專利名稱：大豆耐旱鋅指蛋白基因stf-2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及植物干旱脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，確切地說(shuō)是大豆鋅指蛋白基因STF-2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鋅指蛋白是轉(zhuǎn)錄因子的一種，廣泛的參與生物的表達(dá)調(diào)控和生長(zhǎng)過(guò)程。研究最多的就是C2H2型鋅指蛋白，尤其是對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana),矮牽牛{Petuniahybrida Vilm)以及水稻{Oryza sativa)等植物的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)了多種與植物脅迫 耐受相關(guān)的植物C2H2型鋅指蛋白，例如，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)STZ基因，該基因能夠編碼一種雙鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白，轉(zhuǎn)STZ基因的煙草明顯提高了對(duì)冷及高鹽條件的耐受能力(Sakamoto et al.，2000);在矮牽牛中獲得的鋅指蛋白基因Id，其翻譯產(chǎn)物同樣也含是具有雙鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白，轉(zhuǎn)基因的煙草對(duì)干旱的耐受能力也得到明顯提高。國(guó)內(nèi)對(duì)植物C2H2型鋅指蛋白研究較多的集中在水稻上，例如基因，石基因等，這兩個(gè)基因所編碼的鋅指蛋白都能夠提高植物對(duì)滲透脅迫的耐受能力(郭書(shū)巧等，2007;郭書(shū)巧，2006)。但是國(guó)內(nèi)外對(duì)于大豆鋅指蛋白的研究還比較少，分析較為明確的只有5T6F-7，其編碼的鋅指蛋白是典型的雙鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白，能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫的耐受能力(Kim et al., 2001)。我們可以依據(jù)C2H2型鋅指蛋白的特性利用基因工程技術(shù)定向的提高植物對(duì)逆境的耐受能力，為穩(wěn)定農(nóng)作物的生長(zhǎng)具有重要價(jià)值和意義。大豆是我國(guó)重要的油料作物，干旱情況下對(duì)大豆的出苗率，生長(zhǎng)情況，產(chǎn)量都有非常重要的影響。而至今從大豆中鑒定出來(lái)的C2H2型鋅指蛋白基因并不多，而研究較為透徹的只有大豆耐冷鋅指蛋白基因SCOF-I。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的大豆基因，大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2。大豆鋅指蛋白基因STF-2，其堿基序列如序列表SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示；
大豆鋅指蛋白STF-2，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示；
它來(lái)源于大豆品種“吉農(nóng)18”；
是以大豆品種“吉農(nóng)18”總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得。一種植物表達(dá)載體，它是在植物表達(dá)載體中插入了大豆鋅指蛋白基因SCTF-I ；
所述的植物表達(dá)載體為PBI121。本發(fā)明的另一個(gè)目的是大豆鋅指蛋白基因，在培養(yǎng)耐干旱轉(zhuǎn)基因植物新品種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的大豆鋅指蛋白基因STF-2,是大豆中新發(fā)現(xiàn)的與干旱相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白基因。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，STF-2編碼的蛋白能夠定位到細(xì)胞核中，該基因過(guò)量表達(dá)后能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性，具有提高植物綜合耐逆性的功能，本發(fā)明的基因來(lái)源于大豆，具有適合于大豆等雙子葉植物的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于雙子葉植物的大豆、煙草、棉花等，此外也適合于水稻、小麥、玉米等單子葉植物。


圖I為倒置熒光顯微鏡下照片，其中a是ρΒΙ121-βΤ在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)；b是？81121-^^- 在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)；
圖2為轉(zhuǎn)基因植株耐旱性實(shí)驗(yàn)照片，其中圖a是干旱處理的對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)基因煙草，圖b是干旱處理的對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)基因煙草照片。
圖3為轉(zhuǎn)基因植株耐旱性實(shí)驗(yàn)照片，圖3a是干旱處理后經(jīng)25°C恢復(fù)培養(yǎng)12h后的對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草，圖3b是干旱處理后經(jīng)25°C恢復(fù)培養(yǎng)12h后的對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草單株照片。圖4為轉(zhuǎn)基因植株耐旱性試驗(yàn)照片，圖4a是利用10%PEG6000溶液模擬干旱脅迫24h后對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草的對(duì)比圖片，圖4b是模擬干旱后經(jīng)恢復(fù)水培養(yǎng)24h后對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)比圖片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
選用大豆品種“吉農(nóng)18”，待幼苗生長(zhǎng)一周后，4°C培養(yǎng)24h，取葉片，用液氮研磨，加入含有裂解液的I. 5ml的EP管中，震蕩混勻后，使用試劑盒RNAiso Plus提取總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，然后用分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度；按照美國(guó)FERMENTAS公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；以植物C2H2型鋅指蛋白的保守序列為探針?biāo)阉鞔蠖够蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)比對(duì)和序列拼接得到一個(gè)全長(zhǎng)為1115bp的大豆C2H2型鋅指蛋白序列，根據(jù)此序列分別設(shè)計(jì)兩邊引物5’ GCTCATCTACACTCATA 3’，5’TGATGAAAACAATTGTTA 3’，采用RT-PCR的方法進(jìn)行cDNA克隆，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，48°C復(fù)性 40s，72°C延伸 40s，32 個(gè)循環(huán)，72°C后延伸 IOmin ^fPCR產(chǎn)物克隆至PMD-18T載體上，測(cè)序后獲得具有完整編碼區(qū)的大豆C2H2型鋅指蛋白基因其喊基序cDNA如序列表SEQ ID NO. I。STF-2全長(zhǎng)1115bp，開(kāi)放閱讀框在97_844bp處，DNAMAN軟件分析表明SCTF-I共編碼249個(gè)氨基酸，有兩個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)間由36個(gè)氨基酸隔開(kāi)。鋅指結(jié)構(gòu)中有植物鋅指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH。經(jīng)DNAMAN軟件分析，估算其等電點(diǎn)pl=8. 23，分子量MW=26. 7kDa。利用GENEBANK中BLAST搜索大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)STF-2是一個(gè)新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因。實(shí)施例2
根據(jù)大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整編碼閱讀框的引物，在上游添加X(jué)ba I酶切位點(diǎn)，下游添加Sac I酶切位點(diǎn)，上游引物GGG TCTAGAATGGCTTTGGAGGCTTTGA，下游引物TTTGAG AAACAAACGCGGCCTCT,以實(shí)施例 I 中獲得的 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將STF-2的cDNA克隆到PMD-18T載體上，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體PB 1121上；將基因鏈接到上面的載體上，構(gòu)建成pB 1121-STF-2-GFP載體，將pB 1121 -STF-2-GFP通過(guò)農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)激光共聚焦纖維鏡管擦，發(fā)現(xiàn)pBI 121- STF-2-GFP基因嵌合產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)，表明大豆STF-2基因是定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，見(jiàn)圖I，其中a是pBI 12在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，b是在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)。a、b是在倒置熒光顯微鏡下的觀察，通過(guò)顯微鏡觀察，圖a可以看出在轉(zhuǎn)入的洋蔥表皮細(xì)胞中整個(gè)細(xì)胞都有綠色熒光，而圖b轉(zhuǎn)入的洋蔥表皮細(xì)胞只有細(xì)胞核能檢測(cè)到綠色熒光，說(shuō)明STF-2編碼的蛋白能夠定位到細(xì)胞核中。實(shí)施例3
將表達(dá)載體PBI121-轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌侵染的方法，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙
草中，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR、RT-PCR、Southern雜交檢測(cè)后，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的T2代和對(duì)照植株進(jìn)行耐逆性分析；耐旱轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因的煙草和對(duì)照放入25°C培養(yǎng)箱中連續(xù)不澆水培養(yǎng)15d，相對(duì)濕度為40%，之后再恢復(fù)25°C正常澆水培養(yǎng)12h。將轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照放入25°C培養(yǎng)箱中連續(xù)不澆水培養(yǎng)15d，培養(yǎng)箱的相對(duì)濕度控制在40%，每天觀察和記錄生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在脅迫IOd后，對(duì)照植株葉片出現(xiàn)枯黃和打卷現(xiàn)象，脅迫15d后，轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)基本正常，而對(duì)照植株出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因植株基本正常，如圖2a、圖2b所示。圖2a和圖2b的左列為對(duì)照，右列為轉(zhuǎn)基因植株。在恢復(fù)澆水培養(yǎng)12h后，轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)情況要明顯優(yōu)于對(duì)照組，如圖3a，圖3b是恢復(fù)澆水后的全苗單株?duì)顟B(tài)圖片。圖3a和圖3b的左側(cè)為對(duì)照，右側(cè)為轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例4
將轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草放入含有10%PEG6000溶液的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察和記錄各自生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在脅迫24h后，90%的對(duì)照植株都出現(xiàn)了葉片枯萎和打卷現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因煙草也出現(xiàn)一些葉片打卷現(xiàn)象，但是總體上強(qiáng)于對(duì)照煙草，如圖4a。恢復(fù)水培養(yǎng)24小時(shí)候，轉(zhuǎn)基因植株的恢復(fù)情況也明顯強(qiáng)于對(duì)照植株，如圖4b。上述實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明中克隆的大豆C2H2型鋅指蛋白基因?yàn)榇蠖怪行掳l(fā)現(xiàn)的與干旱相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白基因。實(shí)施例3表明，該基因過(guò)量表達(dá)后能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性，具有提高植物綜合耐逆性的功能。本發(fā)明的基因來(lái)源于大豆，具有適合于大豆等雙子葉植物的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于雙子葉植物的大豆、煙草、棉花等，此外也適合于水稻、小麥、玉米等單子葉植物。
權(quán)利要求
1.大豆耐旱鋅指蛋白基因，其堿基序列如序列表SEQID NO. I或SEQ ID NO. 2所示。
2.大豆耐旱鋅指蛋白STF-2，其氨基酸序列如序列表SEQID NO. 3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的大豆耐旱鋅指蛋白基因，它是以大豆品種“吉農(nóng)18”總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得。
4.一種植物表達(dá)載體，它是在植物表達(dá)載體中插入了其堿基序列如序列表SEQ IDNO. I或SEQ ID NO. 2所示的大豆耐旱鋅指蛋白基因SCTF-1。
5.根椐權(quán)利要求4所述的所述的植物表達(dá)載體為PBI121。
6.大豆鋅指蛋白基因在培養(yǎng)耐干旱轉(zhuǎn)基因植物新品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了大豆鋅指蛋白基因STF-2，是大豆中新發(fā)現(xiàn)的與干旱相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白基因。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，STF-2編碼的蛋白能夠定位到細(xì)胞核中，該基因過(guò)量表達(dá)后能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性，具有提高植物綜合耐逆性的功能，本發(fā)明的基因來(lái)源于大豆，具有適合于大豆等雙子葉植物的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于雙子葉植物的大豆、煙草、棉花等，此外也適合于水稻、小麥、玉米等單子葉植物。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102703467SQ20121013577
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者付永平, 宋冰, 崔程程, 張卓, 晏佳琳, 李勃, 李翠, 杜鵑, 洪洋, 王丕武, 王丹, 王賀, 王鵬, 邢飛, 馬建 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)