專利名稱：成熟油菜次生休眠種子rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及成熟油菜次生休眠種子高質(zhì)量RNA的快速提取。
背景技術(shù)：
RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的必要前提。只有分離得到純度高、完整性好的高質(zhì)量總RNA，才能用于RT-PCR、cDNA合成、RNA序列分析、純化mRNA以用于蛋白質(zhì)體外翻譯或構(gòu)建cDNA文庫(kù)，以及mRNA差異顯示、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等后續(xù)的分子生物學(xué)研究。油菜種子屬脂肪質(zhì)種子，含有大量的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖、維生素和多酚等物質(zhì)，嚴(yán)重影響了 RNA的提取。因此油菜種子總RNA的提取比較困難，常規(guī)的Trizol Reagent Kit、異硫氰酸胍一步法等已報(bào)道的植物組織總RNA提取方法都不適用于油菜種子。目前已有不完全成熟或新鮮的油菜種子RNA提取成功的報(bào)道，如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的CTAB法(丁勇等.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2006,25(5) :465-468)、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)選用TIANGEN公司裂解液RL并加以優(yōu)化的方法(嚴(yán)明理等.生物技術(shù)通報(bào).2007，6:97-100)等。然而，我們將上述方法應(yīng)用于成熟油菜次生休眠(secondary dormancy)種子RNA的提取，在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件情況下卻未能獲得穩(wěn)定可靠的提取結(jié)果。油菜種子具有顯著的次生休眠特性(所謂次生休眠，是指原來不休眠或解除休眠后的種子由于干旱等不適宜環(huán)境條件的影響而誘發(fā)的休眠)，明確油菜種子次生休眠的分子機(jī)制，可以為人工調(diào)控油菜種子休眠特性提供理論依據(jù)。而高質(zhì)量地提取成熟油菜次生休眠種子的RNA則是研究種子休眠分子機(jī)制的重要前提。抑制內(nèi)源RNA酶的活性、防止RNA降解是RNA提取的關(guān)鍵技術(shù)，特別是在成熟的油菜次生休眠種子RNA提取過程中。因?yàn)槌墒斓挠筒朔N子老健組織部分富含RNA酶，加之種子進(jìn)入休眠狀態(tài)后，生理活性大大降低，使得油菜種子RNA的分離效果和完整性都難以保障。而采用已有的新鮮油菜種子或不完全成熟油菜種子RNA提取方法，則存在著試劑消耗量大、提取時(shí)間長(zhǎng)(1-8. 5小時(shí))等缺點(diǎn)，尤其是提取時(shí)間過長(zhǎng)直接增加了 RNA受污染而降解的可能性，并最終導(dǎo)致提取失敗。因此，縮短提取時(shí)間、抑制內(nèi)源RNA酶活性、減少與防止RNA降解是成熟油菜次生休眠種子RNA提取的最為核心技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供成熟油菜次生休眠種子高質(zhì)量RNA的快速提取方法。本發(fā)明提供的方案是選用RNA plant plus reagent植物總RNA提取試劑，通過β -巰基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚類物質(zhì)氧化，應(yīng)用醋酸鈉去除多糖類物質(zhì)對(duì)RNA的影響，并減少抽提次數(shù)。按照本方法，完成次生休眠油菜種子RNA的提取僅需30分鐘左右，且RNA質(zhì)量好、純度高。所述步驟包括
(I)取O. Ig成熟的油菜次生休眠種子放入加有液氮的研缽中，迅速磨成粉末；(2)將步驟(I)制得的粉末加 入含有RNAplant plus植物總RNA提取試劑的離心管，振蕩至徹底混勻。室溫平放離心管靜置，再加入預(yù)冷的苯酚-氯仿-異戊醇(25 241)混勻，4。。13000rpm 離心 4_5min ；
(3)將步驟(2)制得的上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入預(yù)冷的醋酸鈉和無水乙醇，倒轉(zhuǎn)2-3次混勻后冰上靜置，4°C 13000rpm離心4min，棄上清，乙醇洗沉淀，室溫下干燥，用RNase-free ddH20溶解沉淀即得。優(yōu)選的，所述步驟(2)中每百毫克油菜種子粉末中加入RNA plant plus reagent(TIANGEN公司生產(chǎn)，使用前按照體積比I :4加入β -巰基乙醇與RNAplant plus reagent混合)800μ1。優(yōu)選的，所述的步驟(2)中苯酚-氯仿-異戊醇用量為500 μ I。優(yōu)選的，所述的步驟(2)和步驟(3)中的靜置時(shí)間為5 min。優(yōu)選的，所述的步驟(3)中醋酸鈉濃度為3mol/L、pH值為5. 2，用量為70μ1。優(yōu)選的，所述的步驟(3)中無水乙醇用量為1400μ1。優(yōu)選的，所述的步驟(3)中的乙醇洗沉淀為75%乙醇洗滌，洗滌次數(shù)為2次。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是現(xiàn)有技術(shù)雖然可以提取不完全成熟或新鮮油菜種子的RNA，但卻不能成功應(yīng)用于成熟的油菜次生休眠種子RNA的提取，且試劑消耗量大、提取時(shí)間長(zhǎng)，直接增加了 RNA被降解的可能性。本發(fā)明提供的成熟油菜次生休眠種子RNA提取方法，不僅具有新穎性的要求，還具有提取過程省時(shí)便捷、提取結(jié)果穩(wěn)定可靠的實(shí)用性。因此，本發(fā)明為成熟油菜次生休眠種子高質(zhì)量RNA的快速提取提供了有效方法，同時(shí)也為后續(xù)的分子生物學(xué)研究提供了重要的技術(shù)支持。


圖I為應(yīng)用本發(fā)明提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子);
圖2為應(yīng)用前人方法提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子);
圖 3 為 Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer 文庫(kù)質(zhì)檢圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明
實(shí)施例成熟油菜次生休眠種子總RNA提取及其標(biāo)準(zhǔn)mRNA文庫(kù)構(gòu)建 I ·油菜次生休眠種子總RNA提取
(1)取O.Ig成熟的油菜次生休眠種子放入加有液氮的研缽中，迅速研磨成粉末；
(2)將步驟(I)制得的粉末加入含有800μ1RNA plant plus植物總RNA提取試劑(使用前按照體積比I :4加入β -巰基乙醇與RNAplant plus reagent混合)的離心管,潤(rùn)旋振蕩至徹底混勻。室溫下平放離心管靜置5 min，再加入500μ1預(yù)冷的苯酚-氯仿-異戊醇(25 :24 :1)混勻，4°C 13000rp m 離心 5min,取上清液；
(3)將步驟(2)制得的上清液轉(zhuǎn)移至一新離心管中，加70μ1的3mol/L的醋酸鈉和1400μ1的無水乙醇，倒轉(zhuǎn)2-3次混勻后冰上放置3_5min，4°C 13000rpm離心4min，棄上清，75%乙醇洗沉淀2次，室溫下干燥，用RNase-free ddH20溶解沉淀即得，質(zhì)檢后放置_70°C冰箱備用。質(zhì)量檢測(cè)應(yīng) 用本方法，得到成熟油菜次生休眠種子RNA150微克，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，RNA完整性好，260/280為2. 05，完全滿足后續(xù)的分子生物學(xué)研究需要(附圖I)。而使用前人方法提取休眠種子RNA的質(zhì)量極不穩(wěn)定，降解較為嚴(yán)重(附圖2)。圖I所示為應(yīng)用本發(fā)明提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子；圖2所示為應(yīng)用前人方法提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子。II .從總RNA中提取mRNA及mRNA的打斷
Cl)決定起始總RNA的量，取O. l-4ug的起始總RNA。用移液槍吸取總RNA到一個(gè)無RNA酶的200ul PCR管中，加入RNase free的無菌水補(bǔ)足至50ul。(2)加入 50ul RNA Purification Beads (純化珠)，混勻。(3) 65° C 反應(yīng) 5min，使 RNA 變性。(4) PCR儀溫度降到4° C后，取出，室溫放置5min。(5)將EP管置于磁力架上靜置5min，吸棄上清。(6)將EP管從磁力架上取下，加入200ul BffB (磁珠洗滌緩沖液)，混勻，置于磁力架上靜置5min,棄上清。(7)從磁力架上取下，加入50ul EB (溴化乙錠)，混勻。(8)80° C反應(yīng)2min，待溫度降到25° C后，取出置于室溫。(9)加入50ul BBB (磁珠結(jié)合緩沖液)，混勻，室溫靜置5min。(10)將EP管置于磁力架上靜置5min，吸棄上清。(11)將EP管從磁力架上取下，加入200ul BffB (磁珠洗滌緩沖液)，混勻，置于磁力架上靜置5 min,棄上清。(12)加入 19.5ul Elute (洗脫液)，Prime (引物)，F(xiàn)ragment Mix(片段混合液),混勻。(13)94° C反應(yīng)8 min將RNA打斷，待溫度降到4° C后，取出。III.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
(1)第一鏈的合成
將上述溶液置于磁力架上5 min，吸取17 ul上清于新的200 ul PCR管中，加入IulSuperScript II (逆轉(zhuǎn)錄酶)及 7ul First Strand Master Mix (第一鏈合成混合溶液)，混勻。按照以下程序第一鏈的合成
25° C IOmin
42° C 50min 70° C 15min 4° C hold(保溫)
(2)第二鏈的合成
向第一鏈混合液中加入25 ul Second Strand Master Mix (第二鏈合成混合溶液)，混勻。16° C恒溫孵育Ih。(3)使用AMPure XP beads (磁珠純化法)純化向50ul ds cDNA中加 入90ul AMPure XP beads (磁珠純化試劑)，混勻。室溫靜置15min，置于磁力架上，室溫5min。吸除上清。加入200ul 80%乙醇，室溫30s后吸除上清。重復(fù)上一步驟。將EP管室溫靜置15min以晾干，加入52. 5ul Resuspension Buffer (重懸液)，混勻。室溫2min后，置于磁力架上靜置5min。吸出50min上清于新的200ulPCR管中。IV .末端修復(fù)
(I)配置 End Repair Control (末端修復(fù)質(zhì)控)溶液向"ul ResuspensionBuffer (重懸緩沖液)中加入Iul End Repair Control (末端修復(fù)質(zhì)控)溶液,并混勻。(2)向50ul ds cDNA中加入IOul上述配好的溶液。(3)向其中加入40 ul End Repair Mix (末端修復(fù)混合溶液)，并混勻
(4)恒溫30° C孵育30min后取出。(5)使用AMPure XP beads (磁珠純化法)純化。V . 3’末端腺苷酸化
(1)制備A-Tailing Control (末端腺苷酸質(zhì)控)稀釋液1 μ I A -Tailing Control+ 99 μ I Resuspension Buffer (重懸緩沖液)；
(2)加2. 5 μ I 稀釋的 A - Tailing Control，充分混勻；
(3)加12.5 μ I A - Tailing Mix (末端腺苷酸混合液)；
(4)37° C 反應(yīng) 30 min ；
(5)立即進(jìn)行Adapters(接頭)連接反應(yīng)。VI .連接 Adapters (接頭)
(1)制備LigaseControl (連接酶質(zhì)控)稀釋液I μ I Ligase Control (連接酶質(zhì)控)+ " μ I Resuspension Buffer (重懸緩沖液)；
(2)依次加入2.5 μ I Ligase Control (連接酶質(zhì)控)稀釋液,2. 5 μ I Ligase Mix (連接反應(yīng)混合液)，2. 5 μ I Adapter Index,充分混勻；
(3)30 ° C 反應(yīng) 10 min ；
(4)加5μ Stop Ligase Mix (終止連接反應(yīng)混合液)，充分混勻；
(5)AMPure XP Beads純化兩次，吸上清，-20° C保存。VD.DNA片段的富集
(1)分別加入5μ Primer Cocktail (引物混合物)和25 μ I Master Mix(預(yù)混合液)，充分混勻；
(2)設(shè)置如下PCR程序
a.98。 C for 30 秒
b.15 cycles of (循環(huán)次數(shù) 15 次)
98。 C for 10 秒
60。 C for 30 秒 72。 C for 30 秒
c.72° C for 5 分鐘
d.4° C保溫
(3)AMPure XP beads 純化，吸上清，-20° C 保存。質(zhì)量檢測(cè)經(jīng)Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer(安捷倫科技公司 2100自動(dòng)生物分析系統(tǒng))檢測(cè)，文 庫(kù)質(zhì)檢合格，如圖3，說明本發(fā)明提取的RNA能滿足高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣品要求。
權(quán)利要求
1.成熟油菜次生休眠種子RNA的提取方法,選用RNAplant plus reagent植物總RNA提取試劑，通過β -巰基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚類物質(zhì)氧化，應(yīng)用醋酸鈉去除多糖類物質(zhì)對(duì)RNA的影響，并減少抽提次數(shù)，縮短提取時(shí)間，其步驟包括 (1)取O.Ig成熟的油菜次生休眠種子放入加有液氮的研缽中，迅速磨成粉末； (2)將步驟(I)制得的粉末加入含有RNAplant plus植物總RNA提取試劑的離心管，渦旋振蕩至徹底混勻；室溫靜置，再加入預(yù)冷的苯酚-氯仿-異戊醇(25 24 1)混勻，4°C 13000rpm離心5min,取上清液； (3)將步驟(2)制得的上清液轉(zhuǎn)移至一新離心管中，加入醋酸鈉和無水乙醇，倒轉(zhuǎn)2-3次混勻后冰上靜置，4°C 13000rpm離心4min，棄上清，乙醇洗沉淀，室溫下干燥，用RNase-free ddH20溶解沉淀即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述步驟(2)中每百毫克油菜種子粉末中加入RNAplant plus reagent提取試劑(TIANGEN公司生產(chǎn),使用前按照體積比I :4加入β-巰基乙醇與 RNAplant plus reagent 混合)700_1000μ1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述的步驟(2)中苯酚-氯仿-異戊醇(2524 :1)用量為 400-600μ1。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述的步驟(2)和步驟(3)中的靜置時(shí)間為3-5min0
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述的步驟(3)中醋酸鈉濃度為3mol/L、pH值為5.2，用量為60-80μ1。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,所述的步驟(3)中無水乙醇用量為1300-1500μ1。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述的步驟(3)中的乙醇洗沉淀為75%乙醇洗滌，洗滌次數(shù)為1-2次。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及成熟油菜次生休眠種子高質(zhì)量RNA的快速提取方法。所述的方法選用RNAplantplusreagent植物總RNA提取試劑，通過β-巰基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚類物質(zhì)氧化，應(yīng)用醋酸鈉去除多糖類物質(zhì)對(duì)RNA的影響，并減少抽提次數(shù)。使用本發(fā)明方法完成油菜次生休眠種子RNA的提取僅需30分鐘，且RNA質(zhì)量好、純度高，并具有試劑用量少、經(jīng)濟(jì)節(jié)約等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于后續(xù)的mRNA分離、純化、建庫(kù)以及高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本發(fā)明為探明油菜種子次生休眠的分子機(jī)制提供了重要的技術(shù)保障，同時(shí)也可為其他多糖、多酚類植物的成熟休眠種子RNA提取提供技術(shù)參考。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102634511SQ201210135479
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者劉福霞, 盧長(zhǎng)明, 唐瑭, 王興龍, 趙祥強(qiáng), 趙祥祥 申請(qǐng)人:淮陰師范學(xué)院