專利名稱：一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種食用菌雜種的鑒定方法，具體是一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法
背景技術：
靈鬼 iPleurotus nebrodensis (Inzengae) Qu6l)腐生或寄生在傘形科阿魏屬多年生草本植物阿魏草(ferula)的根莖基部或根部。杏鮑燕ipleurotus eryngii(DC. :Fr.) Qu6l)發(fā)生于傘形花科刺芹屬，刺芹枯死的植株上。二者同屬于側(cè)耳屬(Pleurotus)。白靈菇和杏鮑菇不僅有很高的營養(yǎng)價值，口感風味好，而且還有很高的藥用價值，市場前景廣闊。但白靈菇的組織致密性、口感、朵形顏色優(yōu)于杏鮑菇，而風味、生長周期、生物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)管理條件劣于杏鮑菇。為了快速篩選白靈菇與杏鮑菇的種間雜交種，同時為保護白靈菇與杏鮑菇種間雜交種這一新品種，有必要探索鑒定白靈菇與杏鮑菇種間雜交種真?zhèn)蔚募夹g。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，通過本發(fā)明的方法可以容易的從菌菇中篩選出白靈菇與杏鮑菇的雜交種。本發(fā)明一種白靈燕與杏鮑燕種間雜交種的鑒定方法，包括一個制備菌株原生質(zhì)體的步驟，一個將原生質(zhì)體進行培養(yǎng)的步驟，一個將原生質(zhì)體中的菌絲進行培養(yǎng)與收集的步驟，一個提取菌絲中的基因組DNA的步驟，一個將提取后的DNA進行ITS-PCR擴增的步驟，一個將擴增產(chǎn)物進行特異酶切片的步驟，一個將酶切產(chǎn)物的電泳檢測的步驟，經(jīng)電泳檢測，如果在一個泳道上同時顯示分子量為675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA標記條帶，則說明該菌株是白靈菇與杏鮑菇的種間雜交種，如果在一個泳道不是同時顯示分子量為675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA標記條帶，則不是白靈菇與杏鮑菇的的種間雜交種。進一步的，在一個將提取后的DNA進行ITS-PCR擴增的步驟中，ITS-PCR擴增反應體系為1 μ L 含量 50 100 ng 的 DNA，2.5 μ L 10XPCR buffer, 2 μ L 濃度為 2· 5 mmol/L 的 dNTP, I μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 ITS1, ITSl 序列為 5，-TCC GTA GGT GAA CCTGCG G-3M μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 ITS4，ITS4 序列為 5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TATGC_3，，0.3 μ L 酶活為 5 U/uL 的 Taq DNA Polymerase, 17. 2 μ L ddH20，ITS-PCR 擴增反應程序94°C預變性5 min;94°C變性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸I min，35個循環(huán)；72°C延伸10 min。進一步的，在一個將擴增產(chǎn)物進行特異酶切片的步驟中，在8 12 μ I ITS-PCR擴增產(chǎn)物中加入2 μ I AluI 酶的酶切 Buff er，O. 8 I. 2μ I AluI 酶，5 9. 8 μ I ddH20，37°C 水浴4 7h。
進一步的，在一個將酶切產(chǎn)物的電泳檢測的步驟中，取AluI酶的酶切產(chǎn)物15 u L，與3 ii L上樣緩沖液混勻，點樣于I. 2%的瓊脂糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳。進一步的，經(jīng)電泳檢測，如果在一個泳道上同時顯不分子量為675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA標記條帶，則說明該菌株是白靈菇與杏鮑菇的種間雜交種。為了篩選出朵形同白靈菇、栽培性狀同杏鮑菇的新品種，通過本發(fā)明的方法可以鑒定出白靈菇與杏鮑菇之間的種間雜交，極大促進了白靈菇事業(yè)的發(fā)展，增加了新品種資源。本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯而易見的。本發(fā)明的白靈菇與杏鮑菇種 間雜交種的鑒定方法具有如下的優(yōu)點
I、檢測時間短該檢測所需時間短，一般只需要2 10天。2、準確性高、穩(wěn)定性好本發(fā)明以基因組DNA為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，是區(qū)分物種的本質(zhì)表現(xiàn)所在，而DNA序列中的保守序列更是穩(wěn)定，是物種長期進化的分子標記，不易受外界因素等的影響，因此以保守序列開發(fā)的鑒定方法準確性高，穩(wěn)定性好。3、容易判斷本發(fā)明的判斷依據(jù)是在瓊脂糖電泳上出現(xiàn)的DNA標記條帶,DNA標記條帶少、清晰，一目了然。


圖I為AluI酶的酶切電泳圖；M 3為泳道編號；左側(cè)的數(shù)字表示M泳道DNA片段的分子量。其中，I 3泳道中顯示的分子量為677bp、587bp和9Ibp的DNA標記條帶，是白靈恭與杏鮑燕種間雜交種菌株的標志。
具體實施例方式為了充分公開本發(fā)明的白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，以下結(jié)合實施例加以說明。本發(fā)明所使用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)
1、CTAB抽提液100mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB, 20 mmol/L EDTA, I. 4 mol/L NaCl,pH 8. 0 ；
2、CTAB沉淀液50 mmol/L Tris-HCl, I. 0% CTAB, 10 mmol/L EDTA, pH 8. 0 ；
3、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
4、TE緩沖液10 mmol/L Tris HCl , I mmol/L EDTA ；
5、0.5XTBE :44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HB03、1 mmol/L EDTA ；
6、上樣緩沖液0.1%溴酚藍，40%蔗糖；
7、EB10 mg/ml 溴化乙錠；
8、ITSl:5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，；
9、ITS4:5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ；
10、PCR擴增試劑及酶均購自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的主要儀器如下
Sff-CJ-IFB型單人水平垂直兩用凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司手提式滅菌鍋上海三申醫(yī)療器械有限公司
HYG-A全溫搖瓶柜太倉市實驗室
冷凍離心機Sigma 3K30
PCR 擴增儀Eppendorf AG22331 Hamburg
掌型離心機江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-IOO手掌型離心機
SDC-6節(jié)能型智能恒溫槽寧波新芝生物科技股份有限公司
凝膠成像系統(tǒng)TAN0N-2008
實施例I
(一)、白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合
選取優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的白靈菇菌株和杏鮑菇菌株作為雜交親本；
1、白靈菇單孢菌株原生質(zhì)體制備用PDA斜面培養(yǎng)基活化白靈菇單孢菌株，轉(zhuǎn)接于含IOOmL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL廣口三角瓶中，25°C靜置培養(yǎng)6 7d，用移液槍取5 7HiL培養(yǎng)液于含IOOmL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL廣口三角瓶中，25°C靜置培養(yǎng)6 7d，挑取
O.3 O. 6g幼嫩菌絲放入5mL離心管內(nèi)，5000r/min離心IOmin,倒棄離心出來的液體,在5mL離心管內(nèi)加入300ul溶壁酶酶液，置28 30°C水浴鍋中酶解2 2. 5h，用塞有棉花的注射器過濾酶解液，得到白靈菇單孢菌株原生質(zhì)體；
2、杏鮑菇雙核菌株原生質(zhì)體制備用PDA斜面培養(yǎng)基活化杏鮑菇雙核菌株，余下步驟同白靈菇單孢菌株原生質(zhì)體制備；
3、將制備好的白靈菇單孢菌株的原生質(zhì)體倒入直徑為90mm的平皿在距紫外燈15cm處照射20min，把制備好的杏鮑菇雙核菌株的原生質(zhì)體于50°C水浴20min ;把白靈菇單孢菌株和杏鮑菇雙核菌株的原生質(zhì)體以體積比為I : I的比例混合,再將混合液與融合劑以體積比為I : I的比例混合，30°C水浴15min，加入7-8倍體積的O. 6mol/L甘露醇稀釋，取其IOOul涂布在再生培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)7-10d，挑起再生菌落由步驟(二)繼續(xù)培養(yǎng)；所述白靈菇菌株和杏鮑菇菌株均從市場上購得；
(二 )、菌絲培養(yǎng)和收集
(1)將步驟(一)3獲得的再生菌株轉(zhuǎn)接含IOOmLPDA液體培養(yǎng)基的250 mL廣口三角瓶
中；
(2)放置在25°C搖床上，轉(zhuǎn)速90 130r/min培養(yǎng)7 10 d ；
(3)用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；
(4)稱取O.5 I. 3g菌絲，用濾紙包好，保存于_20°C備用。(三)、CTAB法提取基因組DNA
(1)取步驟(二)(4)保存?zhèn)溆玫木zO.5 I. 3g放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7mL的離心管；
(2)加2.5 mL 65°C預熱的抽提液，同時加入50 μ L巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性沉淀；
(3)65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩I次；
(4)加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質(zhì)； (5)8000 r/min, 4°C離心 IOmin,取上清到 7mL 管；
(6)加1/5體積65°C預熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻；(7)lOOOOr/min, 4°C離心 IOmin,取上清
(8)加入2.5 mL 65°C預熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65°C水浴Ih ；
(9)12000r/min, 4°C離心IOmin后，去除上清液；
(10)用0.5mL TE溶液或無菌水溶解沉淀IOmin ；
(11)加入0.25mL飽和酚和0. 25mL氯仿異戊醇，混勻；
(12)12000r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積在4°C預冷的無水乙醇，混勻；
(13)放置-20°C冰箱Ih或過夜；
(14)12000 r/min,4°C離心 10 min,棄上清；
(15)自然風干沉淀，用30UL TE溶液或無菌去離子水溶解沉淀，_20°C保存?zhèn)溆谩?四)、ITS-PCR擴增
ITS-PCR 擴增反應體系I u L 含量 50 100 ng 的 DNA，2.5 u L IOXPCR buffer, 2U L 濃度為 2. 5 m mol/L 的 dNTP，I u L 濃度為 10 u mol/L 的 ITSl, ITSl 序列為 5’_TCCGTA GGT GAA CCT GCG G-3’，I u L 濃度為 10 u mol/L 的 ITS4，ITS4 序列為 5’ -TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC_3，，0.3 U L 酶活為 5 U/uL 的 Taq DNA Polymerase, 17. 2 u L ddH20。ITS-PCR擴增反應程序94°C預變性5 min ;94°C變性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸I min, 35個循環(huán)；72°C延伸10 min。(五)、特異酶切片段標記的產(chǎn)生
IOu I ITS-PCR 擴增產(chǎn)物，2 ill AluI 酶的酶切 Buffer, I u I AluI 酶，7 y I(1冊20，371水浴411。(六)、酶切產(chǎn)物的電泳檢測
取AluI酶的酶切產(chǎn)物15 yl，與3 u I上樣緩沖液混勻，點樣于I. 2%的瓊脂糖凝膠上，同時使用DL 2000的DNA MARK作為片段大小的參照，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳60— 90 min,電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。如圖I所示，電泳圖上顯示I 3泳道所示的分子量為677bp、587bp和91bp的DNA標記條帶,是白靈燕與杏鮑菇種間雜交種菌株的標志。若無同時出現(xiàn)些分子量大小的3個片段，則不是白靈菇與杏鮑菇的雜交種。利用本發(fā)明的方法，在數(shù)百個參加鑒定的菌株中，得到白靈菇與杏鮑菇雜交菌株132個，并從中篩選出3個菇形同白靈菇、栽培周期比杏鮑菇長7 —14天的雜交菌株。
權利要求
1.一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，其特征在于包括一個制備菌株原生質(zhì)體的步驟，一個將原生質(zhì)體進行培養(yǎng)的步驟，一個將原生質(zhì)體中的菌絲進行培養(yǎng)與收集的步驟，一個提取菌絲中的基因組DNA的步驟，一個將提取后的DNA進行ITS-PCR擴增的步驟，一個將擴增產(chǎn)物進行特異酶切片的步驟，一個將酶切產(chǎn)物的電泳檢測的步驟，經(jīng)電泳檢測，如果在一個泳道上同時顯示分子量為675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA標記條帶，則說明該菌株是白靈菇與杏鮑菇的種間雜交種，如果在一個泳道不是同時顯示分子量為675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA標記條帶，則不是白靈菇與杏鮑恭的的種間雜交種。
2.如權利要求I所述的一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，其特征在于在一個將提取后的DNA進行ITS-PCR擴增的步驟中，ITS-PCR擴增反應體系為1 U L含量50 100 ng 的 DNA，2.5 u L 10XPCR buffer, 2 u L 濃度為 2. 5 m mol/L 的 dNTP，I u L濃度為 10 u mol/L 的 ITSl, ITSl 序列為 5’ -TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’，I u L 濃度為 10 u mol/L 的 ITS4，ITS4 序列為 5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC_3’，0. 3 ii L 酶活為 5 U/uL 的 Taq DNA Polymerase, 17. 2 U L ddH20，ITS-PCR 擴增反應程序94°C預變性 5min;94°C變性 45 s，55°C退火 45 s，72°C延伸 I min, 35 個循環(huán)；72°C延伸 10 min。
3.如權利要求I所述的一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，其特征在于在一個將擴增產(chǎn)物進行特異酶切片的步驟中，在8 12iil ITS-PCR擴增產(chǎn)物中加入2iilAluI 酶的酶切 Buffer，0. 8 I. 2 ii I AluI 酶，5 9. 8 u I ddH20，37°C水浴 4 7h。
4.如權利要求I所述的一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，其特征在于在一個將酶切產(chǎn)物的電泳檢測的步驟中，取AluI酶的酶切產(chǎn)物15 ii L，與3 ii L上樣緩沖液混勻，點樣于I. 2%的瓊脂糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳。
5.如權利要求I所述的一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，其特征在于經(jīng)電泳檢測，如果在一個泳道上同時顯示分子量為675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA標記條帶，則說明該菌株是白靈菇與杏鮑菇的種間雜交種。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領域，解決了現(xiàn)有技術中篩選白靈菇與杏鮑菇的種間雜交種比較困難的技術問題。提供了一種白靈菇與杏鮑菇種間雜交種的鑒定方法，包括一個制備菌株原生質(zhì)體的步驟，一個將原生質(zhì)體進行培養(yǎng)的步驟，一個將原生質(zhì)體中的菌絲進行培養(yǎng)與收集的步驟，一個提取菌絲中的基因組DNA的步驟，一個將提取后的DNA進行ITS-PCR擴增的步驟，一個將擴增產(chǎn)物進行特異酶切片的步驟，一個將酶切產(chǎn)物的電泳檢測的步驟，經(jīng)電泳檢測，如果產(chǎn)生分子量為675～685bp、585～5950bp和85～95bp的DNA標記條帶，則說明該菌株是白靈菇與杏鮑菇的種間雜交種。本發(fā)明的鑒定方法，檢測時間短、準確性高、容易判斷、穩(wěn)定性好。
文檔編號C12Q1/68GK102618663SQ20121013281
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權日2012年4月28日
發(fā)明者余作茂, 楊開耀, 鄧優(yōu)錦 申請人:上海百茸食用菌有限公司