專利名稱：一種白色念珠菌的pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)白色念珠菌的PCR方法。
背景技術(shù)：
白色念珠菌(Candida Albicans)又稱白假絲酵母菌,廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病，為條件致病性。白色念珠菌是導(dǎo)致真菌感染的重要致病菌之一，此外它還是重要食源性致病菌。因此建立的白色念珠菌PCR檢測(cè)方法在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)，食品安全檢測(cè)領(lǐng)域都具有重要應(yīng)用價(jià)值。白色念珠菌引起淺表性感染和深部感染，該種菌引起的相關(guān)疾病有皮膚念珠菌病，包括指(趾)間糜爛，多見于長期從事潮濕作業(yè)的人、念珠菌性間擦疹多見于小兒和肥胖多汗者、丘疹形念珠菌病多見于肥胖兒童、念珠菌性甲溝炎、甲床炎多見于指甲；粘膜念珠菌病，包括多見于嬰幼兒患者的鵝口瘡，以及生殖器念珠菌??；而深部感染疾病則包括內(nèi)臟念珠菌病，該感染可累及全身所有內(nèi)臟器官，其中以腸念珠菌病及肺念珠菌病較常見。念珠菌病主要是白色念珠菌引起的急性、亞急性或慢性感染，是最常見的真菌病。常侵犯皮膚、粘膜，也可引起內(nèi)臟或全身感染，臨床癥狀錯(cuò)綜復(fù)雜，急緩不一，兒童多為急性繼發(fā)性感染。近年來隨著大劑量抗生素、激素、免疫抑制劑的應(yīng)用，以及器官移植術(shù)的開展，其發(fā)病率漸趨增高，并可危及生命造成嚴(yán)重后果。目前，有關(guān)白色念珠菌快速檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道多見于國內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在食品檢測(cè)方面尚屬空白。國內(nèi)外也沒有出臺(tái)相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，目前國內(nèi)廣泛采用的方法是，選用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基從待檢樣本中分離培養(yǎng)可能存在的白色念珠菌、再根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落形成情況，借助顯微鏡開展形態(tài)鑒定、配合其他生化特征進(jìn)行鑒定的檢驗(yàn)方法，該方法相對(duì)操作復(fù)雜，檢驗(yàn)周期較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種白色念珠菌的快速檢測(cè)方法，可用于醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)和食品樣本檢驗(yàn)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下
一種白色念珠菌的PCR檢測(cè)用引物的核苷酸序列為上游引物SEQ ID NOl和下游引物SEQ ID N02。一種利用上述引物的白色念珠菌的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟
I)待檢樣品增菌培養(yǎng)。將待檢樣品接種于沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，30°c培養(yǎng)48 72小時(shí)。2 )提取待檢樣品的核酸。
3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)
擴(kuò)增體系每25 μ L擴(kuò)增體系中包含10XPCR緩沖液2. 5 μ L，10 mmol/L dNTP混合液
2.5 μ L ,25 mmol/L MgCl2 2. 5 μ L, 5U/ μ L Taq 聚合酶 O. 2 μ L，25 μ mol/L SEQ ID NOl 和SEQ ID N02各0. 5 μ L，步驟2)所獲核酸溶液I μ L，超純水補(bǔ)體積至25 μ L ;
擴(kuò)增參數(shù)95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于72°C延伸5min。4 )將步驟3 )中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
5)結(jié)果分析若有擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶(235bp)出現(xiàn)則待測(cè)樣品中有白色念珠菌，否則沒有。與現(xiàn)有的傳統(tǒng)白色念珠菌檢測(cè)方法相比，本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)在于
I、特異性高一對(duì)引物對(duì)白色念珠菌的基因組特異性區(qū)域識(shí)別，保證PCR擴(kuò)增的高度特異性，傳統(tǒng)方法則需要鑒別菌落特征、形態(tài)特征和生化試驗(yàn)，進(jìn)行檢測(cè)。2、檢測(cè)周期短對(duì)于未知樣本進(jìn)行檢測(cè)在完成增菌后，4個(gè)小時(shí)即可完成PCR檢測(cè)和結(jié)果的報(bào)告，而傳統(tǒng)方法完成增菌后還要3天以上的時(shí)間。3、穩(wěn)定性高同一樣品經(jīng)不同的人完成檢測(cè)，結(jié)果的一致性強(qiáng)，尤其適用于大規(guī)模、高通量樣品的檢測(cè)分析，一次可以處理幾十個(gè)樣本。


圖I為白色念珠菌PCR檢測(cè)結(jié)果示意 圖2為白色念珠菌PCR檢測(cè)方法特異性實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果 圖中M-DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. I-陽性對(duì)照；1. 2-陰性對(duì)照；1. 3-陰性樣品；
2.I-陰性對(duì)照；2. 2-白色念珠菌；2. 3-光滑念珠菌；2. 4畢赤酵母；2. 5-釀酒酵母；2. 6-異常漢遜酵母。
具體實(shí)施例方式結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，不當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I食品樣品中白色念珠菌的PCR檢測(cè)
取均質(zhì)后待檢樣品25g接種于225mL沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48 72小時(shí)。核酸提取取增菌培養(yǎng)液I. 5 mL置于離心管中，12，OOOrpm離心3min后棄去上清液。加入 400 μ L 細(xì)胞裂解液(50mmol/LTris-HCl，pH8. O, lOmmol/LEDTA, I % β _ 巰基乙醇，10% SDS，lmg/mL蛋白酶K)震蕩混勻，65°C水浴I h至細(xì)胞完全裂解，再加入200 μ L 3mol/LNaAe (pH5. 2),混勻。然后冰水浴5min, 10, OOOrpm離心5min,收集上清液,用RNase A (終濃度為lOOug/mL) 37°C下消化lh，用酚氯仿(I: I)抽提2次后，加入冷凍的2倍體積的無水乙醇，置離心管中10,000 rpm離心10 min,棄掉廢液,開蓋室溫倒置5_10 min至殘留的乙醇完全揮發(fā)，加入30 μ L滅菌超純水溶解，得核酸溶液，-70°C保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增體系的配置和擴(kuò)增參數(shù)擴(kuò)增總體積為25 UL :其中10XPCR緩沖液
2.5 μ L，10 mmol/L dNTP 混合液 2. 5 μ L, 25 mmol/L MgCl2 2. 5 μ L, Taq 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L，25 μ mol/L上下游引物(SEQ ID NOl和SEQ ID N02)各0. 5 μ L，上述步驟所獲核酸溶液I μ L，滅菌超純水補(bǔ)體積至25 μ L0采用的擴(kuò)增參數(shù)為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸35個(gè)循環(huán),最后一個(gè)循環(huán)于72°C延伸5min。電泳檢測(cè)步驟是配制50x TAE電泳緩沖液其pH 8. 5，所含成分40mMTris堿，40mM醋酸，ImMEDTA。
制膠將50x TAE電泳緩沖液稀釋50倍，配制成I x TAE電泳緩沖液，稱取I. 5克瓊脂糖微波爐加熱使其溶于IOOmL的I X TAE電泳緩沖液中，加入I滴Img / mL溴化乙錠，按樣品數(shù)選擇合適的梳子制備凝膠。電泳取5 ii LPCR產(chǎn)物點(diǎn)樣到I. 5%瓊脂糖點(diǎn)樣孔中，同時(shí)使用DL2000的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，按5v/cm的電壓計(jì)算所用電壓，電泳時(shí)間25分鐘，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察。陽性對(duì)照即以陽性質(zhì)粒(pMD-w)為模板進(jìn)行的擴(kuò)增，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。陽性對(duì)照品為克隆有白色念珠菌基因的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒(pMD-w)，由引物SEQ ID NOl和SEQ IDN02擴(kuò)增白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC90029)獲得的核酸片段，與pMD_19載體連接制備而成的，經(jīng)測(cè)定核酸濃度約為600ng/ u L0陰性對(duì)照(以超純水為模板)無擴(kuò)增條帶，說明PCR實(shí)驗(yàn)成立，參照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，待檢樣品未出現(xiàn)235bp的特異條帶，白色念珠菌檢測(cè)結(jié)果為陰性。如圖I所示。實(shí)施例2白色念珠菌的PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)
取白色念珠菌、光滑念珠菌、畢赤酵母、釀酒酵母、異常漢遜酵母做為特異性實(shí)驗(yàn)供試菌株。核酸的提取，取以上菌株用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，后用酵母DNA提取試劑盒(美國Omega公司產(chǎn)品)提取各培養(yǎng)物的核酸作為PCR擴(kuò)增的模板。獲得核酸溶液備用。陽性對(duì)照為克隆有白色念珠菌基因的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒(pMD-w)，由引物SEQ ID NOl和SEQ ID N02擴(kuò)增白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC90029)獲得的核酸片段，與pMD_19載體連接制備而成的。PCR擴(kuò)增體系的配置和擴(kuò)增參數(shù)擴(kuò)增總體積為25iiL:其中10XPCR緩沖液2. 5u L, 10 mmol/L dNTP 混合液 2. 5 u L, 25 mmol/L MgCl2 2. 5 u L, Taq 聚合酶(5U/ u L)
0.L，25iimol/L上下游引物(SEQ ID NOl和SEQ ID N02)各0. 5 y L，上述步驟所獲核酸溶液I U L，超純水補(bǔ)體積至25 u L0采用的擴(kuò)增參數(shù)為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于72°C延伸5min。陽性對(duì)照或陰性對(duì)照的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增參數(shù)與上述的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增參數(shù)基本相同，只是將核酸溶液I U L換為陽性質(zhì)粒(pMD-w) I u L，或超純水I y L。電泳檢測(cè)步驟是
配制50x TAE電泳緩沖液其pH 8. 5，所含成分40mMTris堿，40mM醋酸，ImMEDTA。制膠將50x TAE電泳緩沖液稀釋50倍，配制成I x TAE電泳緩沖液，稱取I. 5克瓊脂糖微波爐加熱使其溶于IOOmL的I X TAE電泳緩沖液中，加入I滴Img / mL溴化乙錠，按樣品數(shù)選擇合適的梳子制備凝膠。電泳取5 u LPCR產(chǎn)物點(diǎn)樣到I. 5%瓊脂糖點(diǎn)樣孔中，同時(shí)使用DL2000的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，按5v/cm的電壓計(jì)算所用電壓，電泳時(shí)間25分鐘，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，如圖2所示。陽性對(duì)照出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，說明PCR實(shí)驗(yàn)成立，參照DNA Marker,結(jié)果白色念珠菌出現(xiàn)特異條帶,而其他菌株均未出現(xiàn)235bp的特異條帶,實(shí)驗(yàn)證明白色念珠菌的PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種白色念珠菌的PCR檢測(cè)用引物，其特征是該引物的核苷酸序列為上游引物SEQID NOl和下游引物SEQ ID N02。
2.一種利用權(quán)利要求I所述引物的白色念珠菌的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟 1)待檢樣品增菌培養(yǎng)； 2)提取待檢樣品的核酸； 3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 擴(kuò)增體系每25 ii L擴(kuò)增體系中包含10XPCR緩沖液2. 5 ii L，10 mmol/L dNTP混合液2.5u L ,25 mmol/L MgCl2 2. 5 u L, 5U/ u L Taq 聚合酶 0. 2 y L，25 u mol/L SEQ ID NOl 和SEQ ID N02各0. 5 ii L，步驟2)所獲核酸溶液I U L，超純水補(bǔ)體積至25 y L ; 擴(kuò)增參數(shù)95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于72°C延伸5min ； 4)將步驟3)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳； 5)結(jié)果分析若有擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶出現(xiàn)則待測(cè)樣品中有白色念珠菌，否則沒有。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述白色念珠菌的PCR檢測(cè)方法，其特征是步驟I)中所述增菌培養(yǎng)是將待檢樣品接種于沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48 72小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述白色念珠菌的PCR檢測(cè)方法，其特征是步驟5)中所述擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶為235bp。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)白色念珠菌的PCR方法。本發(fā)明通過提取白色念珠菌核酸，應(yīng)用白色念珠菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在脂糖凝膠上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外投射儀下觀察PCR產(chǎn)物，并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，來判斷檢測(cè)樣品中是否存在白色念珠菌污染，電泳圖中如出現(xiàn)235bp特異性條帶，表明該樣品中存在白色念珠菌，如果沒有出現(xiàn)235bp特異性條帶，表明該樣品中不存在白色念珠菌。經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證，本發(fā)明的檢測(cè)體系具有特異性高、穩(wěn)定性好和檢驗(yàn)周期短等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102634594SQ20121013006
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者劉生峰, 周慶, 李應(yīng)國, 李賢良, 歐陽珂珮, 王國民, 王昱, 聶福平, 肖進(jìn)文 申請(qǐng)人:劉生峰, 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心