專利名稱：焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimi·er，s disease, AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是最常見的癡呆類型，發(fā)病隱匿，病情呈進(jìn)行性。目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。ApoE編碼膽固醇代謝的關(guān)鍵載脂蛋E，通過調(diào)控和加速AP蛋白代謝、以及直接通過ApoE受體調(diào)控腦部脂質(zhì)代謝和突觸功能，在AD的發(fā)病中起到重要作用。根據(jù)ApoE表型提出ApoE基因模型，認(rèn)為ApoE的合成是由位于一個基因位點(diǎn)上的三個等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一個等位基因?qū)?yīng)于一個主要異構(gòu)體產(chǎn)生三種純合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六種常見表型。ApoE3/3型又稱野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交換決定了異構(gòu)體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg ;E2都是Cys ;112位為Cys和158位是Arg者為ApoE3異構(gòu)體。自然人群中，基因頻率e 3分布最高，ApoE3/3表型分布約70%。ApoE突變后，其與LDL-R的親和力發(fā)生改變。攜帶一個E4等位基因的個體其發(fā)展為AD的可能性高于無E4等位基因的個體約3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大約為15%，而在AD患者中的比例可達(dá)40%。ApoE4是AD的重要危險因素。通過檢測ApoE的基因型，可了解是否為AD易感人群，繼而從病因?qū)W延緩AD的發(fā)生、發(fā)展；并定期檢查，以便早診斷、早治療、最大程度的降低疾病造成的損害。綜上所述，ApoE基因多態(tài)性與AD發(fā)病顯著相關(guān)，開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測ApoE基因多態(tài)性的試劑盒將為AD的預(yù)測起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
ApoE基因多態(tài)性是與AD發(fā)病顯著相關(guān)，ApoE是AD發(fā)生的主要易感基因之一。本發(fā)明提供一種檢測AD易感基因ApoE基因多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測ApoE基因多肽性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為
一種焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物
(I)擴(kuò)增引物
ApoE (rs429358)上游引物 Sr-AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C_3, (SEQ ID
NO. 3)；ApoE (rs7412)上游引物5、AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C -3^ (SEQ ID
NO. 3)；
ApoE (rs429358)下游引物:5,-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)； ApoE (rs7412)下游引物:5,- CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)； 其中，下游引物的5'進(jìn)行生物素標(biāo)記；
(2)測序引物
ApoE (rs429358)測序引物:5,- GAC ATG GAG GAC GTG -3, (SEQ ID NO. 5)；
ApoE (rs7412)測序引物:5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3, (S EQ ID NO. 6)； 試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。一種應(yīng)用上述試劑盒檢測ApoE基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟
(1)DNA 提??；
(2)聚合酶鏈反應(yīng)
配制 50 ill PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 3. Oyl，上游引物l.Ou I,下游引物l.Oiil，1^&91.0111，水30.0111，模板4.0111 ;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀95 oC 5min預(yù)變性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 70°C 30S,進(jìn)行36個循環(huán)；再在72°C保持5min，最終保持在4 °e，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。本發(fā)明的試劑盒對ApoE (rs429358) (SEQ ID NO. I)和 ApoE (rs7412)(SEQ ID NO. 2)目標(biāo)序列進(jìn)行分析和檢測；其中，rs429358目標(biāo)序列包括野生型TGCGGCCGCCTGGTGC (SEQ ID NO. 7)和突變型 CGCGGCCGCCTGGTGC (SEQ ID NO. 8)，擴(kuò)增出的片段長度為185bp ；rs7412目標(biāo)序列包括野生型AGCGCCTGGCAGTGT (SEQ ID NO. 9)和突變型 AGTGCCTGGCAGTGT (SEQ ID NO. 10)，擴(kuò)增出的片段長為 185bp。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對ApoE基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于臨床上AD易感基因ApoE基因檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖I為本發(fā)明ApoE (rs429358) TT焦磷酸測序結(jié)果；
圖2為本發(fā)明ApoE (rs7412) CC焦磷酸測序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對上述試劑盒及檢測方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例I :
ApoE (rs429358)上游引物:5,-AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C_3, (SEQ ID NO. 3)；ApoE (rs7412)上游引物5r- AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C -3, (SEQ ID NO. 3)；ApoE (rs429358)下游引物:5,-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)；ApoE (rs7412)下游引物:5,- CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)；
ApoE (rs429358)測序引物:5,- GAC ATG GAG GAC GTG -3, (SEQ ID NO. 5)；
ApoE (rs7412)測序引物:5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3, (SEQ ID NO. 6)；
I. DNA提取
I. I實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下
(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng)標(biāo)識處打勾V ; (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。 I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應(yīng)標(biāo)本唯一性標(biāo)識做好標(biāo)記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室溫離心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；
I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管,振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；
I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；
I.20在實(shí)驗(yàn)臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側(cè)放風(fēng)干；
I.21目測沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標(biāo)清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護(hù)；
1.24保存核酸標(biāo)本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應(yīng)2.I在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制50 Ul PCR擴(kuò)增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
10 <PCR buffer10_0ul
dNTP3 JDui
LOul
上游引物‘
(毎種引物加C.50)
LOul
下游引物'
(每種引物加
rTaqLOul
水30..0jil
注上游引物和下游引物各有兩種，這里的I. Oiil是指每種上游引物各加0. 5iU，以及每種下游引物各加0.5U1。2. 2在標(biāo)本制備區(qū)對盛有g(shù)DNA模板短暫離心后添加4. 0 U I至擴(kuò)增體系中，在PCR管壁上標(biāo)記標(biāo)本唯一丨丨生標(biāo)識，管蓋上標(biāo)記檢測項(xiàng)目代號。PCR管震蕩混勻,桌面離心機(jī)上短暫離心；
2.3在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀
UIPJUiI處禪時間IWWfi
195—C丨 5mill 5
295 TI 30s I
352T30s1
4701'30s 丨for
I丨Mcyde
amiw i
372 C丨I
618.C丨 iioitiiiig 丨
__I_；_
2.4設(shè)置程序后在隨后的下拉菜單中選擇“tube”；
2.5點(diǎn)擊“ start ”開始儀器運(yùn)行。3.焦磷酸測序單鏈樣本純化
3.I純化前試劑和儀器準(zhǔn)備
進(jìn)行樣本純化前，確保所有溶液都達(dá)到室溫；打開精密控溫加熱爐，使溫度達(dá)到80°C。3. 2單鏈樣本純化操作
3.2. I 在 PSQ 96 板中先加 40 u IAnnealing Buffer 和 2 3 U I 測序引物(IOuM)；
3.2. 2在振蕩器上充分混勻Sepharose Beads ；
3.2. 3將所需Sepharose Beads量(每樣本3 U I計(jì)算)轉(zhuǎn)移到I. 5mL Eppendorf管；3. 2. 4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer,使得平均每個樣品約有和PCR體系一樣的體積，在振蕩器上將混合物充分混勻；
3. 2. 5將Sepharose Beads混合物加至約40 U I PCR產(chǎn)物中，每樣本加40 U I ；
3. 2. 6常溫下、在振蕩器上將PCR板混勻10分鐘；
3. 2. 7在Vacuum prep workstation中，四個液體槽中依次加入180ml純水、120ml70% 乙醇、Denaturation Buffer 和 Washing Buffer ；
3. 2. 8倒掉與真空泵相連的廢液收集桶中的廢液；
3. 2. 9 打開 Vacuum Prep Workstation 的真空泵和閥門，將 Vacuum Prep Tool 在純水中清洗30秒；
3. 2. 10將Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取結(jié)合了生物素標(biāo)記核酸的·Sepharose Beads ；
3. 2. 11拿起PCR板,檢查Beads是否都被吸附在了 Vacuum Prep Tool上；
3. 2. 12 將 Vacuum Prep Tool 放入 70% 乙醇中 5 秒；
3. 2. 13 將 Vacuum Prep Tool 移到 Denatureation Buffer 中 5 秒；
3. 2. 14 再將 Vacuum Prep Tool 移到 Washing Buffer 中清洗 10 秒；
3. 2. 15把Tool懸放在Pyro反應(yīng)板；
3. 2. 16 Vacuum Prep Tool放入含有測序引物的反應(yīng)板中，旋轉(zhuǎn)搖動，以釋放Sepharose Beads ；
3. 2. 17放有純化樣本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80°C加熱爐中加熱2min,取出后自然冷卻到室溫,進(jìn)行下游Pyrosequencing反應(yīng)。3. 3純化完畢后清洗
3. 3. I不開真空泵和閥門，使用少量純水清洗Vacuum Prep Tool,使少量未脫落的Beads洗脫下來；
3. 3. 2更換純水后再打開真空泵和閥門，用約300mL純水清洗Tool ；
3.3. 3關(guān)掉真空泵和閥門，將Vacuum Prep Tool側(cè)放,室溫晾干；
3.3. 4清洗所有盛裝試劑溶液的塑料槽，自然晾干；
3.3. 5用濕布擦拭純化設(shè)備表面。4.焦磷酸測序
4.I調(diào)入前述設(shè)定的運(yùn)行程序文件，點(diǎn)擊“View”的下拉鍵，選擇“Run”，按照軟件自動計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)的各試劑使用量，添加各試劑成分至試劑倉；
4.2把準(zhǔn)備好的樣本和試劑艙放入儀器相應(yīng)的位置，點(diǎn)擊屏幕右下端的“Run”開始焦磷酸測序；
4.3檢測完成后，首先點(diǎn)擊軟件進(jìn)程狀態(tài)窗口的“close”鍵以保存測序結(jié)果。5.焦磷酸測序結(jié)果分析
在“SNP Runs”文件夾中雙擊鼠標(biāo)，打開上述運(yùn)行文件，選擇“SNP mode”，點(diǎn)擊“AnalyzeAll”鍵，對所有檢測標(biāo)本進(jìn)行基因型分析；選擇“AQ mode”，點(diǎn)擊“Analyze All”鍵，對所有檢測標(biāo)本進(jìn)行等位基因頻率分析。對樣本檢測ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態(tài)性，焦磷酸檢測結(jié)果如圖f 2?？梢钥闯?，采用本發(fā)明的試劑盒及方法，能夠簡捷、直觀、準(zhǔn)確的對ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測和判讀。圖I提示ApoE(rs429358)為野生型純合子，圖2提示ApoE (rs7412)為野生型純合子。臨床醫(yī)生可根據(jù)ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態(tài)性，判斷出不同基因型患者使用AD發(fā)生的風(fēng)險。綜上，本發(fā)明所選取的靶序列，以及應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)·用、經(jīng)濟(jì)的檢測ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態(tài)性，能夠滿足臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作的要求，利于AD發(fā)生風(fēng)險的預(yù)測。
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物 (1)擴(kuò)增引物上游引物5 ^AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C-3^ ；下游引物5'-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3'；其中，下游引物的5'進(jìn)行生物素標(biāo)記； (2)測序引物:5,-GACATG GAG GAC GTG-3,； 5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3,。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測ApoE基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提??； (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制 50 ill PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 3. Oyl，上游引物l.Oul,下游引物 l.Oul, rTaql. OiU，水 30. OiU，模板 4. OiU ;循環(huán)程序?yàn)?5 oC 5min預(yù)變性；依次在95°C 30S,52°C 30S,70°C 30S，進(jìn)行36個循環(huán);72°C保持5min，最終保持在4 °e，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態(tài)性試劑盒及方法。具體是指ApoE(rs429358)和ApoE(rs7412)單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包含如SEQ ID NO.3—6所示的引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、高通量ApoE(rs429358)和ApoE(rs7412)的檢測，從而達(dá)到對AD發(fā)生風(fēng)險的預(yù)測。
文檔編號C12Q1/68GK102676669SQ20121013538
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者周宏灝 申請人:周宏灝