專利名稱：多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效判定方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效判定方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
ABCC2基因局部存在于肝細(xì)胞的膽管，對將谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、硫酸結(jié)合體從膽管輸送到膽管的轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行編碼，并與各種藥劑的代謝有關(guān)。另外，近年，在分析日本人的ABCC2基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)之后，發(fā)現(xiàn)了各 種各樣的基因多態(tài)性。另外，已給出了通過對ABCC2基因的與5’末端相距24個堿基的胞嘧啶(C)突變成胸腺嘧啶(T)的C-24T進(jìn)行測定有可能能夠預(yù)測藥物耐受性的啟示(參見Drug Metabolism and Disposition, 2002 年，Vol. 30, No. 4, p. 363-364)。因此，人們期待正確且短時間、低成本并且簡便地測定ABCC2基因的多態(tài)性的方法。另外，作為與藥劑的敏感性相關(guān)的突變，例如，除了 C-24T突變之外，還已知有MDRl基因的外顯子26中的第3435位的胞嘧啶(C)突變成胸腺嘧啶(T)的C3435T突變等多種突變(參見日本專利特許第4454366號公報)。因此，不單單檢測ABCC2基因的多態(tài)性，而是通過與C-24T突變一起檢測其他的與藥劑敏感性相關(guān)的突變體，有可能能夠更高靈敏度地預(yù)測藥劑耐受性。目前，作為測定基因的多態(tài)性的方法，已知有下述的方法使用被設(shè)計為擴(kuò)增含有想要測定的堿基的部分的引物進(jìn)行PCR，用可以該特定堿基中有無突變來區(qū)分是否切斷的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切斷，之后通過電泳檢測有沒有被切斷(PCR-RFLP法)(參見Genet.Mol. Res. ,2010 年，第 9 卷，第 I 號，ρ· 34-40)。另外，還已知有下述的方法在用PCR法擴(kuò)增含有突變的區(qū)域之后，使用用熒光染料標(biāo)記了的核酸探針進(jìn)行熔解曲線分析，并基于熔解曲線分析的結(jié)果來分析堿基序列的突變(參見特開2002-119291號公報)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題但是，ABCC2基因的突變中如上述那樣存在各種突變。因此，在PCR-RFLP法中，需要在PCR反應(yīng)之后提取擴(kuò)增產(chǎn)物來進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物有可能混入下一反應(yīng)體系中，由此有時會獲得假陽性、假陰性的結(jié)果。另外，由于在PCR結(jié)束之后用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，之后進(jìn)行電泳，因此有時到檢測為止所需的時間非常長。而且，由于操作復(fù)雜，因此難以自動化。根據(jù)這些現(xiàn)狀，期待進(jìn)一步開發(fā)用于檢測ABCC2基因多態(tài)性的技術(shù)。本發(fā)明要解決的問題在于提供一種能夠高靈敏度、簡便地檢測ABCC2基因多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法。另外，本發(fā)明要解決的問題在于提供使用了該多態(tài)性檢測方法的藥效判定方法。而且本發(fā)明要解決的問題在于提供使用了該多態(tài)性檢測用探針的多態(tài)性檢測用試劑盒。用于解決課題的手段本發(fā)明如下所述。<1> 一種多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述Pl和ΡΓ的組中選擇的一種熒光標(biāo)記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性，(Pl)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的喊基為胞喃唳之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記； 以及(Pr)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。〈2>根據(jù)〈1>所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針是下述Pl或下述ΡΓ的所述熒光標(biāo)記核苷酸，(Pl-I)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I的第217位的堿基對應(yīng)的喊基為胞B密卩定之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記，并且該熒光標(biāo)記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性；或者(Pr -I)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記，并且該熒光標(biāo)記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。<3>根據(jù)〈1>或〈2>所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位具有用熒光染料標(biāo)記的第217位的堿基。<4>根據(jù)〈1> 〈3>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的第217位的堿基。<5>根據(jù)〈1> 〈4>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在未與IE標(biāo)序列雜交時發(fā)出突光，并且在與該IE標(biāo)序列雜交時突光強(qiáng)度減少或增加。<6>根據(jù)〈1> 〈5>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在未與靶標(biāo)序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與該靶標(biāo)序列雜交時熒光強(qiáng)度減少。<7>根據(jù)〈1> 〈6>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為12 55。<8>根據(jù)〈1> 〈7>任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為15 45。
<9>根據(jù)<1> 〈8>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為18 35。<10>根據(jù)〈1> 〈9>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中所述多態(tài)性檢測用探針為用于分析熔解曲線的探針。<11>根據(jù)〈1> 〈10>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針具有序列編號4、序列編號5、序列編號6、序列編號7、序列編號8、序列編號9、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號15或序列編號16所不的喊基序列。〈12>—種多態(tài)性檢測方法，其通過使用〈1> 〈I 1>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針來檢測ABCC2基因的多態(tài)性。<13>根據(jù)〈12>所述的多態(tài)性檢測方法，包括 (I)使〈1> 〈11>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體；(II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動；(III)基于所述熒光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值；以及(IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCC2基因的多態(tài)性的存在。<14>根據(jù)〈13>所述的多態(tài)性檢測方法，還包括在所述⑴之前或者與⑴同時擴(kuò)增核酸。<15>根據(jù)〈12> 〈14>中任一項所述的多態(tài)性檢測方法，還包括通過使用從包括MDRl基因的多態(tài)性檢測用探針和CYP3A5基因的多態(tài)性檢測用探針的組中選擇的至少一種探針，來檢測從包括MDRl基因和CYP3A5基因的組中選擇的至少一種基因的多態(tài)性。<16> 一種藥效評價方法，包括通過〈12> 〈15>中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCC2基因的多態(tài)性；以及基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。<17> 一種多態(tài)性檢測用試劑盒，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性，所述多態(tài)性檢測用試劑盒包含〈1> 〈11>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。<18>根據(jù)<17〉所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含能夠擴(kuò)增含有與所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。<19>根據(jù)<17〉或〈18>所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含從包括用于檢測MDRl基因的多態(tài)性的探針以及用于檢測CYP3A5基因的多態(tài)性的探針的組中選擇的至少一種以上的多態(tài)性檢測用探針。發(fā)明效果通過本發(fā)明，能夠提供可以高靈敏度、簡便地檢測ABCC2基因多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法。另外，本發(fā)明能夠提供使用了該多態(tài)性檢測方法的藥效判定方法。而且，本發(fā)明能夠提供使用了該多態(tài)性檢測用探針的多態(tài)性檢測用試劑盒。


圖I的(A)是核酸混合物的熔解曲線的示例，圖I的(B)是微分熔解曲線的示例。圖2的㈧ (F)是本發(fā)明的實施例I涉及的試樣的微分熔解曲線。圖3的㈧ (C)是本發(fā)明的實施例2涉及的試樣的微分熔解曲線。圖4的㈧ (C)是本發(fā)明的比較例I涉及的試樣的微分熔解曲線。
具體實施例方式本發(fā)明涉及的ABCC2基因的多態(tài)性檢測用探針(以下，有時僅稱“多態(tài)性檢測用探 針”)為如下的多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述Pi和ΡΓ的組中選擇的一種熒光標(biāo)記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性(Pl)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的喊基為胞B密卩定之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80 %以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；以及(Pr)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。本發(fā)明涉及的ABCC2基因多態(tài)性檢測方法包括使用至少一種用于檢測所述ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針來檢測ABCC2基因的多態(tài)性。本發(fā)明涉及的藥劑的藥效判定方法包括通過所述ABCC2基因多態(tài)性檢測方法檢測ABCC2基因的多態(tài)性；以及基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定針對藥劑的耐受性或藥劑的藥效。本發(fā)明涉及的多態(tài)性檢測用試劑盒包含用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針。本發(fā)明中的“ABCC2基因”已經(jīng)是公知的，其堿基序列表示NCBI的登錄號No. NC_000010. 10的101542463 101611662的序列。序列編號I的堿基序列為NCBI的dbSNP的登錄號No. rs717620的I 611的序列，相應(yīng)于ABCC2基因的啟動子區(qū)域中的核酸的堿基序列的一部分。在本發(fā)明中，關(guān)于作為檢測對象的試樣中的試樣核酸、多態(tài)性檢測用探針或者引物的每個的序列，基于它們的相互互補(bǔ)的關(guān)系所記述的事項，只要不特別指出，也適用于各個序列和相對于各序列互補(bǔ)的序列。在將本發(fā)明的事項適用于相對于各序列互補(bǔ)的該序列時，由該互補(bǔ)的序列識別的序列，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識的范圍內(nèi)，視為將說明書全體替換為與對應(yīng)的本說明書中記載的序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明中，“Tm值”是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度達(dá)到吸光度總上升量的50%時的溫度。即，當(dāng)加熱含有雙鏈核酸、例如雙鏈核酸DNA的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈核酸DNA中的兩條雙鏈之間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離成單鏈DNA (DNA的熔解)。并且，當(dāng)雙鏈核酸DNA解離成單鏈DNA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈核酸DNA的吸光度)的約I. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成。Tm值基于該現(xiàn)象而設(shè)定。本發(fā)明中的Tm值只要不特別指出，均是指吸光度達(dá)到吸光度總上升量的50%時的溫度。在本發(fā)明中，關(guān)于寡核苷酸的序列，當(dāng)稱為“從3’末端起數(shù)的第I 3位”時是以寡核苷酸鏈的3’末端為第I位起數(shù)的。在本說明書中，“步驟” 一詞不僅包含獨(dú)立的步驟，即使在不能與其他的步驟明確區(qū)別的情況下只要達(dá)到了本步驟預(yù)期的效果，則也包含在本術(shù)語之內(nèi)。另外，在本說明書中，使用“ ”表示的數(shù)值范圍為將“ ”的前后記載的數(shù)值分別 作為最小值和最大值包含的范圍。另外，在本發(fā)明中，組成物中的各成分的量在組成物中存在多種相當(dāng)于各成分的物質(zhì)的情況下只要不特別指出就是指所述組成物中存在的該多種物質(zhì)的合計量。下面說明本發(fā)明?！碅BCC2基因多態(tài)性檢測用探針>本發(fā)明涉及的ABCC2基因的多態(tài)性檢測用探針(以下，有時僅稱為“多態(tài)性檢測用探針”)為如下的多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述Pi和ΡΓ的組中選擇的一種熒光標(biāo)記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性(Pl)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的喊基為胞B密卩定之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80 %以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；以及(Pr)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外與具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。本發(fā)明的從包括所述Pl和所述ΡΓ的組中選擇的一種熒光標(biāo)記寡核苷酸(以下也稱為“所述Pi或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸”。)是能夠檢測序列編號I所示的堿基序列的第207位的堿基的多態(tài)性的探針。另外，本發(fā)明的所述Pl和ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸具體為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的序列。在ABCC2基因的野生型中，與序列編號I所示的序列的第207位對應(yīng)的堿基為C (胞嘧啶)，但在突變型中突變成T (胸腺嘧啶)(以下，稱為“C-24T突變”)，該堿基相當(dāng)于ABCC2基因的第-428位 第183位的堿基中的第207位的堿基。本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸需要除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為c(胞嘧啶)之外相對于具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列具有同源性。具體地，本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸除了與序列編號I中的第217位的喊基對應(yīng)的喊基為c(胞喃唳)之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列顯不80%以上的同一性。另外，從檢測靈敏度的觀點來說，可以顯示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一'I"生。在對本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸和除了與序列編號I中的第 217位的堿基對應(yīng)的堿基為C(胞嘧啶)之外具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列進(jìn)行比較時的同一性低于80%的情況下，針對含有突變型的ABCC2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變低。另外，作為本發(fā)明涉及的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸，也可以是熒光標(biāo)記寡核苷酸(Pl-I)，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外相對于具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記，并且該熒光標(biāo)記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。該熒光標(biāo)記寡核苷酸具有對含有突變型的ABCC2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變高的傾向。本發(fā)明中的所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸需要除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為C(胞嘧啶)之外具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。雜交可以根據(jù)公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來進(jìn)行。該文獻(xiàn)通過參考被并入本說明書中。嚴(yán)謹(jǐn)條件是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴(yán)謹(jǐn)條件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約I. OmM 約5. OmM中進(jìn)行雜交的條件。作為本發(fā)明的條件的示例，可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下進(jìn)行雜交的條件,但是不限于此。此外,嚴(yán)謹(jǐn)條件被記載在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻(xiàn)通過參考被并入本說明書中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過改變雜交反應(yīng)、雜交反應(yīng)液的鹽濃度等來容易地選擇這樣的條件。另外，作為本發(fā)明涉及的所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸，也可以是熒光標(biāo)記寡核苷酸(Pr -I)，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外和具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記，并且該熒光標(biāo)記寡核苷酸(ΡΓ -I)識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。該熒光標(biāo)記寡核苷酸除了具有特定的堿基序列之外，還具有識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性的功能，因此具有對含有突變型的ABCC2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變高的傾向。另外，本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸還包括在所述Pi或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸中插入、缺失或者取代了堿基的熒光標(biāo)記寡核苷酸。
該插入、缺失或取代了堿基的熒光標(biāo)記寡核苷酸只要顯示與所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了堿基的情況下，其插入、缺失或取代的位置無特別限定。插入、缺失或取代的堿基的數(shù)量可以舉出I個堿基或2個堿基以上，該數(shù)量根據(jù)熒光標(biāo)記寡核苷酸全體的長度而不同，例如可以舉出I個堿基 10個堿基或I個堿基 5個堿基。在插入、缺失或取代中，作為本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸，也可以舉出取代了所述Pl或所述Pr熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基的熒光標(biāo)記寡核苷酸。取代的位置無特別限定。例如，從檢測靈敏度的觀點來說，可以舉出位于序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基之外的堿基被取代。作為被取代的堿基的數(shù)量，可以舉出I個堿基或2個堿基以上。被取代的堿基的數(shù)量根據(jù)熒光標(biāo)記寡核苷酸全體的長度而不同，例如可以舉出I個堿基 5個堿基、或I個堿基 3個堿基。

本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ的熒光標(biāo)記寡核苷酸的長度需要是Ilmer 60mer。在所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸的長度為IOmer以下或者61mer以上的情況下，ABCC2基因多態(tài)性的檢測靈敏度變低。另外，本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸的長度可以為12mer 55mer、15mer 45mer或18mer 35mer。通過設(shè)成12mer 55mer的范圍，例如具有檢測靈敏度變高等的傾向。另外，通過改變所述Pl或所述P I’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長，例如能夠?qū)⒂蒔l或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈(靶標(biāo)序列)形成的雜交體的解離溫度、即Tm值調(diào)整至期望的值。以下將本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸中的堿基序列的示例示于表1，但是本發(fā)明不限于此。此外，在表I中，將與序列編號I的第207位的堿基對應(yīng)的堿基用小寫字母表示，并且一并不出了與該序列編號I的第207位對應(yīng)的堿基為A、G、T和C時的寡核苷酸與各個熒光標(biāo)記寡核苷酸的雜交體的Tm值。另外，相對于序列編號I所示的序列增加了突變的堿基帶有下劃線。這里Tm 值是使用 Meltcalc 99 free (http://www. meltcalc. com/)在設(shè)定條件Oligoconc [ μ Μ] O. 2、Na eq. [mM] 50 的條件下計算的。
序列(5’一3')mer ~mt T「^~一 ^]※字列編號
TCTGGAACgAAGACTCTTC — 1950.2" 43.27.0 4
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTC~ 3765.6 62.3__3,3__5
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTCTATTAATATGATTGTGTTQT57一 67.4 ■ 65.42.0__6
TCTGgAACgAAGACTCTTC19— 30.139.4— 9.3 7
AATGATACCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTC37— 61.7 51.8__9,9__8
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTCTAGGAATATGATTGTGTTGT5766.7~ 64.6— 2.19
CtAAGACTCTTC12—16.8 12.7__41__10
C^AAGACTCTTCI 12I 12.5I 9.7 I 2.8 I ” ■X Λ為mt (突變型)和WT (野生型)的Tm值之差在本發(fā)明中，所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸與具有互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交時的Tm值(表I中的Tm(mt))、和與僅序列編號I的第207位的堿基對應(yīng)的堿基為非互補(bǔ)的寡核苷酸雜交時的Tm值(表I中的Tm(WT))之差，例如可以舉出2. 0°C以上、3. 0°C以上、5. O0C以上、或7. O0C以上等。通過所述Tm值之差為2. 0°C以上，例如能夠更高靈敏度地檢測序列編號I中的第207位的堿基的突變。另外，本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸的第217位的堿基需要用熒光染料標(biāo)記。在所述Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸中，該熒光標(biāo)記了的第217位的堿基能夠存在于從3’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置。另外，能夠存在于3’末端。由此，多態(tài)性檢測靈敏度進(jìn)一步提高。另外，能夠生產(chǎn)性良好地獲得Pl或所述ΡΓ熒光標(biāo)記寡核苷酸。本發(fā)明的所述熒光標(biāo)記寡核苷酸可以是其與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少(淬滅)或增加的熒光標(biāo)記寡核苷酸。其中，可以是與靶 標(biāo)序列雜交時的突光強(qiáng)度比未與祀標(biāo)序列雜交時的突光強(qiáng)度減少的突光標(biāo)記寡核苷酸。利用了這種突光淬滅現(xiàn)象(Quenching phenomenon)的探針一般稱為鳥嘌呤淬滅探針，已知為所謂Q Probe (注冊商標(biāo))。其中可以舉出如下的寡核苷酸其被設(shè)計為3’末端或5’末端為胞嘧啶(C)，并用熒光染料標(biāo)記該末端的C使其靠近鳥嘌呤(G)時發(fā)光變?nèi)?。若使用這樣的探針，則能夠根據(jù)信號的變動來容易地確認(rèn)雜交和解離。此外，除了使用Q Probe的檢測方法之外，也可以應(yīng)用公知的檢測方式。作為這種檢測方式，可舉出Taq-man探針法、雜交探針(Hybridization Probe)法、分子信標(biāo)(Molecular Beacon)法或 MGB 探針法等。作為所述熒光染料無特別限制，例如可以為熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等。所述熒光染料的市售產(chǎn)品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的檢測條件無特別限制，可以根據(jù)使用的所述熒光染料適當(dāng)確定。例如Pacific Blue能夠在波長445 480nm下檢測，TAMRA能夠在波長585 700nm下檢測，BODIPY FL能夠在波長520 555nm下檢測。如果使用具有這種熒光染料的探針，則能夠根據(jù)各個熒光信號的變動來容易地確認(rèn)雜交和解離?？梢园凑胀ǔ５姆椒?、例如日本專利文獻(xiàn)特開2002-119291號公報等中記載的方法，來將所述熒光染料結(jié)合至寡核苷酸。另外，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸例如也可以在3’末端添加有磷酸基。因為通過在所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能夠充分抑制探針自身由于基因擴(kuò)增反應(yīng)而延長。如后面所述，檢測有無突變的DNA(靶標(biāo)DNA)可以通過PCR等基因擴(kuò)增法來制備。此時，通過使用在3’末端添加有磷酸基的熒光標(biāo)記寡核苷酸，能夠使其共存于擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液中。另外，通過在3’末端例如添加前述那樣的標(biāo)記物質(zhì)(熒光染料)，也能夠得到同樣的效果。下面示出具有上述堿基序列并且3’末端的C用熒光染料被標(biāo)記的寡核苷酸的具體例(大寫字母的堿基表示突變點，(TAMRA)相當(dāng)于所述熒光染料)。但是，本發(fā)明中的熒光標(biāo)記寡核苷酸不限于以下的寡核苷酸。表權(quán)利要求
1.一種多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述pi和Pr的組中選擇的一種熒光標(biāo)記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性 (PD熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞喃唳之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；以及 (Pr )熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針是下述Pl或下述P1’的所述熒光標(biāo)記核苷酸， (Pl-I)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞喃唳之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記，并且該熒光標(biāo)記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性；或者 (PI’ -D熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記，并且該熒光標(biāo)記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位具有用熒光染料標(biāo)記的第217位的堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的第217位的堿基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在未與靶標(biāo)序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與該靶標(biāo)序列雜交時熒光強(qiáng)度減少或增加。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在未與靶標(biāo)序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與該靶標(biāo)序列雜交時熒光強(qiáng)度減少。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為12 55。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為15 45。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為18 35。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針為用于分析熔解曲線的探針。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針具有序列編號4、序列編號5、序列編號6、序列編號7、序列編號8、序列編號9、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號15或序列編號16所不的喊基序列。
12.一種多態(tài)性檢測方法，其通過使用權(quán)利要求I至11中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針來檢測ABCC2基因的多態(tài)性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測方法，包括 (I)使權(quán)利要求I至11中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體； (II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動； (III)基于所述熒光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值；以及 (IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCC2基因的多態(tài)性的存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的多態(tài)性檢測方法，還包括在所述(I)之前或者與(I)同時擴(kuò)增核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項所述的多態(tài)性檢測方法，還包括通過使用從包括MDRl基因的多態(tài)性檢測用探針和CYP3A5基因的多態(tài)性檢測用探針的組中選擇的至少一種探針，來檢測從包括MDRl基因和CYP3A5基因的組中選擇的至少一種基因的多態(tài)性。
16.—種藥效評價方法，包括 通過權(quán)利要求12至15中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCC2基因的多態(tài)性；以及 基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。
17.一種多態(tài)性檢測用試劑盒，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性，所述多態(tài)性檢測用試劑盒包含權(quán)利要求I至11中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含能夠擴(kuò)增含有與所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含從包括用于檢測MDRl基因的多態(tài)性的探針以及用于檢測CYP3A5基因的多態(tài)性的探針的組中選擇的至少一種以上的多態(tài)性檢測用探針。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠高靈敏度且簡便地檢測ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效判定方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒。用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針是(P1)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其為含有序列編號1所示的序列中第207位～第217位的堿基的堿基長11～60的序列，除了與序列編號1中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基為C之外相對于具有與序列編號1相同堿基的堿基序列具有至少80％以上的同一性，并且與序列編號1所示的序列的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；或者(P1’)熒光標(biāo)記寡核苷酸，其與具有與序列編號1相同堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與序列編號1所示的序列中的第217位的堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。
文檔編號C12N15/11GK102766682SQ20121013213
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月2日
發(fā)明者井口亞希 申請人:愛科來株式會社