專利名稱：一種微生物低溫保存保護劑和微生物低溫保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種微生物低溫保存保護劑和低溫保存方法。
背景技術(shù)：
微生物菌種是一項重要的生物資源，菌種保藏是重要的微生物基礎(chǔ)工作。菌種保藏就是利用一切方法使菌種不死、不衰、不變，以便于研究與應(yīng)用。不同菌種或不同要求，適用不同的保藏方法，一般細菌培養(yǎng)物的保藏方法斜面保藏、液體石蠟保藏、冷凍干燥保藏、液氮超低溫保藏法、低溫冷凍保藏法。斜面保藏法，保藏期短；液體石蠟保藏法，必須直立存放，占空間大，不便攜帶；凍干保藏、液氮超低溫保藏法，技術(shù)復(fù)雜，技術(shù)含量高，設(shè)備投入高，運行成本高，適合專業(yè)保藏機構(gòu)，不適合生產(chǎn)企業(yè)。低溫保藏法是將菌種放置在低溫冰箱中以減緩細胞的生理活動而進行的一種保藏方法。目前采用的保藏方法有兩種一是4°C冰箱直接保存(短期)；二是，菌液中加入一定比例的甘油混合后_80°C保存(中長期)。低溫保存，無論是4°C還是-20°C、-80°C，加入一定比例的保護劑，可有效保護微生物活性，提高菌體存活率。而由于各種微生物種類及結(jié)構(gòu)不同，其在低溫保存中的最佳保護劑配方也不同。目前，現(xiàn)有的微生物低溫保存保護劑為甘油、甘露醇和脫脂奶粉中的至少一種。但是，實驗結(jié)果證明，在現(xiàn)有的微生物低溫保存保護劑存在下，微生物經(jīng)過低溫保存后的存活率和菌體活性仍然不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服在現(xiàn)有的微生物低溫保存保護劑存在下，微生物經(jīng)過低溫保存后的存活率和菌體活性仍然不高的缺陷，提供一種微生物低溫保存保護劑和一種微生物低溫保存保護方法，以使微生物經(jīng)過低溫保存后的存活率和菌體活性得到提高。為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種微生物低溫保存保護劑，該微生物低溫保存保護劑含有低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖。另一方面，本發(fā)明還提供了一種微生物低溫保存方法，該微生物低溫保存方法包括將如上所述的微生物低溫保存保護劑與水混合后再與待保存的微生物混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下；或者將待保存的微生物與含有水的微生物低溫保存保護劑混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下。通過上述技術(shù)方案，微生物經(jīng)過低溫保存后的存活率和菌體活性得到顯著提高。具體地，使用本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護劑，可以使得大腸埃希菌(Escherichiacoli)在零下20°C的溫度下保存半年后的存活率仍可達到95%，而以使用終濃度為15重量％的甘油作為保護劑，大腸埃希菌在零下20°C的溫度下保存半年后的存活率僅僅為85%。此外，使用本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護劑，可以使得黃色短桿菌在4°C的溫度下保存7天后的種子罐周期僅為15h，而以使用終濃度為15重量％的甘油作為保護劑，黃色短桿菌在4°C的溫度下保存7天后的種子罐周期長達18h。本發(fā)明中，術(shù)語“種子罐周期”的定義為將IO9個活菌體經(jīng)歷保藏后全部接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到IO12個活菌體量所需要的培養(yǎng)時間。經(jīng)歷保藏后的菌體活性越高，種子罐周期越短。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護劑，該微生物低溫保存保護劑含有低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖。其中，該微生物低溫保存保護劑可以為固體狀的組合物，也可以進一步加水混合為液體狀的組合物。典型地，該微生物低溫保存保護劑的儲存狀態(tài)為固體狀的組合物，使用狀態(tài)為液體狀的組合物。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護劑，其中，低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖的含量可以在較大范圍內(nèi)變動，例如，相對于100重量份的低聚糖，甘油的含量可以為20-70重量份，甘露醇的含量可以為20-70重量份，脫脂奶粉的含量可以為100-200重量份，瓊脂糖的含量可以為0. 1-1. 0重量份。優(yōu)選情況下，相對于100重量份的低聚糖，甘油的含量為40-70重量份，甘露醇的含量為40-60重量份，脫脂奶粉的含量為150-200重量份，瓊脂糖的含量為0. 4-0. 8重量份。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護劑，其中，為使所述微生物低溫保存保護劑方便直接使用，優(yōu)選情況下，所述微生物低溫保存保護劑還含有水。其中，相對于100重量份的低聚糖，水的含量可以為800-1500重量份，優(yōu)選為900-1200重量份。
其中，為了使所述微生物低溫保存保護劑在含有水的情況下能更加均勻穩(wěn)定地保存和使用，優(yōu)選情況下，將含有水的微生物低溫保存保護劑加熱至90°C以上后冷卻至室溫。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護劑，其中，所述低聚糖為由2-10個單糖單元通過糖苷鍵連接構(gòu)成的物質(zhì)，典型地，所述低聚糖為二糖，優(yōu)選情況下，所述低聚糖為海藻糖、蔗糖和麥芽糖中的至少一種。所述低聚糖均可以為常規(guī)的市售品。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存保護劑，其中，所述瓊脂糖是以瓊脂和/或提純的瓊脂糖的形式添加到所述微生物低溫保存保護劑中的，所述瓊脂中，瓊脂糖的含量至少為70重量％。所述瓊脂和所述提純的瓊脂糖均可以為常規(guī)的市售品。其中，甘油、甘露醇和脫脂奶粉均可以為常規(guī)的市售品。所述脫脂奶粉是指符合GB 5410-1999標(biāo)準(zhǔn)的脫脂乳粉。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，用于微生物領(lǐng)域的上述市售品應(yīng)當(dāng)是潔凈的，例如可以是食品級、化學(xué)純或分析純的。本發(fā)明還提供了一種微生物低溫保存方法，該微生物低溫保存方法包括將如上所述的微生物低溫保存保護劑與水混合后再與待保存的微生物混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下；或者將待保存的微生物與含有水的微生物低溫保存保護劑混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下。其中，所述混合的方法沒有特別的要求，可以為常規(guī)的吹打和/或振蕩。其中，所述微生物可以為培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物，也可以為該培養(yǎng)物離心分離得到的微生物體。
方法，其中，所述微生物低溫保存保護劑相對于一定量微生物的用量可以在較大范圍內(nèi)變化，相對于IO9個微生物，所述微生物低溫保存保護劑的用量可以為1-5克，優(yōu)選為1-3克。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存方法，其中，所述保存溫度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的微生物低溫保存的保存溫度，典型地，所述保存溫度可以為零下260°C至5°C之間的任意溫度。典型地，用于微生物低溫保存方法的設(shè)備可以為常規(guī)的各種設(shè)備，例如溫度設(shè)置為4°C左右的冰箱、溫度設(shè)置為零下20°C左右的冰箱、溫度設(shè)置為零下80°C左右的冰箱、溫度設(shè)置為零下160°C左右的冰箱或液氮保存罐(零下196°C以下)等。一般地，保存溫度越低，保存的效果越好。為了降低安裝運行所述保存設(shè)備的成本，優(yōu)選情況下，所述保存溫度為(TC至5°C之間的任意溫度，或者，所述保存溫度為零下30°C至零下15°C之間的任意溫度。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存方法，其中，作為一種特別優(yōu)選的實施方式，所述保存溫度為零下30°C至零下15°C之間的任意溫度，并且，在將混合后的物料置于零下30°C至零下15°C之間的任意溫度之前，先將混合后的物料置于0°C至5°C之間的任意溫度下l_5h，更優(yōu)選2-4h。在該優(yōu)選實施方式下，微生物經(jīng)過低溫保存后的存活率和菌體活性得到進一步提聞。根據(jù)本發(fā)明提供的微生物低溫保存方法，其中，該微生物低溫保存方法適用于常規(guī)的各種微生物，特別是發(fā)酵工程領(lǐng)域常用的各種微生物，典型地，所述微生物為大腸埃希菌(拉丁學(xué)名為Escherichia coli)、黃色短桿菌(拉丁學(xué)名為Brevibacterium flavum)和谷氨酸棒狀桿菌(拉丁學(xué)名為Corynebacterium glutamicum)中的至少一種。以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中，低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖均為購自國藥集團公司的市售品。制備實施例I按照表I所示的重量份將低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖混合，分別得到儲存狀態(tài)下的微生物低溫保存保護劑1-3。表I (重量份)
權(quán)利要求
1.一種微生物低溫保存保護劑，該微生物低溫保存保護劑含有低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物低溫保存保護劑，其中，相對于100重量份的低聚糖，甘油的含量為20-70重量份，甘露醇的含量為20-70重量份，脫脂奶粉的含量為100-200重量份，瓊脂糖的含量為0. 1-1重量份，優(yōu)選情況下，相對于100重量份的低聚糖，甘油的含量為40-70重量份，甘露醇的含量為40-60重量份，脫脂奶粉的含量為150-200重量份，瓊脂糖的含量為0. 4-0. 8重量份。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的微生物低溫保存保護劑，其中，所述低聚糖為海藻糖、蔗糖和麥芽糖中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的微生物低溫保存保護劑，其中，所述瓊脂糖是以瓊脂和/或提純的瓊脂糖的形式添加到所述微生物低溫保存保護劑中的，所述瓊脂中，瓊脂糖的含量至少為70重量％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的微生物低溫保存保護劑，其中，所述微生物低溫保存保護劑還含有水，相對于100重量份的低聚糖，水的含量為800-1500重量份，優(yōu)選為900-1200重量份。
6.一種微生物低溫保存方法，該微生物低溫保存方法包括將權(quán)利要求1-4中任意一項所述的微生物低溫保存保護劑與水混合后再與待保存的微生物混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下；或者將待保存的微生物與權(quán)利要求5所述的微生物低溫保存保護劑混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物低溫保存方法，其中，相對于IO9個微生物，所述微生物低溫保存保護劑的用量為1-5克，優(yōu)選為1-3克。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物低溫保存方法，其中，所述保存溫度為0°C至5°C之間的任意溫度，或者，所述保存溫度為零下30°C至零下15°C之間的任意溫度。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物低溫保存方法，其中，所述保存溫度為零下30°C至零下15°C之間的任意溫度，并且，在將混合后的物料置于零下30°C至零下15°C之間的任意溫度之前，先將混合后的物料0°C至5°C之間的任意溫度下放置l-5h，優(yōu)選2-4h。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任意一項所述的微生物低溫保存方法，其中，所述微生物為大腸埃希菌(Escherichia coli)、黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物低溫保存保護劑，該微生物低溫保存保護劑含有低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖。本發(fā)明還提供了一種微生物低溫保存方法，該微生物低溫保存方法包括將如上所述的微生物低溫保存保護劑與水混合后再與待保存的微生物混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下；或者將待保存的微生物與含有水的微生物低溫保存保護劑混合，然后將混合后的物料置于保存溫度下。通過上述技術(shù)方案，微生物經(jīng)過低溫保存后的存活率和菌體活性得到顯著提高。
文檔編號C12R1/19GK102643749SQ201210132750
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者盧宗梅, 吳曉艷, 羅虎, 鐘華, 魏海燕 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司