專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體cd163敲除豬及培育方法
技術領域：
本發(fā)明提供了ー種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬，同時還公開了該豬的培育方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
豬繁通與呼吸綜合癥(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁通與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrom virus,PRRSV)引起的以流產(chǎn)、死胎、胎兒木乃伊化和呼吸道疾病為特征的傳染病。在發(fā)病過程中會出現(xiàn)短暫性的兩耳皮膚紫紺，故又稱為“藍耳病”。近幾年，該病在國內呈現(xiàn)明顯的高發(fā)趨勢，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失，已成為嚴重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的 重要傳染病之一。完全分化的原代豬肺泡巨噬細胞是PRRSV感染的靶細胞。CD163又名M130，是富含半胱氨酸的清道夫受體家族成員之一，是單鏈跨膜糖蛋白分子，也是ー種巨噬細胞分化的抗原。研究發(fā)現(xiàn)，CD163具有單核細胞-巨噬細胞特異性，在全身各種含豐富巨噬細胞的器官上高表達。該蛋白在非易感的細胞表達，能使細胞獲得感染PRRSV的能力，還能產(chǎn)生子代病毒，抗人CD163的抗體可以阻斷PRRSV的感染，表明CD163是該病毒的必需受體。因此，CD163基因的功能研究可以為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染相關研究提供理論依據(jù)，而CD163基因敲除的研究將為進ー步研究CD163受體在PRRSV感染過程中發(fā)揮的具體作用奠定基礎。目前CD163基因敲除的轉基因動物尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了ー種豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體CD163敲除豬，豬體內CD163基因不表達，該豬不感染豬繁殖與呼吸綜合癥病毒。本發(fā)明還提供了豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體CD163敲除豬的培育方法，適用于人工制備⑶163基因敲除豬。本發(fā)明提供的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬，其特征在于
在敲除豬體內⑶163基因不表達。本發(fā)明所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬的培育方法，包括以下步驟
I) PRRSV受體⑶163基因敲除載體的構建
分別克隆豬CD163基因同源左臂和同源右臂序列，然后將上述同源臂亞克隆至含正向篩選基因Neo和負向篩選基因TK的pSSC-9載體，構建含正負篩選標記的⑶163基因敲除載體 pSSC-Larm-Sarm-CD163 ；
I. I)用PCR擴增豬的⑶163基因同源左臂和同源右臂序列 用同源臂擴增引物分別擴增CD163基因同源左臂和同源右臂序列；
1.2)將CD163基因同源左臂和同源右臂序列分別與pGM-T相連接，分別構建成pGM-T-Sarm-CD163 和 pGM-T-Larm_CD163 ；
I. 3)用 BamHI 和 HindIII 酶切 pGM-T-Sarm_CD163，回收 CD163 基因同源右臂 Sarm 片段；用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；將0)163基因同源左臂與同源右臂先后連接至PSSC-9載體上，構建成含正負篩選標記的⑶163基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163 ；
2)CD163基因敲除豬胚胎成纖維細胞系的建立
將上述構建的基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163線性化后，用脂質體法轉染到豬胚胎成纖維細胞中，對經(jīng)抗性篩選獲得的陽性細胞進行基因敲除的鑒定，對鑒定確證發(fā)生同源重組的細胞凍存；
2. I)載體線性化提取pSSC-Larm-Sarm-CD163質粒，用I酶切，然后こ醇沉淀，用無菌ddH20溶解；
2.2)脂質體轉染將線性化的載體按照脂質體Fugene HD轉染小型豬成纖維細胞，5 %CO2, 39 °C培養(yǎng);
2.3)核供體細胞的獲得用G418篩選8-10天后，獲得抗性細胞；采用PCR方法對所獲得的細胞進行鑒定，得到CD163基因敲除豬成纖維細胞；該細胞即為核供體細胞；
3)利用體細胞核移植技術構建CD163基因敲除豬
采用體細胞核移植技木，以母豬做代孕母豬，構建CD163基因敲除豬。本發(fā)明所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的培育方法，其特征在于
⑶163基因敲除載體為pSSC-Larm-Sarm-⑶163，該載體含有⑶163基因同源左臂和同源右臂，參見圖I。本發(fā)明所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的培育方法，其特征在于
用于擴增CD163基因同源左臂和同源右臂，引物序列如下
同源左臂的擴增引物
PCDE2-3F:5’ -ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’，
PCDE3-4R:5’ -ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’ ；
同源右臂的擴增引物
PCDE5-6F:5， -AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3，，
PCDE5-6R:5’ -AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’。本發(fā)明采用PCR方法對⑶163基因敲除豬進行鑒定。目前已經(jīng)成功獲得了 3頭健康豬，該基因敲除豬已經(jīng)過鑒定具有⑶163基因缺失的特性。本發(fā)明所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的PCR鑒定方法，用于基因敲除豬陽性細胞克隆及陽性克隆豬鑒定，其特征在于引物序列如下
鑒定引物對I (JDYffl)
5’ -TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’，
5’ -AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’ ；
鑒定引物對2 (JDYff2)
5， -AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3，，
5’ -ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’ ；
鑒定引物對3 (NEOl)
5’ -TCTGATGCCGCCGTGTT-3’，5’ -GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’ ；
鑒定引物對4 (NE02)
5’ -AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’，
5，-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3，。本發(fā)明的積極效果在于建立豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體CD163基因敲除豬，豬體內CD163基因不表達，該豬不感染豬繁殖與呼吸綜合癥病毒。


圖 I 為 pSSC-Larm-Sarm-CD163 載體 圖2為⑶163基因敲除的豬胚胎成纖維細胞(4X )；
圖3為CD163基因敲除的豬胚胎成纖維細胞鑒定結果 圖4.基因敲除豬PCR鑒定。
具體實施例方式以下實施例證明本發(fā)明的效果，下列實施例g在進ー步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內。實施例I
PRRSV受體⑶163基因敲除載體的構建
I質粒形成的重要的中間質粒有pGM-T-Sarm-CD163和pGM-T-Larm-CD163。2實驗過程以小型豬基因組為模板，采用PCR法(參見表2)分別擴增克隆豬CD163同源左臂和同源右臂JfCD163基因同源左臂和同源右臂序列分別與pGM-T相連接，分別構建成 pGM-T-Sarm-CD163 和 pGM-T-Larm_CD163 ；用 BamHI 和 hindIII 酶切pGM-T-Sarm-CD163，回收 CD163 基因同源右臂 Sarm 片段；用 SalI 酶切 pGM-T-Larm_CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；將CD163基因同源左臂與同源右臂分別與含正向篩選基因Bip-Neo和負向篩選基因HSV-t的打靶載體pSSC_9相連接，構建含正負篩選標記的CD163基因敲除載體(見附圖I)。擴增同源臂用的PCR引物由金斯瑞公司合成(引物序列見表I)。表I用于同源臂擴增的PCR引物
權利要求
1.ー種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬，其特征在于 在敲除豬體內⑶163基因不表達。
2.權利要求I所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬的培育方法，包括以下步驟 1)PRRSV受體⑶163基因敲除載體的構建 分別克隆豬CD163基因同源左臂和同源右臂序列，然后將上述同源臂亞克隆至含正向篩選基因Neo和負向篩選基因TK的pSSC-9載體，構建含正負篩選標記的⑶163基因敲除載體 pSSC-Larm-Sarm-CD163 ； I. I)用PCR擴增豬的⑶163基因同源左臂和同源右臂序列 用同源臂擴增引物分別擴增CD163基因同源左臂和同源右臂序列； 1.2)將CD163基因同源左臂和同源右臂序列分別與pGM-T相連接，分別構建成pGM-T-Sarm-CD163 和 pGM-T-Larm_CD163 ； 1.3)用 BamHI 和 HindIII 酶切 pGM-T-Sarm_CD163，回收 CD163 基因同源右臂 Sarm 片段；用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；將0)163基因同源左臂與同源右臂先后連接至PSSC-9載體上，構建成含正負篩選標記的⑶163基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163 ； 2)CD163基因敲除豬胚胎成纖維細胞系的建立 將上述構建的基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163線性化后，用脂質體法轉染到豬胚胎成纖維細胞中，對經(jīng)抗性篩選獲得的陽性細胞進行基因敲除的鑒定，對鑒定確證發(fā)生同源重組的細胞凍存； 2.I)載體線性化提取pSSC-Larm-Sarm-CD163質粒，用I酶切，然后こ醇沉淀，用無菌ddH20溶解； 2.2)脂質體轉染將線性化的載體按照脂質體Fugene HD轉染小型豬成纖維細胞，5 %CO2, 39 °C培養(yǎng); 2.3)核供體細胞的獲得用G418篩選8-10天后，獲得抗性細胞；采用PCR方法對所獲得的細胞進行鑒定，得到CD163基因敲除豬成纖維細胞；該細胞即為核供體細胞； 3)利用體細胞核移植技術構建CD163基因敲除豬 采用體細胞核移植技木，以母豬做代孕母豬，構建CD163基因敲除豬。
3.根據(jù)權利要求2所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的培育方法，其特征在于 ⑶163基因敲除載體為pSSC-Larm-Sarm-⑶163，該載體含有⑶163基因同源左臂和同源右臂，參見圖I。
4.權利要求2或3所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的培育方法，其特征在于 用于擴增CD163基因同源左臂和同源右臂，引物序列如下 同源左臂的擴增引物PCDE2-3F:5’ -ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’，PCDE3-4R:5’ -ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’ ； 同源右臂的擴增引物PCDE5-6F:5， -AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3，，PCDE5-6R:5’ -AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’。
5.權利要求I所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的PCR鑒定方法，其特征在于，用于基因敲除豬陽性細胞克隆及陽性克隆豬鑒定的引物序列如下 鑒定引物對I (JDYffl)5’ -TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’， 5’ -AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’ ； 鑒定引物對2 (JDYff2)5， -AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3，，5’ -ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’ ； 鑒定引物對3 (NEOl)5’ -TCTGATGCCGCCGTGTT-3’，5’ -GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’ ； 鑒定引物對4 (NE02)5’ -AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’，5，-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3，。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬，同時還公開了該豬的培育方法，構建的CD163基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163是以中國實驗小型豬基因組為模板，采用PCR法分別擴增豬CD163基因同源左臂和同源右臂；將克隆得到的CD163基因同源左臂和同源右臂分別亞克隆到pSSC-9載體上；培養(yǎng)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體CD163基因敲除豬，豬體內CD163基因不表達，該豬不感染豬繁殖與呼吸綜合癥病毒。
文檔編號C12N5/10GK102715132SQ20121013579
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權日2012年5月4日
發(fā)明者于飛飛, 任林柱, 宋娜, 曹宇航, 李莉, 楊鑫, 歐陽紅生, 賴良學, 逄大欣, 陳福旺 申請人:吉林大學