專利名稱：一種利用重組羰基還原酶催化制備(r)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌重組質(zhì)粒無細胞提取物制備普利類藥物關(guān)鍵手性中間體0 )-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，高血壓日益危害著人們的健康。0 )-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl 0 )-2_hydroxy-4-phenylbutyrate, (R) -HPBE)是合成眾多普利系列血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑的關(guān)鍵手性中間體，如賴諾普利，依那普利，卡托普利等[1]。由于ACEI類藥物的高效性和低副作用，其已成為目前市場上最暢銷的藥物之一。以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)作為還原反應(yīng)的潛手性底物，易于合成且價格低廉，以其作為底物進行不對稱還原反應(yīng)獲得0 )-ΗΡΒΕ是非常經(jīng)濟有效的制備途徑。目前為止，{R)~2~羥基-4-苯基丁酸乙酯的合成路線主要包括化學(xué)法和生物法。化學(xué)法分為化學(xué)合成法和化學(xué)拆分法?；瘜W(xué)合成法往往反應(yīng)步驟復(fù)雜，且需要昂貴的試劑，或者反應(yīng)條件十分苛刻。化學(xué)拆分法存在的問題是以光學(xué)純苯乙胺類衍生物作拆分劑，由于其價格昂貴，實用價值不大[2]。生物法包括脂肪酶拆分法、野生菌催化法和基因工程菌催化法。生物拆分法方面，Lies等利用來自Pseudomorms cepaica的脂肪酶拆分外消旋2_輕基_4_苯基丁酸乙酯,得到m值大于99. 5%的產(chǎn)物M。Inada等用微生物直接作用于2-羥基-4-苯基丁酸乙酯拆分得0 ) -HPBE,產(chǎn)率和ee值分別可達42%和95%[4]。然而，外消旋體拆分的理論轉(zhuǎn)化率僅為50%，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。目前最受關(guān)注和研究最多的是生物合成法。野生菌催化方面，Chen等人利用Candida boidinii成功制備了 0 ) -HPBE，ee值和產(chǎn)率分別為99%和92%[5]。Oda等用C. holmii還原0ΡΒΕ，得到產(chǎn)率和ee值分別為58%和90%的0 ) -HPBEte]。由于野生菌中酶系復(fù)雜，可能含有多種不同的甚至相反的立體選擇性的酶，所以很難達到99%以上的m值。利用改造的基因工程菌對OPBE進行不對稱還原生成(ZP)-HPBE的報道目前還比較少，Iwona等將所篩選的釀酒酵母cerevisiae的基因Yprlp在大腸桿菌中表達純化后獲得的重組蛋白YprlP，在外加NAD+和6-磷酸葡萄糖脫氫酶的條件下將OPBE不對稱催化還原成m值為97%的0 ) -HPBEm。目前為止，利用重組的基因工程菌催化OPBE不對稱還原成(TP)-HPBE的報道中，ee值最高為98%。本發(fā)明中的重組羰基還原酶IolS可應(yīng)用于不對稱還原制備ee值大于99. 5%的0 )_ΗΡΒΕ。本專利中涉及到的羰基還原酶是醛酮還原酶的一種，全長310個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ NO. 2所示；編碼該蛋白的基因長度為933bp，已提交至Genbank中，收錄號為JQ782389，其基因序列如SEQ NO. I所示。至今尚無關(guān)于該羰基還原酶用于OPBE不對稱還原(TP)-HPBE的公開報道。參考文獻
1]Maruyama S，Nakagomi K，Tomizuka N，et al (1985) Angiotensin !-convertingenzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of casein. Agric BiolChem 49: 1405-1409。[2]張文(2009)生物催化制備(R)_2-羥基-4-苯基丁酸乙酯.[碩士學(xué)位論文].無錫江南大學(xué)。[3] Liese A, Kragl U, Kierkels H, et al (2002) Membrane reactordevelopment for the kinetic resolution of ethyl 2-hydroxy-4-phenylbutyrate.Enzyme Microb Technol 30: 673-681。[4]Inada Y, Oda S (1999) Microbial Manufacture of Optically Active2-Hydroxycarboxylic Acid Esters.JP, 10304894。[5]Chen Y Z, Lin H, Xu X Y, et al (2008) Preparation the key intermediateof angiotensin- converting enzyme (ACE) inhibitors: high enantioselectiveproduction of ethyl (R)-2-hydroxy -4-phenylbutyrate with Candida boidiniiCI0C21. Adv Synth Catal 350: 426-430。[6] Oda S, Inada Y, Kobayashi A, et al (1998) Production of ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenylbutanoate via reduction of ethyl 2-oxo~4-phenylbutanoatein an interface bioreactor. Biosci Biotechnol Biochem 62: 1762-1767。[7] Kaluzna I, Andrew A A, Bonilla M, et al (2002) Enantioselectivereductions of ethyl 2-oxo~4-phenylbutyrate by Saccharomyces cerevisiaedehydrogenases. J. Mol. Catal. B: Enzym 17(2): 101-105。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組大腸桿菌無細胞提取物作為催化劑，應(yīng)用于催化不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備光學(xué)純0 )-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法。該方法不需要添加或少量添加昂貴的輔酶，極大地降低了生產(chǎn)成本，且產(chǎn)物的光學(xué)純度高，條件溫和，易于工業(yè)化放大。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
從枯草芽孢桿菌(也&77心subti I is) CGMCC NO. I. 1508中克隆出羰基還原酶IolS，氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。從枯草芽孢桿菌subti I is) CGMCC NO. I. 1508中克隆出葡萄糖脫氫酶⑶H，核酸序列如SEQ NO. 3所示，氨基酸序列如SEQ NO. 4所示。采用雙啟動子法串聯(lián)IolS基因和⑶H基因，構(gòu)建pET24a-G-T7_I質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)。一種氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基還原酶，GenBank收錄號JQ782389，或者是在保持該羰基還原酶催化活性的條件下，由插入、缺失或替換如SEQ NO. 2所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸而得到的變異的氨基酸序列的羰基還原酶，在不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備0 )-2_羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用。一種含所述羰 基還原酶的大腸桿菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，從枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilisXGMCC NO. I. 1508中克隆了羰基還原酶IolS和葡萄糖脫氫酶⑶H基因片段，采用雙啟動子法串聯(lián)IolS基因和GDH基因，構(gòu)建了 pET24a-G-T7-I質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)而獲得的大腸桿菌重組質(zhì)粒，實現(xiàn)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的共表達。所述大腸桿菌重組質(zhì)粒的應(yīng)用，以所述大腸桿菌重組質(zhì)粒的無細胞提取物為催化齊U，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，葡萄糖為輔底物，在不添加或添加少量NADP+輔因子 (〈0.05 mmol/L)的條件下,進行生物轉(zhuǎn)化制備0 ) _2_輕基-4-苯基丁酸乙酯，ee值大于99. 5% ；
水相反應(yīng)15 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL無細胞提取物，200 g/L的D-葡萄糖，20 g/L的OPBE和O. 05 mM的NADP+，37°C在220 r/min搖床震蕩反應(yīng)13-15h ；
水/辛醇兩相反應(yīng)5 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL無細胞提取物，200 g/L 的 D-葡萄糖，20 g/L 的 0PBE，0. 05mM 的 NADP+以及 IOmL 的辛醇，37°C在 220 r/min搖床震蕩反應(yīng)13-15 h。本發(fā)明構(gòu)建的共表達重組質(zhì)粒能夠?qū)崿F(xiàn)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的高效共表達，可應(yīng)用于高效催化不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備光學(xué)純0 ) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，ee值大于99. 5%。同時，通過采用水/辛醇兩相反應(yīng)體系、分批添加底物等方式，解決了底物和產(chǎn)物對酶的抑制作用，顯著提高了轉(zhuǎn)化效果。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基還原酶應(yīng)用于不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備0 ) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，取得了較好的效果，粗酶液中羰基還原酶的比酶活達到I. 5 U/mg，產(chǎn)物的對映體過量值大于99. 5%。通過與葡萄糖脫氫酶共表達，解決了輔因子的再生問題，且對羰基還原酶的酶活沒有影響。在水/辛醇兩相體系中，不對稱還原20g/L的底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，可獲得ee值大于99. 5%的0 ) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，轉(zhuǎn)化率為70. 4%。


圖I羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。I :DNA marker ;2 :⑶H基因；3 :IolS基因。圖2重組質(zhì)粒pET24a-G-T7_I的構(gòu)建圖。圖3大腸桿菌重組質(zhì)粒中羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的SDS-PAGE圖。I 蛋白 Marker ;2 么 co7iBL21(DE3)空白對照；3 么 coli BL21(DE3)/pET24a-G-T7-I 誘導(dǎo)后總蛋白；4 么 coli BL21 (DE3)/pET24a_G-T7_I 誘導(dǎo)后可溶蛋白。
具體實施例方式實施例I羰基還原酶基因的獲取
枯草芽孢桿菌心subti I is) CGMCC NO. I. 1508來自于中國普通微生物菌種保藏管理中心，培養(yǎng)基LB (g/L):胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,補水至I L。將枯草芽孢桿菌接種于50 mL液體培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)至對數(shù)培養(yǎng)期，使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組。引物序列設(shè)計如下
上游引物IolSf含有Atie I 5， -GGAATTCCATATGAAAAAAGCGAAGCTCGG-3>下游引物IolSr含有Zho I 5， -CCGCTCGAGTGCGAACAGCTTATCAAT-3，
PCR條件為:95°C變性5 min，按如下參數(shù)循環(huán)30次95 °C變性I min，62°C退火50 S，72°C延伸I min。最后72 °C延伸10 min。PCR結(jié)果如圖I所示。實施例2擬基還原酶基因的表達
用Me I和Jho I分別酶切pET20b和羰基還原酶基因，將酶切回收產(chǎn)物用T4連接酶連接過夜。將連接產(chǎn)物加入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，熱休克法轉(zhuǎn)化，涂布于含有100 μ g/mL的氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12 h。以載體所帶氨芐青霉素抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子。陽性重組子采用菌落PCR和提取質(zhì)粒雙酶切的方法進行驗證。實施例3葡萄糖脫氫酶基因的獲取
菌株培養(yǎng)和基因提取如實施例I。引物序列設(shè)計如下
上游引物⑶Hf含有Me I 5’ -GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGC-3>
下游引物⑶Hr含有Mnd III 5， -CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGC-3，
PCR條件為:95°C變性5 min，按如下參數(shù)循環(huán)30次95°C變性I min, 55 °C退火50 S，72°C延伸I min。最后72°C延伸10 min。PCR結(jié)果如圖I所示。實施例4葡萄糖脫氫酶基因的表達
用Me I和"ind III分別酶切pET24a和葡萄糖脫氫酶基因，將酶切回收產(chǎn)物用T4連接酶連接過夜。將連接產(chǎn)物加入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，熱休克法轉(zhuǎn)化，涂布于含有50 μ g/mL的卡那青霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)12 h。以載體所帶卡那青霉素抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子。陽性重組子采用菌落PCR和提取質(zhì)粒雙酶切的方法進行驗證。實施例5羰基還原酶酶活的測定
重組大腸桿菌的粗酶液制備重組大腸桿菌接種至含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C，180 r/min培養(yǎng)過夜后，以體積分?jǐn)?shù)I %接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C, 200 r/min培養(yǎng)至OD為O. 6 O. 9時，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為O. 4 mmol/L)，誘導(dǎo)4 h后測定羰基還原酶活力。取經(jīng)誘導(dǎo)的菌液離心(4°C,5000 r/min離心15 min),菌體用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)重懸，超聲破碎細胞(功率300 W，超聲I S，間歇3
S,共10 min) ,4°C, 11000 r/min離心15 min),測定上清液中羰基還原酶的酶活。羰基還原酶活力測定酶反應(yīng)體系包括100 mM磷酸鉀緩沖溶液(pH 6. 0),0. I mMNADPH, I mM 0PBE,340 nm處測定吸光值的下降。酶活定義為每分鐘消耗I μ mol NADPH所需要的酶量為一個酶活單位U。蛋白采用Brandford法進行測定。結(jié)果顯示粗酶液中羰基還原酶的比酶活為I. 5 U/mg。實施例6葡萄糖脫氫酶酶活的測定
重組大腸桿菌細胞粗酶液制備重組大腸桿菌接種至含50 μ g/mL卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C，180 r/min培養(yǎng)過夜后，以體積分?jǐn)?shù)I %接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C, 200 r/min培養(yǎng)至OD為O. 6 O. 9時，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為O. 8 mmol/L)，誘導(dǎo)4 h后測定葡萄糖脫氫酶活力。取經(jīng)誘導(dǎo)的菌液離心(4 °C, 5 000 r/min離心15 min)，菌體用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)重懸，超聲破碎細胞(功率300 W，超聲I S，間歇3 S，共10 min), 4 °C，11 000 r/min離心15 min)，測定上清液中葡萄糖脫氫酶的酶活。葡萄糖脫氫酶活力測定酶反應(yīng)體系包括75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),2.0mmol/L NADP+, O. I mol/L D-葡萄糖，340 nm處測定吸光值的上升。酶活定義為每分鐘生成I μ mol NADPH所需要的酶量為一個酶活單位U。蛋白采用Brandford法進行測定。結(jié)果顯示粗酶液中葡萄糖脫氫酶的比酶活為9. 5 U/mg ο實施例7羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶基因的共表達
從以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET20b-I上通過PCR擴增獲得連有T7啟動子的羰基還原酶基因(T7-iolS)片斷。N端引物含有ArOt I限制性酶切位點
T7-IolSf: 5’ -AAGGAAAAAA GCGGCCGCTA ATACGACTCA CTATAG-3’。C 端引物為 IolSr。將PCR擴增出的連有T7啟動子的羰基還原酶基因(TJ-iolS、，分別經(jīng)Abt I和Zho I酶切后與進行相同酶切的pET24a-G相連，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET24a_G-T7_I (圖2)。重組質(zhì)粒經(jīng)熱休克法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。以載體所帶卡那青霉素抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子。陽性重組子采用菌落PCR和提取質(zhì)粒雙酶切的方法進行驗證。實施例8 SDS-PAGE檢測目的蛋白
取誘導(dǎo)后的菌體重懸液超聲破碎，離心取上清進行SDS-PAGE分析。采用4%的濃縮膠，15%的分離膠，電泳后凝膠用考馬斯亮藍G250染色(圖3)。實施例9大腸桿菌重組質(zhì)粒無細胞提取物的制備
重組大腸桿菌接種至含50 μ g/mL卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、180 r/min培養(yǎng)過夜后，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，200 r/min培養(yǎng)至OD為
0.6 0. 9時，加入誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度為0. 8 mmol/L)，25°C誘導(dǎo)4 h。取經(jīng)誘導(dǎo)的菌液離心(4 °C, 5000 r/min離心15 min),菌體用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)重懸,超聲破碎細胞(功率300 W，超聲I S，間歇3 S，共10 min)后，4°C，11000 r/min離心15 min,所得上清液作為無細胞提取物用于不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)。實施例10重組大腸桿菌無細胞提取物催化OPBE的不對稱還原
水相反應(yīng)15 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL無細胞提取物，200 g/L的D-葡萄糖，20 g/L的OPBE和0. 05 mM的NADP+，37°C在220 r/min搖床震蕩反應(yīng)15 h。水/辛醇兩相反應(yīng)5 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL無細胞提取物，200 g/L 的 D-葡萄糖，20 g/L 的 0ΡΒΕ，0. 05mM 的 NADP+ 以及 IOmL 的辛醇。37°C在 220r/min搖床震蕩反應(yīng)15h。反應(yīng)時間進程曲線如下表所示，由表可知，約13 h反應(yīng)達到平衡，水相中轉(zhuǎn)化率達到52. 5%，水/辛醇兩相中轉(zhuǎn)化率達到70. 5%。
權(quán)利要求
1.一種氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基還原酶，GenBank收錄號JQ782389，或者是在保持該羰基還原酶催化活性的條件下，由插入、缺失或替換如SEQ NO. 2所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸而得到的變異的氨基酸序列的羰基還原酶，在不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備0 )-2_羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
2.一種含權(quán)利要求I所述羰基還原酶的大腸桿菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于從枯草芽孢桿菌(及^77心subtilisXmCC NO. I. 1508中克隆了羰基還原酶IolS和葡萄糖脫氫酶⑶H基因片段，采用雙啟動子法串聯(lián)IolS基因和⑶H基因，構(gòu)建了 pET24a-G-T7-I質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)而獲得的大腸桿菌重組質(zhì)粒，實現(xiàn)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的共表達。
3.權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的大腸桿菌重組質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于以所述大腸桿菌重組質(zhì)粒的無細胞提取物為催化劑，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，葡萄糖為輔底物，在不添加或添加〈O. 05 mmol/L NADP+輔因子的條件下，進行生物轉(zhuǎn)化制備0 )-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，θθ值大于99. 5% ； 水相反應(yīng)100 mmol/L，pH值6. O的15 mL磷酸鉀緩沖液，5 mL無細胞提取物，200 g/L的D-葡萄糖，20 g/L的OPBE和O. 05 mM的NADP+，37°C在220 r/min搖床震蕩反應(yīng)13-15h ； 水/辛醇兩相反應(yīng)100 mmol/L，pH值6. O的5 mL磷酸鉀緩沖液，5 mL無細胞提取物，.200 g/L 的 D-葡萄糖，20 g/L 的 0PBE，0. 05mM 的 NADP+以及 IOmL 的辛醇，37°C在 220 r/min搖床震蕩反應(yīng)13-15 h。
全文摘要
一種利用重組羰基還原酶催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本方法從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆了羰基還原酶(IolS)和葡萄糖脫氫酶(GDH)基因片段，采用雙啟動子法串聯(lián)表達IolS基因和GDH基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET24a-G-T7-I，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)。以該大腸桿菌重組質(zhì)粒的無細胞提取物為催化劑，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，葡萄糖為輔底物，在不添加或添加少量NADP+輔因子的條件下，進行生物轉(zhuǎn)化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，產(chǎn)物的對映體過量值高于99.5%。本發(fā)明通過IolS和GDH的共表達，實現(xiàn)細胞內(nèi)輔因子NADP(H)的高效再生，降低了生產(chǎn)成本，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/19GK102618590SQ20121013769
公開日2012年8月1日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者倪曄, 宿宇寧, 李海東, 薛天蕓 申請人:江南大學(xué)