專利名稱：小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY79及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及小麥耐鹽、抗旱WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaMKY79 的克隆及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來土壤鹽潰化及水資源短缺是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問題。鹽害與干旱不僅嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，造成作物減產(chǎn)，而且使生態(tài)環(huán)境日益惡化(Saibo et al.， Annals of Botany, 2009, 103 (4) :609-623)0因此，提高作物的抗旱和/或耐鹽能力已經(jīng)成為現(xiàn)代作物育種工作急需解決的關(guān)鍵問題之一。分離克隆耐鹽基因，培育耐鹽新品種已成為全世界的研究熱點(diǎn)之一。小麥?zhǔn)侵匾霓r(nóng)作物，克隆耐鹽、抗旱基因，培育耐鹽、抗旱小麥新品種已成為當(dāng)前一個(gè)十分迫切的任務(wù)。目前利用基因工程技術(shù)開展植物耐鹽、抗旱方面的研究已取得了較大的的進(jìn)展。 一些實(shí)驗(yàn)表明，將植物本身以及其他生物中與耐鹽相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入植物中，可以使轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽能力提高(Chinnusamy et al. , Crop science, 2005, 45:437-448·) 。轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)和環(huán)境脅迫響應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。目前，已發(fā)現(xiàn)了一些能顯著提高植物耐鹽能力的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，將這些基因轉(zhuǎn)化到植物中，可以明顯提高植物的耐鹽能力(Nakashima K. , Plant Physiology, 2009, 149: 88 - 95·)。WRKY是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，其成員廣泛參與植物的正常生長發(fā)育和對各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)過程。轉(zhuǎn)基因研究實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因可提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽和耐旱性。例過表達(dá)大 的GmWRKY54基因可使轉(zhuǎn)基因擬南介的耐鹽和耐旱性提聞 (Zhou et al. , Plant Biotechnology Journal, 2008, 6, 486-503.) 將大麥的//FfSXTJS 轉(zhuǎn)入牧草可提高轉(zhuǎn)基因牧草的生物量和耐旱性(Xiong et al. , Molecular Breeding, 2010, 25: 419 - 432.)。AtWMY25、AtWRKY33過表達(dá)擬南芥也增加了對鹽脅迫的耐受性。 目前有關(guān)小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子在耐鹽方面的研究還非常有限，Niu et al研究表明過表達(dá)
和可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽和耐旱性(Niu et al.，Plant cell and environment, 2012)。進(jìn)一步克隆小麥耐鹽、旱相關(guān)基因，通過基因工程培育小麥耐鹽、耐旱新品種非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供了一種首次從小麥中分離出一個(gè)耐鹽、抗旱的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為將該基因連接到過表達(dá)載體pCAMBIA super 1300上，利用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生物量、耐鹽性、抗旱能力均比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晏岣?。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY79，TaWRKY79基因的cDNA 序列如SEQ ID No. I所示,氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY79的制備方法首先根據(jù)小麥的基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)選出在小麥幼苗根中受鹽脅迫顯著上調(diào)表達(dá)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因(探針)，然后根據(jù)探針序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，進(jìn)一步從小麥根的全長cDNA文庫中克隆其全長cDNA，最后構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中進(jìn)行功能研究。I.引物設(shè)計(jì)
根據(jù)芯片探針序列設(shè)計(jì)基因特異性的下游引物Wrkyl-1:5丨-GCTGCATCCACTCTAGAATGT CG-3'，與文庫的5'端錨定引物NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’進(jìn)行配對，以小麥幼苗根的全長cDNA文庫為模板擴(kuò)增基因的全長cDNA。
2. PCR反應(yīng)體系(50μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文庫 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至終體積50 μ I
94°C 預(yù)變性 3min ;94°C變性 45sec，58°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 2min，循環(huán) 35 次；72°C 延伸5min。3. 1%瓊脂糖凝膠電泳
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)在IOOObp處有一條目的條帶(圖I)。4.擴(kuò)增片段的回收、與T載體的鏈接
對擴(kuò)增條帶采用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物與 pGEM-T (Promega)載體連接,連接體系為
回收的PCR產(chǎn)物7μ1
10 X Τ4連接酶緩沖液 μ
pGEM-T 載體(50ng/ μ I) μ
T4DNA 連接酶(3U/ μ I) (Takara) μ 于4 °C冰箱連接過夜。5.回收片段的克隆與測序
用CaCl2法制備大腸桿菌DH5a (購自天為時(shí)代生物公司)感受態(tài)細(xì)胞，42°C水浴熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。向轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混勻，用涂布器將其均勻涂到含有氨芐青霉素的平板上，37°C恒溫倒置培養(yǎng)過夜，待出現(xiàn)明顯單菌落時(shí)將平板拿出。根據(jù)所用pGEM-T載體克隆位點(diǎn)兩端的T7啟動子和SP6啟動子序列設(shè)計(jì)通用引物 T7，SP6對重組克隆進(jìn)行PCR鑒定。PCR 程序94°C 預(yù)變性 IOmin ;94°C變性 lmin，58°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán)35次；72°C延伸5min ；
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，取陽性克隆的菌液送公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果見 SEQ ID No. I。本發(fā)明還提供小麥耐鹽、抗旱基因在培育耐鹽、抗旱植物中的應(yīng)用。尤其是在普通小麥、玉米和水稻植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明首次克隆得到了小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY79, 將該基因連接到過表達(dá)載體pCAMBIA super 1300上，利用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生物量、耐鹽性、抗旱能力均比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昝黠@提高。


圖I 7 腸基因全長cDNA序列的擴(kuò)增結(jié)果。M :DNA分子量marker。圖2不同處理?xiàng)l件下TaWRKY79基因在小麥山融3號幼苗根和葉中的RT-PCR表達(dá)分析。TaActin為內(nèi)參；leaf :葉；root :根。圖3構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA_superl300/TaWRKY79的酶切驗(yàn)證結(jié)果。圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定。1，2，6:不同的轉(zhuǎn) 基因擬南芥株系，Col-O野生型擬南芥。圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的表型鑒定。A、B :正常生長條件下對照和轉(zhuǎn)基因株系的表型。C :不同處理?xiàng)l件下植株的表型。D-H :不同處理?xiàng)l件下對照及轉(zhuǎn)基因株系植株根長統(tǒng)計(jì)結(jié)果。I :野生型擬南芥和TaWRKY79轉(zhuǎn)基因擬南芥不同株系干旱2周、復(fù)水3天后的表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、TaWRKY79基因cDNA序列的克隆
I.引物設(shè)計(jì)
根據(jù)芯片探針序列設(shè)計(jì)基因特異性的下游引物Wrkyl-1:5丨-GCTGCATCCACTCTAGAATGT CG-3'，與文庫的5'端錨定引物NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’進(jìn)行配對，以小麥幼苗根的全長cDNA文庫為模板擴(kuò)增基因的全長cDNA。2. PCR反應(yīng)體系(50 μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文庫 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至終體積50 μ I
94°C 預(yù)變性 3min ;94°C變性 45sec，58°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 2min，循環(huán) 35 次；72°C 延伸5min。3. I %瓊脂糖凝膠電泳
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)在IOOObp處有一條目的條帶(圖I)。4.擴(kuò)增片段的回收、與T載體的鏈接
對擴(kuò)增條帶采用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物與 pGEM-T (Promega)載體連接,連接體系為回收的PCR產(chǎn)物7μ1
10 X Τ4連接酶緩沖液 μ
pGEM-T 載體(50ng/ μ I) μ
T4DNA 連接酶(3U/ μ I) (Takara) μ 于4 °C冰箱連接過夜。5.回收片段的克隆與測序
用CaCl2法制備大腸桿菌DH5a (購自天為時(shí)代生物公司)感受態(tài)細(xì)胞，42°C水浴熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。向轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混勻，用涂布器將其均勻涂到含有氨芐青霉素的平板上，37°C恒溫倒置培養(yǎng)過夜，待出現(xiàn)明顯單菌落時(shí)將平板拿出。根據(jù)所用pGEM-T載體克隆位點(diǎn)兩端的T7啟動子和SP6啟動子序列設(shè)計(jì)通用引物 T7，SP6對重組克隆進(jìn)行PCR鑒定 。PCR 程序94°C 預(yù)變性 IOmin ;94°C變性 lmin，58°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán)35次；72°C延伸5min ；
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，取陽性克隆的菌液送公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果見 SEQ ID No. I。實(shí)施例2、不同處理?xiàng)l件下TaWRKY79基因的表達(dá)分析 I.材料處理
小麥山融3號的種子室溫萌發(fā)，I周后去掉胚乳，用Hangload液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)I周進(jìn)行脅迫處理。鹽脅迫在Hangload液體培養(yǎng)基中添加NaCl至終濃度為200mM ；
滲透脅迫培養(yǎng)基中添加PEG至終濃度為18% ；
ABA處理培養(yǎng)基中添加ABA至終濃度為100 μ M ;
4°C冷處理將液體培養(yǎng)的小麥幼苗移至4°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
不同條件下處理0、0. 5、3、12、24，48小時(shí)后分別取幼苗的葉片和根系，提取各種材料的總RNA。2.小麥總RNA提取
Trizol法提取RNA。PMgrose凝膠電泳檢測提取的RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測提取的RNA濃度。3.第一鏈cDNA的合成
采用PrimeScript RT-PCR KU，反應(yīng)步驟按操作手冊進(jìn)行。4. RT-PCR反應(yīng)及電泳
1.以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物如下 TaAct-S: 5' - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3/
TaAct-A: 5' - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3/
WRKYrt-I: 5' -AAGGCTCTGGCGGCAGGAAG-3,
WRKYrt-2: 5' -GCTGCATCCACTCTAGAATGTCG-3'
2.PCR體系
ddH204. 7 μ I
IOX buffer2 μ IPrimerl (2 μ Μ)I μ I
Primer2 (2 μ Μ)I μ I
dNTP (IOmM each)O. 2 μ I
rTaq polymerase (5U/μ I) O. I μ I 逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板I μ I
Total Volume10 μ I 3.PCR程序
94°C 5min ;根據(jù)基因表達(dá)量不同設(shè)置 25 30 cycles, 94°C 20s, 57 °C 60s, 72 °C 45s ；72°C 5min。4. I %瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果見圖2。實(shí)施例3、TaWRKY79過表達(dá)植物表達(dá)載體的構(gòu)建
植物表達(dá)載體pCAMBIA-superl300是含有35S啟動子和NPT II基因的雙元載體，在其多克隆位點(diǎn)上含有限制性內(nèi)切酶油al位點(diǎn)。根據(jù)基因TaWRKY79的cDNA序列，設(shè)計(jì)包含完整 ORF 的基因特異性引物 Wrkyo5: 5' -GCTCTAGAATGGACGAGCAGTGGATGATC-3' (XbaI) 和 Wrkyo3:5' -GCTCTAGACGCTCGCTTGATCAACTATCG-3' (XbaI)。用該對弓 I物擴(kuò)增 TaWRKY79 的cDNA序列。然后用限制性內(nèi)切酶油<31酶切載體pCAMBIA-Superl300和擴(kuò)增的目的基因 TaWRKY79序列。完全酶切的載體和目的基因經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，連結(jié)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，PCR檢測陽性克隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證插入方向的正確性，構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA-superl300/TaWRKY79。步驟如下
(I)質(zhì)粒pCAMBIA-superl300空載體和目的基因片斷油al單酶切酶切體系如下
Xbal2 μ I
pCAMBIA-super 1300 載體 (或目的基因片段)10 μ I
IOXBuffer M2 μ I
ddH20 To40 μ I
于37°C恒溫水浴鍋酶切3小時(shí)以上。(2)酶切產(chǎn)物的電泳與回收
酶切完成后，以I X TAE為電泳緩沖液，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下經(jīng)酶切的pCAMBIA-SUper1300載體大片段和目的基因片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。(3)連接
經(jīng)酶切的pCAMBIA-SUper1300載體片段和目的基因片段以摩爾比1:4的比例進(jìn)行4°C 連接過夜。(4)轉(zhuǎn)化
連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固體平板上37°C培養(yǎng)16小時(shí)左右。(5)重組子的鑒定
PCR檢測陽性克隆，提取質(zhì)粒，選擇基因內(nèi)的BamHI單酶切位點(diǎn)和載體上的BamHI酶切位點(diǎn)對質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定目標(biāo)片段插入方向。酶切產(chǎn)物經(jīng)I %的瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)切下的目的條帶的大小判斷目的基因插入載體中的方向，選取正向插入克隆的質(zhì)粒，完成載體構(gòu)建(圖3)。將構(gòu)建好的載體pCAMBIA-superl300/TaWRKY79轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101， 轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行基因功能分析。實(shí)施例4、基因的功能分析一擬南芥轉(zhuǎn)化、篩選及表型分析 (O擬南芥的種植
將野生型擬南芥種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和O. 01% Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無菌水漂洗5-6次，點(diǎn)播于MS平板上，于4° C春化2_3天。 然后移植到營養(yǎng)缽中 (營養(yǎng)土與蛭石按等比例混合)，23° C培養(yǎng),16/8 h光周期,光強(qiáng) 30-40 μ mol*m-2 · s_l ;待植株開花后,到去其主枝頂端,促進(jìn)側(cè)枝發(fā)展。在到枝后的4_6 天內(nèi)，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。(2)擬南芥轉(zhuǎn)化
把200 ml菌液倒入淺盤中。將修剪好的擬南芥倒扣并使所有花序浸入懸浮菌液中，輕輕攪動沾花30 sec-1 min0取出花盆側(cè)放于托盤中，用保鮮袋包裹以保濕。將托盤置暗處培養(yǎng)24 ho然后取出營養(yǎng)缽并直立放置，恢復(fù)光照，繼續(xù)培養(yǎng)植株至成熟。(3)陽性植株的篩選T0代種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和 O. 01% Triton-XlOO)消毒后，點(diǎn)播在MS選擇培養(yǎng)板(30 mg/L潮霉素)上。于4°C下春化 2-3天。移入培養(yǎng)室中培養(yǎng)。大約10天左右，挑選潮霉素抗性植株(長出真葉1-2對，根伸長至培養(yǎng)基中)并移栽到營養(yǎng)缽中。培養(yǎng)直至種子成熟。同樣方法篩選Tl代種子得到T2 代植株。并在T2代植物中挑選抗性比為3:1的單拷貝插入獨(dú)立株系，并獲得純合T3代株系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測和表型鑒定。(4)轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定擬南介基因組DNA的提取
CTAB法提取野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的基因組DNA。擴(kuò)增
以上面提取的擬南芥基因組DNA為模板，用基因特異性引物Wrkyo5，Wrkyo3 (序列同實(shí)施例3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系及程序同實(shí)施例I。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測到在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中擴(kuò)增出一條IOOObp左右的目的條帶，在未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛形匆姅U(kuò)增條帶 (圖 4)。(5)轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定 ①擬南芥的種植
T3代單拷貝純合擬南芥株系的種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和O. 01% Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無菌水漂洗5-6次，點(diǎn)播于MS平板上，于4° C春化 2-3天，然后移植到營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土與蛭石按等比例混合)，23° C培養(yǎng)，16/8 h光周期， 光強(qiáng) 30-40 μ mol*m-2 · s_l。②脅迫處理
將萌發(fā)5天的擬南芥幼苗(對照及轉(zhuǎn)基因株系)小心移栽到營養(yǎng)土中，或轉(zhuǎn)移到分別含有 IOOmM NaClUOOmM甘露醇、IOmM LiCl、2yM ΑΒΑ、O. 75 μ M NAA和對照MS培養(yǎng)基平板上，豎直培養(yǎng)一周觀察表型。結(jié)果表明正常培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ站哂休^好的生長勢，生物量增加(圖5A，B)。在不同處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株的根系明顯長于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?圖5C-H)。干旱處理將萌發(fā)一周的擬南芥幼苗(對照及轉(zhuǎn)基因株系)移載至培養(yǎng)土中，培養(yǎng)I 周后開始控水(不澆水)干旱處理。干旱處理2周后觀察表型。結(jié)果表明干旱處理2周后，未轉(zhuǎn)基因的對照擬南芥植株開始萎蔫，而轉(zhuǎn)化外源基因的擬南芥植株長勢旺盛 (圖 5 I)。復(fù)水處理3天后再次觀察表型，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化基因的擬南芥植株長勢良好，抽薹開花，生長明顯好于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?圖5 I)。
權(quán)利要求
1.一種小麥耐鹽、抗旱基因TamKY79，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No. I 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的一種小麥耐鹽、抗旱基因其特征在于所述轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)，其氣基酸序列為SEQ ID No. 2所不。
3.如權(quán)利要求I所述一種小麥耐鹽、抗旱基因在培育耐鹽、抗旱植物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的一種小麥耐鹽、抗旱基因TaMKY79的應(yīng)用，其特征在于所述植物是普通小麥、玉米和水稻。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及小麥耐鹽、抗旱WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY79的克隆及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種小麥耐鹽、抗旱WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY79及其在培育耐鹽、抗旱植物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、抗旱能力明顯提高。本發(fā)明的基因在培育耐鹽、抗旱植物(特別是作物)中具有重要作用。
文檔編號C12N15/29GK102703465SQ201210135540
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者秦余香 申請人:濟(jì)南大學(xué)