專利名稱：煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子。具體地說，本發(fā)明涉及煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF啟動子分離、鑒定。本發(fā)明也涉及含有連接異源基因的煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF啟動子的載體盒的構(gòu)建。另外，本發(fā)明也涉及用含有煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF各種啟動子的表達載體進行瞬間表達的方法。
背景技術(shù)：
植物基因工程的目的是將外源基因?qū)胧荏w植物后使其正確而有效地表達。而適合的啟動子是外源基因有效表達的關(guān)鍵因素。研究啟動子對我們了解生物的生長發(fā)育過程、探討生物對其生長環(huán)境的適應(yīng)機制以及更好地控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達等
具有重要意義。目前，已有許多不同來源的啟動子被用于植物品質(zhì)改良基因工程、抗病育種基因工程以及植物生物反應(yīng)器等不同基因工程領(lǐng)域。這些啟動子中一大類是從農(nóng)桿菌中分離出來，另一大類為植物本身來源的啟動子。但是由于上述啟動子控制的目標基因表達量往往較低，以及與受體植物細胞基因組序列具有一定的同源性，所以在植物遺傳轉(zhuǎn)化中通常選用植物病毒啟動子?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV)的35S啟動子被廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，而從木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)分離的啟動子也是一種高效表達的啟動子。利用鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和CsVMV啟動子區(qū)以及CaMV 35S啟動子的激活序列(asl，as2)人工構(gòu)建高效融合啟動子，瞬時表達實驗表明該啟動子可驅(qū)動報告基因不管在雙子葉植物煙草還是在單子葉植物玉米都能高效表達。但是也不得不注意到由于上述啟動子驅(qū)動的外源基因在整株植物中表達產(chǎn)生大量的異源蛋白或代謝產(chǎn)物，可能會打破植物原有的代謝平衡，而有些產(chǎn)物對植物并非必需甚至有的具有毒害作用，因而會在一定程度上阻礙植物的正常生長。雙生病毒(geminivirus)是植物病毒中唯一具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)形DNA病毒，病毒粒子為雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)，大小約為18nmX 30nm，無包膜?；蚪M為單組份或雙組份結(jié)構(gòu)，大小為2. 5-3. Okb (千堿基對)，由昆蟲介體以持久性方式傳播，大多數(shù)侵染寄主植物的韌皮部組織。菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)雙生病毒是一類具有經(jīng)濟重要性的病毒，越來越多的單組份begomoviruses被鑒定，并且多數(shù)伴隨有beta衛(wèi)星,一些情況下還伴隨有alpha衛(wèi)星。雙生病毒基因組結(jié)構(gòu)較為簡單，但是其轉(zhuǎn)錄過程非常復雜，不同雙生病毒間啟動子的活性及表達類型有很大差異，因此對于外源基因的表達具有潛在的應(yīng)用價值。目前國內(nèi)外有關(guān)雙生病毒啟動子的研究大都針對其輔助病毒組份，對beta衛(wèi)星啟動子的報道僅有三例，而迄今為止尚未見對alpha衛(wèi)星啟動子研究的報道。alpha衛(wèi)星分子是與某些單組份雙生病毒相伴隨的衛(wèi)星分子，該分子大小約I. 3kb，是其輔助病毒基因組的一半左右。alpha衛(wèi)星分子單獨即可復制，但需要輔助病毒才能進行裝配、包裹、在植物體內(nèi)運動或被昆蟲傳播。除含有一個高度保守的基因間隔區(qū)(IR)和一個富含腺嘌呤的A-rich區(qū)外，其基因組中編碼一個與矮縮病毒(nanovirus)類似的復制相關(guān)蛋白(Rep)，已有實驗表明alpha衛(wèi)星分子可以作為表達載體 進行遺傳操作。本發(fā)明的開展一方面通過了解復制相關(guān)蛋白Rep啟動子的活性，可以深入了解相關(guān)蛋白的表達強度，并且能反映該表達載體的表達效率。另一方面，通過比較不同長度Rep啟動子的活性大小，能夠為植物基因表達提供一些有價值的表達元件，并為解析alpha衛(wèi)星分子的致病性機理奠定良好的分子生物學方面的基礎(chǔ)?；诖?，本發(fā)明鑒定了煙草曲莖病毒相伴隨的alpha衛(wèi)星分子中R印ORF的不同長度啟動子表達活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子。煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子所述啟動子DNA序列為煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的 R印 ORF 的缺失啟動子 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 所示DNA序列。DNA構(gòu)建體包括煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQIDN0:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因連接到煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQ IDNO: I或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4DNA序列下游以獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中；(c)用上述重組表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；(d)培養(yǎng)該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。利用植物細胞制備蛋白質(zhì)的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質(zhì)的DNA連接到煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印 ORF的缺失啟動子SEQ ID N0:1 或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4DNA序列下游，獲得重組DNA片段；(b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體；(c)重組表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌或基因槍法轉(zhuǎn)化植物細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞以表達所需的蛋白質(zhì)；(d)從培養(yǎng)物中回收所需的蛋白質(zhì)。表達載體，含有煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQIDNO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4DNA序列，其中所述載體是適用于植物細胞的質(zhì)粒載體、曬菌體或病毒等，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果I)應(yīng)用本發(fā)明中的啟動子，在植物抗病毒基因工程中可以實現(xiàn)有效的抗病目的。本發(fā)明中涉及的四個啟動子與強組成型表達啟動子CaMV 35S啟動子相比，啟動子活性最高是35S啟動子活性的16. 53%，所以該啟動子不會驅(qū)動外源基因在植物中過量表達，能極大地降低對植株生長發(fā)育產(chǎn)生的不利影響。因此，綜合本發(fā)明啟動子非過量表達外源基因的優(yōu)點，應(yīng)用于植物抗病基因工程中能夠達到經(jīng)濟有效的抗病目的。
2)應(yīng)用本發(fā)明中的啟動子，可以有效進行植物轉(zhuǎn)基因工程。植物基因工程中使用的植物來源的啟動子由于與受體植物基因組具有一定的同源性，往往會在寄主植物體內(nèi)引起基因沉默現(xiàn)象而造成外源基因失活。這種現(xiàn)象在多基因轉(zhuǎn)化時更為普遍。而本發(fā)明中的啟動子，由于與植物基因組序列沒有同源性，所以能夠避免基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生。此外，大量研究表明，侵染雙子葉植物的病毒來源的啟動子可有效地應(yīng)用于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中的啟動子來源于侵染雙子葉植物的病毒衛(wèi)星分子，開發(fā)該啟動子應(yīng)用于多種作物(包括禾谷類)的基因轉(zhuǎn)化，應(yīng)用前景將會十分廣闊。


圖I是煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF啟動子的結(jié)構(gòu)圖。以R印ORF的翻譯起始位點(ATG)為+1位；圖中A-rich代表富含腺嘌呤的區(qū)域，IR代表基因間隔區(qū)；圖2是啟動子驅(qū)動GUS基因表達載體構(gòu)建圖?？寺『蟮膯幼悠畏謩e經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III/BamH I雙酶切后插入表達載體pINT121同酶切位點，構(gòu)建成啟動子表達載體；圖3是啟動子驅(qū)動GFP基因表達載體構(gòu)建圖。克隆后的啟動子片段分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I/Sac I雙酶切后插入表達載體pCHF3_GFP同酶切位點，構(gòu)建成啟動子表達載體；其中PCHF3-GFP用于陽性對照，不含GFP基因的pCHF3空載體用于陰性對照；圖4是⑶S基因?qū)φ毡磉_載體構(gòu)建圖。表達載體PINT121經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/EcoR I雙酶切后產(chǎn)生的⑶S-NOS片段與BamH I/EcoR I雙酶切后的pBINPLUS載體片段連接，構(gòu)建成表達載體PBINGUS，其中pINT121用于陽性對照，pBINGUS用于陰性對照；圖5是各啟動子的瞬時表達⑶S的熒光活性分析。A，各啟動子的多次重復⑶S活性；B，各啟動子的相對平均⑶S活性。A，B中pBINGUS為陰性對照，pINT121為陽性對照，括號內(nèi)的數(shù)字代表每個啟動子的獨立實驗重復次數(shù)。通過統(tǒng)計軟件SAS 8. O中的多重比較方法ANOVA中的LSD檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P〈0.05 or P〈0.01)，誤差線代表標準差；圖6是各啟動子的瞬時表達GFP的熒光強度分析。A，各啟動子瞬時表達GFP熒光活性；B，各啟動子的相對平均GFP活性。A，B中pCHF3為陰性對照，pCHF3_GFP為陽性對照。通過統(tǒng)計軟件SAS 8. O中的多重比較方法ANOVA中的LSD檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P〈0. 05 or P<0. 01)，誤差線代表標準差；
具體實施例方式煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子所述啟動子DNA序列為煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的 R印 ORF 的缺失啟動子 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 所示DNA序列。DNA構(gòu)建體包括煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQIDNO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。
利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因連接到煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQ IDNO: I或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4DNA序列下游以獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中；(c)用上述重組表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；(d)培養(yǎng)該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。利用植物細胞制備蛋白質(zhì)的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質(zhì)的DNA連接到煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印 ORF的缺失啟動子SEQ ID N0:1 或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4DNA序列下游，獲得重組DNA片段；(b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體；(c)重組表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌或基因槍法轉(zhuǎn)化植物細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞以表達所需的蛋白質(zhì)；(d)從培養(yǎng)物中回收所需的蛋白質(zhì)。表達載體，含有煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQIDNO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4DNA序列，其中所述載體是適用于植物細胞的質(zhì)粒載體、曬菌體或病毒等，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。本發(fā)明描述了煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子，它是與煙草曲莖病毒相伴隨的alpha衛(wèi)星分子(GenBank登錄號AJ579345)的R印ORF缺失啟動子。本發(fā)明中以感染有煙草曲莖病毒的煙草植物總DNA為模板，克隆并鑒定了煙草曲莖病毒相伴隨的alpha衛(wèi)星分子的R印ORF啟動子，序列表顯示了各啟動子的序列。煙草曲莖病毒相伴隨的alpha衛(wèi)星的R印ORF全長非編碼區(qū)有420個堿基對，根據(jù)alpha衛(wèi)星分子基因組的結(jié)構(gòu)特征，對全長非編碼區(qū)進行缺失。啟動子420 Λ 37的特征是缺失全長非編碼區(qū)中-384至-420的片段(啟動子的序列為SEQ ID NO: I)，啟動子420 Λ 127的特征是缺失全長非編碼區(qū)中-294至-420的片段(啟動子的序列為SEQ ID NO: 2)，啟動子420 Λ 193的特征是缺失全長非編碼區(qū)中-228至-420的片段(啟動子的序列為SEQ ID NO: 3)，啟動子420 Λ 205的特征是缺失全長非編碼區(qū)中-216至-420的片段(啟動子的序列為SEQ ID NO:4)，在啟動子的活性分析中發(fā)現(xiàn)，這四個突變啟動子都保留了活性(圖5，圖6)。本發(fā)明描述了植物細胞中基因產(chǎn)物表達的方法。將已克隆的啟動子與葡萄糖醛酸酶基因(GUS)融合構(gòu)建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌浸潤法使GUS基因在煙草植物細胞中進行瞬間表達。本發(fā)明還描述了植物細胞中GUS活性的鑒定和檢測方法。在植物細胞的瞬間表達體系中，通過熒光光度分析來檢測其表達活性。本發(fā)明中的實驗證明R印ORF缺失啟動子的啟動子活性是CaMV 35S啟動子活性的7. 26% -16. 53%，表達活性最小序列位于啟動子420Δ205ο本發(fā)明中的煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF啟動子可表達所需要的任何異源基因。異源基因的例子包括殺蟲毒素基因，除草劑抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，其它抗微生物的基因。本發(fā)明中將含有煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF啟動子和異源基因的構(gòu)建體插入到一種載體中，可用該載體轉(zhuǎn)化植物細胞，優(yōu)選的載體對于植物而言可以是一種農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒衍生物，該質(zhì)粒衍生物通過農(nóng)桿菌介導的雙元載體技術(shù)導入植物細胞，這種技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。將已轉(zhuǎn)化植物細胞培養(yǎng)于一種合適培養(yǎng)基中，并再生出植株。本發(fā)明包括來自于煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF啟動子序列以及含有以上序列的DNA構(gòu)建體。同時，本發(fā)明還包括是煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF啟動子的“功能等同物”的DNA序列，以及含有有效連接到異源基因上的這樣的DNA序列的構(gòu)建體。本發(fā)明還包括使用如本文所述的R印ORF啟動子的“功能等同物”賦予處于它們控制下的任何基因的表達。本發(fā)明中使用的術(shù)語“啟動子活性”是指當以該基因的可表達方式將有效基因連接到啟動子的下游，并導入到宿主(植物細胞)中，該宿主顯示具有在宿主內(nèi)或宿主外生產(chǎn)該有效基因產(chǎn)物的功能。通常是將容易定性、定量檢測的蛋白質(zhì)編碼基因(報告基因)連接至啟動子的下游，然后將構(gòu)建后的基因?qū)胨拗鲀?nèi)，檢測表達蛋白情況，以此來確定是否存在特定啟動子的活性以及其效力如何?！肮δ艿韧铩笔侵冈趪栏耠s交條件下與一個DNA序列互補的任何DNA序列，該序列與該參照物雜交并且有類似于煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF啟動子的活性。“缺失啟動子”是指任何有缺失而仍具有啟動子活性的煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的Rep ORF啟動子。采用下面的非限制性實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例I煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF啟動子片段的克隆以及序列測定基本上按照Sambrook 等所述方法(Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY,1989)實施分子技術(shù)。以感染煙草曲莖病毒的煙草植株為材料，用CTAB法提取植物總DNA[Stewart et al.，BioTechniques, 1993，14:748-749]。預擴增的各啟動子片段見圖 I。以植物總DNA為模板，通過特異性引物擴增煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星的R印ORF的各啟動子片段。引物PR印383F(5’GGAATTCAAGCTTAAAGAAGGA ATGAAATG 3’，相應(yīng)于 SEQ ID N0:1 中的1-17 位，引入了 EcoR I 和 Hind III 位點)和 pR印420R(5’CGAGCTCGGATCCTTCTGTGAAGAAGAGAGAG 3’，相應(yīng)于SEQ ID NO :1中的383-365位，引入了 Sac I和BamH I位點)擴增啟動子(SEQ ID NO 1) ο 引物 pR印293F(5，GGAATTCAAGCTTTGATGCA GGCCCAAAT 3’，相應(yīng)于 SEQ ID NO 2中的 1-16 位，引入了 EcoR I 和 Hind III 位點)和 pR印420R(5’CGAGCTCGGATCCTTCTGTGAAGAAGAGAGAG 3’，相應(yīng)于SEQ ID NO 2中的293-275位，引入了 Sac I和BamH I位點)擴增啟動子(SEQ ID NO :2)。引物 pR印227F (5，GGAATTCAAGCTTTATA AAAACGACGTCGTATGA3’，相應(yīng)于SEQ ID NO :3中的1-21位，引入了 EcoR I和Hind III位點)和pR印420R(5，CGAGCTCGGATCCTTCTGTG AAGAAGAGAGAG 3’，相應(yīng)于 SEQ ID NO :3 中的 227-209 位，引入了 Sac I 和 BamH I 位點)擴增啟動子(SEQ ID NO :3)。引物 pR印215F (5’GGAATTCAAGCTTGTCGTATGAGTAAGTGGG 3，，相應(yīng)于 SEQ ID NO 4 中的 1-18 位，引入了 EcoR I 和 Hind III 位點)和 PR印420R (5，CGAGCTCGGATCCTTCTGTGAAGAAGAGAGAG 3’，相應(yīng)于 SEQ ID NO :4 中的215-197位，引入了 Sac I和BamH I位點)擴增啟動子(SEQ ID NO :4)。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)Hind III/BamH I或EcoR I/Sac I直接酶切后經(jīng)QiaGene凝膠純化試劑盒回收目的片段，用Sanger雙脫氧鏈終止法測序驗證后用于載體構(gòu)建。實施例2啟動子表達載體的構(gòu)建
用限制性酶Hind III/BamH I酶切消化雙元表達載體pINT121 (該載體的構(gòu)建見Liu等發(fā)表的論文，即Planta, 2003, 216:824-833)。將酶切后的啟動子片段插入對應(yīng)的同酶切位點，構(gòu)建為啟動子表達載體(圖2):啟動子420 Λ 37的構(gòu)建體為pINT-RepA37，啟動子420 Δ 127的構(gòu)建體為PINT-Rep Δ 127，啟動子420 Δ 193的構(gòu)建體為pINT-Rep Δ 193，啟動子420 Δ 205的構(gòu)建體為pINT-R印Δ 205。用限制性酶EcoR I/Sac I酶切消化雙元表達載體pCHF3_GFP (該載體的構(gòu)建見Xiong 等發(fā)表的論文，即 Journal of Virology, 2008，82:12304-12311)。將酶切后的啟動子片段插入對應(yīng)的同酶切位點，構(gòu)建為啟動子表達載體(圖3):啟動子420 △ 37的構(gòu)建體為pCHF3-Rep Δ 37，啟動子420 Δ 127的構(gòu)建體為pCHF3_R印Δ 127，啟動子420 Δ 193的構(gòu)建體為pCHF3-R印Δ 193，啟動子420 Δ 205的構(gòu)建體為pCHF3_R印Δ 205。用BamH I和EcoR I雙酶切表達載體pINT121，切割下的⑶S-N0S片段插入到表達載體pBINPLUS (該載體的構(gòu)建見van Engelen等發(fā)表的論文，即TransgenicResearch, 1995，4:288-290)的BamH I/EcoR I位點中，構(gòu)建后的載體為pBINGUS，該載體作為陰性對照，載體PINT121作為陽性對照(圖4)。實施例3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將各啟動子構(gòu)建物通過電擊法導入農(nóng)桿菌宿主細胞參照文獻[Mattanovich etal. , Nucleic Acids Research, 1989，17:6747],具體方法如下28°C, 200rpm條件下培養(yǎng)根癌土壤桿菌16h左右，用I. 5mL離心管取I. 5mL菌液，8000rpm離心30s后去殘液，將沉淀用ImL ddH20充分懸浮，再8000rpm離心30s，重復以上步驟3次。去掉殘液后將沉淀用200 μ LddH20懸浮，即為電擊農(nóng)桿菌感受態(tài)。取200ng重組質(zhì)粒至200 μ L感受態(tài)，輕打混勻，然后轉(zhuǎn)移至電擊杯中，置冰上。裝好電擊裝置，電壓為2500V,按住電擊按鈕,直到啪的一聲即電擊完畢。室溫靜止2min后加入800 μ L YEP培養(yǎng)基(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉)，28°C靜置lh，然后28°C 200rpm振蕩2h。8000rpm離心30s收集菌液，沉淀用200 μ LddH20懸浮后涂板。用特異性引物對其進行PCR鑒定，篩選陽性克隆。實施例4啟動子的瞬間表達I)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及誘導參照文獻[Kapila et al. , PlantScience, 1997，122:101-108]將各啟動子表達載體的農(nóng)桿菌菌液接種于含相應(yīng)抗生素的液體YEP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，重懸于MMA溶液(IOmmoI/L 2- (N-嗎啉)-乙基磺酸(MES, pH 5. 6)、0. lmmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L氯化鎂)，并調(diào)整菌液濃度使其OD6qq=L 5，室溫靜置放置3h。2)瞬間表達參照文獻[劉兆明等，生物工程學報，2002，18卷4期411-414;Yanget al. , The Plant Journal, 2000，22:543-551]對植株葉片采取農(nóng)桿菌浸潤法。具體方法選取6-7周齡本氏煙植株中部未完全展開葉片,取一支ImL的一次性注射器,摘掉針頭,用針管靠壓力將500 μ L重懸菌液完全注入每片葉片的脈間細胞中。將農(nóng)桿菌浸潤和農(nóng)桿菌注射后的植株于25°C恒溫室中培養(yǎng),光照周期為16/8h。60-72h后取樣進行⑶S突光活性分析和GFP熒光檢測。
實施例5⑶S及GFP檢測GUS 突光光度測定參照文獻[Jefferson et al. , The EMBOJournal, 1987，6:3901-3907]將采樣后的植株葉片經(jīng)液氮研磨，加入3倍體積的⑶S提取液(50mmol/L 憐酸緩沖液 pH 7. O, 10mmol /I,乙二胺四乙酸二鈉，O. l%(w/v) TritonX-100, O. l%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉，lOmmol/L0-巰基乙醇)，離心后取上清10 μ L與
4-MUG (4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖醛酸)反應(yīng)，熒光光度儀測定⑶S活性。如圖5，A為各個啟動子構(gòu)建物多次重復后(重復次數(shù)不小于6)測得的GUS活性，B為各啟動子構(gòu)建物的平均表達活性。實驗數(shù)據(jù)通過SAS8. O軟件的多次重復比較ANOVA的LSD方法進行分析，以陽性對照ΡΙΝΤ121的35S啟動子活性為參照，結(jié)果表明啟動子420 Δ 37的活性是35S啟動子活性的11. 72%，啟動子420 Λ 127的活性是35S啟動子活性的16. 53%，啟動子420 Λ 193的活性是35S啟動子活性的12. 91%，啟動子420 Δ 205的活性是35S啟動子活性的7. 26%。而且各啟動子與陽性對照ΡΙΝΤ121之間均存在極顯著性差異(Ρ〈0. 01)，具體數(shù)據(jù)見表I。表I
動子缺火片段相對f均GUS活性實驗珉復次數(shù)
SLQ ID NO; I-420—384 11.72土0.887
SEQ ID NO: 2-420—294 16.53 ±2.447
SI·.O !I.) NO 3-420—228 12.91+2.34
Si'Q !I.) NO: I-420—216 7.26±2·17
FroiTidterless (ρΠ1Ν(ιΙ.:S)0,56+0,486
CaMV 35S(pINT121)100.00±6J16注表中相對活性以CaMV 35S啟動子為參照。GFP熒光檢測將浸潤后的本氏煙葉片，在載玻片上滴一滴水，取煙草葉片浸潤部位并背面朝上鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片后倒置于激光共聚焦顯微鏡下，用藍光激發(fā)，觀察煙草表皮細胞中綠色熒光表達情況，分析啟動子表達活性并拍照記錄(圖6A)。圖6B為各啟動子構(gòu)建物的平均相對GFP表達活性，采用相同激光強度激發(fā)下單位面積內(nèi)GFP的熒光強度值。實驗數(shù)據(jù)通過SAS8. O軟件的多次重復比較ANOVA的LSD方法進行分析，以陽性對照PCHF3-GFP的35S啟動子活性為參照，計算結(jié)果與GUS熒光活性值計算結(jié)果保持一致。以上的實例是用來描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。由前面的描述來看，除了本文所說明和描述的外，本發(fā)明的各種 修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是淺顯易懂的。序列表(I) 一般資料(i)申請人錢亞娟，張潔，周雪平，吳建祥(ii)發(fā)明主題煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子(Iii )序列數(shù)4(2) SEQ ID NO: I 的資料⑴序列特征(A)長度383堿基對⑶類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性( ii )分子類型基因組DNA(iii)推測非( iv )反義非( V )序列描述SEQ ID NO: Iaaagaaggaa tgaaatgaaa aaaaaataaa catacaagcc caataataca attcaattga 60gaaaacccgg ccccgcaggg gcaatgtctt tgatgcaggc ccaaataaat aaaattaact 120tgaataaaga aaagggaaaa aaaataaata aagtattata aaaacgacgt cgtatgagta 180agtgggggat tttttgtata ttataaaagt tagagggact aaaagtgtca atatgaaggt 240tcttaggtcc ttatgaatgc aattattagg gttcctagga tataaataac acgtcaccga 300ggctggtata gtattaccca gcctcggcac ccgctccttg gaaccctcgt gctttccgcg 360tgctctctct cttcttcaca gaa383(3) SEQ ID NO: 2 的資料( i )序列特征(A)長度293堿基對⑶類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性( ii )分子類型基因組DNA(iii)推測非(iv)反義非( V )序列描述SEQ ID NO:2tgatgcaggc ccaaataaat aaaattaact tgaataaaga aaagggaaaa aaaataaata 60aagtattata aaaacgacgt cgtatgagta agtgggggat tttttgtata ttataaaagt 120tagagggact aaaagtgtca atatgaaggt tcttaggtcc ttatgaatgc aattattagg 180gttcctagga tataaataac acgtcaccga ggctggtata gtattaccca gcctcggcac 240ccgctccttg gaaccctcgt gctttccgcg tgctctctct cttcttcaca gaa293(4) SEQ ID NO: 3 的資料
( i )序列特征(A)長度227堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性( )分子類型基因組DNA(iii)推測非(iv)反義非( V )序列描述SEQ ID NO:3tataaaaacg acgtcgtatg agtaagtggg ggattttttg tatattataa aagttagagg 60gactaaaagt gtcaatatga aggttcttag gtccttatga atgcaattat tagggttcct 120aggatataaa taacacgtca ccgaggctgg tatagtatta cccagcctcg gcacccgctc 180cttggaaccc tcgtgctttc cgcgtgctct ctctcttctt cacagaa227(5) SEQ ID N0:4 的資料( i )序列特征(A)長度215堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性( )分子類型基因組DNA(iii)推測非(iv)反義非( V )序列描述SEQ ID N0:4gtcgtatgag taagtggggg attttttgta tattataaaa gttagaggga ctaaaagtgt 60caatatgaag gttcttaggt ccttatgaat gcaattatta gggttcctag gatataaata 120acacgtcacc gaggctggta tagtattacc cagcctcggc acccgctcct tggaaccctc 180gtgctttccg cgtgctctct ctcttcttca cagaa21權(quán)利要求
1.一種煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子，其特征在于所述啟動子DNA序列為煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示DNA序列。
2.—種DNA構(gòu)建體，其特征在于包括煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或SEQ ID N0:4，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。
3.一種利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因的方法，其特征在于包括如下步驟 (a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因連接到煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的R印ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4 DNA序列下游以獲得重組DNA片段； (b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中； (c)用上述重組表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞； (d)培養(yǎng)該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。
4.一種利用植物細胞制備蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括如下步驟 (a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質(zhì)的DNA連接到煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的Rep ORF 的缺失啟動子 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4DNA序列下游，獲得重組DNA片段； (b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體； (C)重組表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌或基因槍法轉(zhuǎn)化植物細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞以表達所需的蛋白質(zhì)； (d)從培養(yǎng)物中回收所需的蛋白質(zhì)。
5.—種表達載體,其特征在于含有煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的Rep ORF的缺失啟動子 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 DNA 序列，其中所述載體是適用于植物細胞的質(zhì)粒載體、噬菌體或病毒等，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草曲莖病毒衛(wèi)星啟動子。該啟動子來自于煙草曲莖病毒相伴隨的alpha衛(wèi)星分子。分離的啟動子是該alpha衛(wèi)星分子的RepORF的上游非編碼區(qū)序列。本發(fā)明涉及了煙草曲莖病毒alpha衛(wèi)星分子的RepORF的啟動子序列以及含有該RepORF啟動子序列的表達盒。本發(fā)明中的啟動子可應(yīng)用，于植物抗病毒基因工程及植物轉(zhuǎn)基因工程。
文檔編號C12N15/113GK102634519SQ20121013732
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月3日
發(fā)明者吳建祥, 周雪平, 張潔, 錢亞娟 申請人:浙江大學