification Kit、DNA Ligation Kit、BKL Kit、Dephospharylation Kit 購(gòu)置TaKaGDXX 公司。LipofectamineTM 2000 購(gòu)自 Invitrogen 公司。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司。I. 2、基因擴(kuò)增I. 2. I、病毒增殖及病毒基因組提取BHK21細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，以5-10PFU/細(xì)胞感染病毒，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)
90%左右收獲病毒；病毒基因組提取方法簡(jiǎn)述如下收集病變細(xì)胞后，用裂解緩沖液(含O. 2mg/ml蛋白酶K)重懸細(xì)胞，37°C孵育至清亮，裂解物用酚、酚氯仿(I I)、氯仿各抽提一次，取上清加2倍體積無(wú)水乙醇，-20°C放置30min，15000rpm離心lOmin，70 %乙醇洗滌DNA沉淀，干燥后將沉淀溶于TE，_20°C保存?zhèn)溆?。I. 2. 2、引物及基因擴(kuò)增參考PRV全基因組序列(BK001744)，合成系列引物，用于擴(kuò)增TK同源重組的左、右臂，用于鑒定TK基因缺失和EGFP插入的引物。引物序列及預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小見(jiàn)表3。表3用于擴(kuò)增TK基因同源臂和檢驗(yàn)TK基因缺失及插入的PCR引物
權(quán)利要求
1.一種重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株，其特征在于，該病毒株的保藏名稱(chēng)為豬偽狂犬病毒GDXX株TK/gE雙基因缺失病毒PRV/TK7gE_ ;保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏日期:2012年3月I H ;保藏號(hào)為=CCTCC V201212。
2.如權(quán)利要求I所述的重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)分離和鑒定豬偽狂犬病毒株，命名為PRV-GDXX； (2)TK缺失用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建以PRV-GDXX基因組為模板，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增TK同源重組左臂Ltk ;和右臂Rtk;用EcoRI酶切pUC19，補(bǔ)平后連接轉(zhuǎn)化，獲得消除EcoRI位點(diǎn)的pUC19/E ；同樣方法消除HindIIl，獲得質(zhì)粒PUC19/HE;以KpnI/Xbal雙酶切Ltk和pUC19/HE，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒pUC19/HE-LTK;再以Xbal/SphI酶切Rtk和pUC19/HE_LTK，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒PUC19/HE-TK;消除 pUC19/HE-TK 中的 KpnI 位點(diǎn)，即為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pUC19/HEK_TK;用 XbaI 酶切PUC19/HEK-TK，補(bǔ)平；同時(shí)依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，補(bǔ)平；將補(bǔ)平后的兩片段連接轉(zhuǎn)化，獲得TK缺失用轉(zhuǎn)移載體pUC19-TK/EGFP; (3)gE缺失用轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建以PRV-GDXX基因組為模板，設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)擴(kuò)增gE同源重組左臂LgE和右臂RgE ；以KpnI/Xbal雙酶切LgE和pUC19/HE，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒pUC19/HE-LgE ;再以Xbal/SphI酶切RgE和pUC19/HE_LgE，回收相應(yīng)片段連接，獲得質(zhì)粒pUC19/HE-gE ;消除pUC19/HE-gE中的KpnI位點(diǎn)，即為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19/HEK_gE ;用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，補(bǔ)平；同時(shí)依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，補(bǔ)平；將補(bǔ)平后的兩片段連接轉(zhuǎn)化，獲得gE缺失用轉(zhuǎn)移載體pUC19-gE/EGFP ； (4)TK缺失重組病毒拯救 轉(zhuǎn)染在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BHK21細(xì)胞，待BHK21細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；取PRV-GDXX病毒基因組約3ug，與約Iug轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19_TK/EGFP混合后轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)僅含轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的對(duì)照組； 鑒定PRV-GDXX基因組與pUC19-TK/EGFP共轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變及熒光蛋白表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后盲傳兩代，仍有細(xì)胞病變和綠色熒光，初步判斷重組病毒拯救成功；重組病毒經(jīng)噬斑純化和PCR鑒定，命名為PRV/TK-/EGFP; 將PRV/TK-/EGFP基因組與pUC19-TK/HEK共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞裂解物盲傳兩代，出現(xiàn)無(wú)綠色熒光細(xì)胞病變可初步判斷重組病毒拯救成功，經(jīng)同樣方法純化、鑒定，獲得重組病毒PRV/TK—； (5)TK/gE雙基因缺失重組病毒拯救 轉(zhuǎn)染在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；取PRV/TK-病毒基因組約3ug，與約Iug轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)僅含轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的對(duì)照組； 鑒定PRV/TK-基因組與pUC19-gE/EGFP共轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變及熒光蛋白表達(dá)情況； 轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后盲傳兩代，仍有細(xì)胞病變和綠色熒光，初步判斷重組病毒拯救成功；重組病毒經(jīng)噬斑純化和PCR鑒定，命名為PRV/TK-/gE-/EGFP ;將PRV/TK_/gE_/EGFP基因組與pUC19-gE/HEK共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞裂解物盲傳兩代，出現(xiàn)無(wú)綠色熒光細(xì)胞病變可初步判斷重組病毒拯救成功，經(jīng)同樣方法純化、鑒定，獲得重組病毒PRV/TK-/gE-。
3.包含如權(quán)利要求I或2所述的重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株的基因工程疫苗。
4.如權(quán)利要求I或2所述的重組豬偽狂犬病毒TK/gE雙基因缺失株在制備豬偽狂犬病毒基因工程疫苗上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明分離了一株豬偽狂犬病毒GDXX株，并以該分離株為母本，通過(guò)分子生物學(xué)手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶(TK)基因和gE基因，獲得重組病毒PRV/TK－/gE－。以該重組病毒為疫苗毒株研制生產(chǎn)安全高效的豬用偽狂犬活疫苗。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102888383SQ20121012887
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者邵定勇, 黃紅亮, 陳瑞愛(ài), 韓靜芳, 唐兆新, 謝小雨, 任常寶, 梁桂益 申請(qǐng)人:肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司, 廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司