專利名稱：一種新的肝癌分子標(biāo)志物視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥防治領(lǐng)域，尤其涉及視黃酸受體應(yīng)答蛋白2及其C末端活性片段在癌癥防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界最常見(jiàn)，且最具危害性的癌癥之一，位列世界第五大常見(jiàn)癌癥，以及第三大常見(jiàn)癌癥相關(guān)死因，僅次于肺癌和胃癌。肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)極為活躍，侵襲性強(qiáng)，易侵犯包膜和血管，由于肝內(nèi)有豐富的血竇，因此肝內(nèi)轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)，多數(shù)患者早期即可有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。肝癌細(xì)胞侵犯門靜脈分支形成癌栓，肝癌伴有 門靜脈癌栓被認(rèn)為是預(yù)后差的主要指標(biāo)之一。肝外轉(zhuǎn)移以血行轉(zhuǎn)移為主，多見(jiàn)于晚期病人，肺為HCC肝外最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移器官，其次為骨，腎上腺，腎，腦等。肝癌的高轉(zhuǎn)移率，是肝癌預(yù)后較差的重要原因。因此，研究肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移及惡化機(jī)制，發(fā)展有效的治療策略，是當(dāng)前刻不容緩的任務(wù)。Chemerin,亦名為 tazarotene-induced gene 2 (TIG2),或 retinoic acidreceptor responder 2 (RARRES2,視黃酸受體應(yīng)答蛋白2),最早被鑒定為存在于銀屑病皮損中的一個(gè)新的類維生素A應(yīng)答基因。后來(lái)，它被鑒定為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體chemokine-like receptor I (CMKLR1,也稱ChemR23)的一個(gè)分泌型配體，首次揭不了它的生物學(xué)功能。之后更多的研究表明，chemerin還是另外兩個(gè)受體chemokine (C_C motif)receptor-like (CCRL) 2 和 G protein-coupled receptor (GPR) I 的配體。不過(guò)，這兩個(gè)受體在哺乳類動(dòng)物中的功能還不是很清楚。chemerin通常以ー種活性微弱的前體形式(prochemerin)被分泌出細(xì)胞，需要將C端的數(shù)個(gè)氨基酸剪切掉，成為活性形式，激活它的受體ChemR23。由于不同的酶的識(shí)別和剪切序列不盡相同，因此可得到chemerin-154,155,156,157等多種形式(對(duì)應(yīng)著C末端的9,8,7,6個(gè)氨基酸被剪切掉)的活性chemerin。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,chemerin-157的C末端,尤其是第149-157位的九肽(chemerin-9),對(duì)于chemerin受體的激活是非常關(guān)鍵的，chemerin-9保留了 chemerin-157的絕大部分激活受體的活性。涉及先天性免疫和后天性免疫的許多種細(xì)胞都表達(dá)chemerin受體CMKLRl，目前，已知chemerin扮演著趨化因子的角色，將這些細(xì)胞招募到淋巴器官和組織受損處。此外，研究報(bào)道chemerin的表達(dá)和分泌在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中顯著升高。而且，在細(xì)胞模型中，chemerin或者CMKLRl表達(dá)的喪失幾乎完全阻止了脂肪細(xì)胞的生成，并且改變了糖脂代謝中重要基因的表達(dá)，包括GLUT4, DGAT2, Ieptin和adiponectin。這些研究揭不chemerin不僅是一個(gè)趨化因子，還扮演著脂肪細(xì)胞因子的角色。雖然目前在免疫、心血管疾病及代謝疾病等方面都對(duì)chemerin進(jìn)行了研究并有相關(guān)報(bào)道，但是，對(duì)它在腫瘤方面的作用和機(jī)制鮮有報(bào)道。這正是我們這項(xiàng)發(fā)明中所要闡述的
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一方面提供視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽或其激動(dòng)劑、視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明第二方面提供視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽或其激動(dòng)劑、視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備抑制患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明第三方面提供視黃酸受體應(yīng)答蛋白 2或其相關(guān)多肽或其激動(dòng)劑、視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備抗腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用。在一具體實(shí)施例中，所述抗腫瘤血管生成包括抑制癌癥發(fā)生、發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移過(guò)程中的血管生成。本發(fā)明第四方面提供一種用于癌癥預(yù)后的診斷試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測(cè)樣品中的視黃酸受體應(yīng)答蛋白2水平的試劑。本發(fā)明第五方面提供能檢測(cè)視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的試劑在制備用于癌癥診斷的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明第六方面提供視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽或其激動(dòng)劑、視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備抑制Akt信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽或其激動(dòng)劑、視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備抑制VEGF的mRNA及蛋白水平的藥物中的應(yīng)用。在一具體實(shí)施例中，所述視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽或其激動(dòng)劑、視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的編碼序列或其相關(guān)多肽或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物通過(guò)抑制VEGF啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)其mRNA的水平。本發(fā)明還包括視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽或其激動(dòng)劑、視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備促進(jìn)Ml巨噬細(xì)胞的分化的藥物中的應(yīng)用。在一具體實(shí)施例中，Ml巨噬細(xì)胞的分化生成抑癌的微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)癌癥的抑制和/或治療。本發(fā)明中，視黃酸受體應(yīng)答蛋白2選自(I) SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；或(2)在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸且保留SEQ ID NO 2的生物學(xué)活性或功能的氨基酸序列。本發(fā)明中，視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的編碼序列的一個(gè)例子如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明中，視黃酸受體應(yīng)答蛋白2包括C末端被截短了 I 一 10個(gè)氨基酸的截短的視黃酸受體應(yīng)答蛋白2。在一具體實(shí)施例中，用于本發(fā)明上述各種方法或用途的視黃酸受體應(yīng)答蛋白2如SEQ ID NO: 2的第21-157位(SEQ ID NO: 49)所示，或如SEQ ID NO: 2第21 — 156位、第21 — 155位或第21 — 154位氨基酸所示。本發(fā)明也包括在截短的視黃酸受體應(yīng)答蛋白2中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸且保留該截短的視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的生物學(xué)活性或功能的氨基酸序列。本發(fā)明中，視黃酸受體應(yīng)答蛋白2相關(guān)多肽選自( I)視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的C末端活性片段或其活性變異體；(2)含有(I)所述C末端活性片段或其活性變異體的多肽；和(3)在(I)- (2)所述的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加ー個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸且保留(I) - (2)所述的氨基酸序列的生物學(xué)活性或功能的氨基酸序列。本發(fā)明中，視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的C末端活性片段包括含有YFPGQFAFS的C末端活性片段，其長(zhǎng)度可在9 一 20個(gè)氨基酸殘基。示例性的C末端活性片段包括但不限于SEQID NO:25 一 30和41所示的那些片段。、
本發(fā)明C末端活性片段的活性變異體包括YFPGQFAFS的變異體以及含有YFPGQFAFS的C末端活性片段的變異體。具體而言，所述變異體包括在YFPGQFAFS中或在含有YFPGQFAFS的C末端活性片段中經(jīng)過(guò)取代、缺失、添加或化學(xué)修飾ー個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基且保留YFPGQFAFS或含有YFPGQFAFS的C末端活性片段的生物學(xué)活性或功能的變異體。示例性的變異體包括但不限于X1X2PGqFAFX9 (SEQ ID N0:48)，其中，X1和X2任選為芳香族殘基或疏水殘基，X9為絲氨酸殘基或C末端羧基中的羥基被氨基取代的天冬氨酸殘基(D-CONH2)tj示例性的變異體包括但不限于SEQ ID N0:24、26、31 — 40和42_47所示的氨基酸序列。本發(fā)明還包括含有所述C末端活性片段或其變異體的能結(jié)合chemerin的受體ChemR23的多肽。這類多肽包括但不限于，例如SEQ ID NO:2第1-157位中含有YFPGQFAFS的長(zhǎng)20 — 156個(gè)氨基酸殘基的多肽。本發(fā)明中，含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物可以是ー種表達(dá)載體，其可表達(dá)視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其相關(guān)多肽。本發(fā)明中，所述癌癥選自甲狀腺癌，胰腺癌，乳腺癌，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，肝癌皮膚鱗狀細(xì)胞癌，腎上腺皮質(zhì)癌或前列腺癌等，優(yōu)選肝癌。本發(fā)明中，所述試劑盒可包含特異性結(jié)合視黃酸受體應(yīng)答蛋白2編碼序列或其受體的核苷酸引物。所述核苷酸引物的例子包括，例如針對(duì)視黃酸受體應(yīng)答蛋白2編碼序列的引物SEQ ID N0:3和4，和針對(duì)受體ChemR23的引物序列SEQ ID N0:5和6等?；蛘撸噭┖兄锌珊刑禺愋越Y(jié)合視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的試劑，例如視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的特異性抗體等。本發(fā)明的試劑盒還可包括指導(dǎo)進(jìn)行癌癥診斷的說(shuō)明書(shū)。


圖IA顯示，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR，檢測(cè)單克隆化的、具有不同轉(zhuǎn)移能力的MHCC97細(xì)胞中chemerin的表達(dá)水平,表示為單克隆化的細(xì)胞(M, H, L)分別與原初細(xì)胞chemerin (P)表達(dá)的比值，M、H和L三株單克隆化的細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力依次降低。圖IB顯示，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR，檢測(cè)了 46對(duì)配對(duì)的正常肝組織和肝癌組織中chemerin的mRNA表達(dá)，表示為肝癌組織(T)與相應(yīng)的正常肝組織(N)的Log2 (T/N)。
圖2A、2B、2C和2D分別代表了組織芯片的chemerin染色的4種情況，分別對(duì)應(yīng)于評(píng)分0,1,2,3。0表不檢測(cè)不到信號(hào)，I表不信號(hào)較弱，2表不信號(hào)明顯,較強(qiáng),3表不信號(hào)很強(qiáng)。圖2E顯示，結(jié)合臨床病理信息，對(duì)組織芯片的結(jié)果進(jìn)行了分析，chemerin的表達(dá)與患者的生存期存在顯著正相關(guān)(P#=0. 000333)。圖2F顯示，如果將“0，I”統(tǒng)ー劃為“0”級(jí)，把2，3統(tǒng)ー劃為“I”級(jí)，結(jié)合臨床病理信息，對(duì)組織芯片的結(jié)果重新進(jìn)行分析，則chemerin的表達(dá)與患者的生存期之間的正相關(guān)性更為顯著(P#=0. 0000724)。圖3顯示通過(guò)Boyden小室檢測(cè),檢測(cè)了 chemerin對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。A,7404 細(xì)胞，7404/v 代表對(duì)照細(xì)胞，7404/chemerin L, 7404/chemerin M 和 7404/chemerin H分別代表chemerin的表達(dá)量漸次升高的3個(gè)單克??；B,分別感染了對(duì)照病毒和chemerin表達(dá)病毒的PVTT-I和C，MHCC97H細(xì)胞的pool,其中，PVTT-I con和MHCC97H con為對(duì)照細(xì)胞，PVTT-I chemerin 和 MHCC97H chemerin 為高表達(dá) che merin 的細(xì)胞；D, SK-Hep-1/v為對(duì)照細(xì)胞，SK-Hep-l/chemerin L 和 SK-Hep-l/chemerin H 為 chemerin 表達(dá)量不同的兩個(gè)陽(yáng)性克?。籈, 7404/chemerin H icon為感染了對(duì)照病毒的細(xì)胞，而7404/chemerin H il和7404/chemerin H i2為感染了含有不同RNAi target序列的細(xì)胞；F,通過(guò)RNAi,下調(diào)了 HepG2細(xì)胞中chemerin的表達(dá)，其中，HepG2 chemerin icon為感染了對(duì)照病毒的細(xì)胞，HepG2 chemerin il, HepG2 chemerin i2, HepG2chemerin i3 分別代表感染了包含 3 條不同的RNAi target序列的病毒的細(xì)胞。圖4A顯示W(wǎng)estern Blot的結(jié)果，該結(jié)果顯示了在7404 (左)和PVIT-1 (中)肝癌細(xì)胞中，對(duì)照細(xì)胞和高表達(dá)chemerin的細(xì)胞中Akt的磷酸化水平(Ser473),右則顯示了在通過(guò)RNAi將chemerin的表達(dá)敲低的HepG2細(xì)胞中，Akt磷酸化水平的變化。圖4B顯示，使用I nM的具有活性的chemerin重組蛋白對(duì)7404細(xì)胞進(jìn)行處理,通過(guò)Western Blot檢測(cè)了 Akt磷酸化水平的變化。圖5A顯示了半定量PCR的結(jié)果，顯示了在7404 (左)，PVIT-1 (中)和MHCC97H(右)肝癌細(xì)胞中，對(duì)照細(xì)胞和高表達(dá)chemerin的細(xì)胞中VEGF的mRNA水平，包括VEGF165和VEGF121這兩個(gè)異構(gòu)體。圖5B顯示了 Western Blot的結(jié)果，顯示了在7404 (左)，PVIT-I(中)和MHCC97H (右)肝癌細(xì)胞中，對(duì)照細(xì)胞和高表達(dá)chemerin的細(xì)胞中VEGF的蛋白水平，包括55kDa附近的同型ニ聚體，以及17kDa附近的單體。圖5C顯示了小管形成實(shí)驗(yàn)(Tubeformation assay)的結(jié)果，分別使用來(lái)自 7404/v, 7404/chemerin, PVTT-I con, PVTT-Ichemerin,MHCC97H con,MHCC97H chemerin細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM),通過(guò)小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了來(lái)自對(duì)照和高表達(dá)chemerin的肝癌細(xì)胞的CM對(duì)HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞體外血管形成能力的影響。圖6顯示通過(guò)Boyden小室檢測(cè)了 chemerin對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響的結(jié)果。其中A, SK-Hep-I con 為對(duì)照細(xì)胞，SK-Hep-I/chemerin L 和 SK-Hep-l/chemerin H 為chemerin表達(dá)量不同的兩個(gè)陽(yáng)性克隆(見(jiàn)C) ;B, 7404/chemerin H icon為感染了對(duì)照病毒的細(xì)胞，而7404/chemerin H il和7404/chemerin H i2為感染了含有不同RNAi靶序列的細(xì)胞；C,通過(guò)Western Blot檢測(cè)了在過(guò)表達(dá)chemerin的SK-Hep-I細(xì)胞克隆中，以及chemerin被knockdown的7404/chemerin H細(xì)胞克隆中，標(biāo)注分子的表達(dá)變化。圖7 顯示，分別使用來(lái)自 A，SK-Hep-I con 和 SK-H印-1/chemerin 和 B，7404/chemerin H icon, 7404/chemerin H iI, 7404/chemerin H i2 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM),通過(guò)小管形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了來(lái)自對(duì)照和高表達(dá)chemerin/chemerin表達(dá)被抑制的肝癌細(xì)胞的CM對(duì)HUVEC細(xì)胞體外血管形成能力的影響。圖8A將PVTT-I con及PVTT-1 chemerin細(xì)胞對(duì)6周大的裸鼠分別進(jìn)行左心室注射，利用IVIS-imagingsystem，監(jiān)測(cè)標(biāo)記了熒光素酶的PVTT-1細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。圖8A中顯示了第0天(注射后立即檢測(cè))、第14天和第28天的情況；圖SB顯示了肝臟注射的結(jié)果，分別從正面和背面顯示了 PVTT-1 con組和PVTT-1 chemerin組中具有代表性的小鼠肝臟，白色實(shí)線箭頭所指為注射處形成的原發(fā)灶，白色虛線箭頭所指為表面可見(jiàn)的癌灶(foci);圖8B還顯示分別對(duì)應(yīng)于PVTT-1 con組小鼠(上)和PVIT-I chemerin組小鼠(下)的肝臟切片進(jìn)行的札E.染色；圖8C顯示，對(duì)PVTT-1 con組和PVTT-1 chemerin組的小鼠的注射葉表面可見(jiàn)的癌灶(左)和非注射葉的表面可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移的癌灶(將這些癌灶定義為肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶)的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。圖9顯示，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR，對(duì)已分化為巨噬細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)PVIT-I con和PVIT-I chemerin細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的已分化為巨噬細(xì)胞的THP-I細(xì)胞進(jìn)行分析，包括Ml型巨 噬細(xì)胞的標(biāo)記分子TNF-alpha (A)，IL_12a (B)，IL_6 (C)的表達(dá)，以及M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記分子CCL24 (D)的表達(dá)。Control為陰性對(duì)照，LPS刺激為陽(yáng)性對(duì)照(見(jiàn)“材料與方法”)。圖10 顯不，利用 AKTA purifer 和 Q Sepharose FF, SP Sepharose FF 純化得到的chemerin蛋白(電導(dǎo)率曲線反映溶液中離子濃度的變化);B，使用純化得到的蛋白進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)處理，通過(guò)Western Blot檢測(cè)Akt磷酸化水平的變化。圖11顯示，利用肝內(nèi)注射熒光標(biāo)記的PVTT-I細(xì)胞原位成瘤，使用chemerin進(jìn)行處理，以探索chemerin對(duì)肝癌的治療潛力。A, PBS對(duì)照組和chemerin處理組的生存曲線(n=10，數(shù)據(jù)截止處理第6周，虛線代表PBS對(duì)照組，實(shí)線代表chemerin處理組));B，PBS對(duì)照組和chemerin處理組的平均體重曲線，從第I天(以第一次腹腔注射蛋白為第I天)開(kāi)始測(cè)定，每隔四天稱量一次，直至第33天，結(jié)果以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(n=10)，實(shí)心框線代表PBS對(duì)照組，空心框線代表chemerin處理組。圖12顯示,通過(guò)Boyden小室檢測(cè),檢測(cè)細(xì)胞外活性形式的chemerin對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。A :分別對(duì)7404和PVTT-I細(xì)胞使用IOnM的活性形式的重組chemerin進(jìn)行預(yù)處理(0. 5h)，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中(7404 8h, PVTT-1 :6h)，每隔2h分別在對(duì)照孔中加IulPBS,在chemerin處理的孔中加IuL IOOxchemerin,以保持chemerin的持續(xù)作用；B :對(duì)7404/chemerin H 細(xì)胞分別使用 lug/ml 和 10ug/ml 的 chemerin 抗體(R&D, Cat. No :AF2324,配制于PBS中)進(jìn)行預(yù)處理(0. 5h)，然后進(jìn)行Boyden小室檢測(cè)，在對(duì)照組中，以相同濃度的正常羊IgG作為對(duì)照(抗chemerin抗體是羊來(lái)源的)。圖13顯示,在7404/chemerin H中分別轉(zhuǎn)入空載體和表達(dá)持續(xù)活化形式的Akt的CA-Akt,然后，A :和7404 con細(xì)胞一起進(jìn)行Boyden小室檢測(cè)；B :通過(guò)Western blot對(duì)CA-Akt的轉(zhuǎn)入進(jìn)行鑒定。HA表明外源CA-Akt的表達(dá)，GSK_3beta為Akt的下游靶標(biāo)，p-GSK-3beta (Ser9)的水平上升表明Akt下游通路的激活。圖14顯示，使用包含人VEGF啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試(Dual luciferase reporter assay),檢測(cè)chemerin對(duì)VEGF啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的影響。A、B、C分別為在三種不同的肝癌細(xì)胞系7721，Huh7和7404中的結(jié)果。圖15顯不，通過(guò)Boyden小室分析檢測(cè)了 chemerin-9和chemerin對(duì)7404細(xì)胞遷移能力的影響。分別使用IOnM chemerin-9和活性形式的重組chemerin對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理(0. 5h),在檢測(cè)過(guò)程中(8h),姆隔2h在對(duì)照孔中加Iul PBS,在chemerin-9和chemerin處理的孔中分別加入Iul IOOx原液，以保持chemerin-9和chemerin的持續(xù)作用；B,分別使用InM的chemerin-9和活性形式的重組chemerin對(duì)7404細(xì)胞進(jìn)行處理，2h后收取樣品，通過(guò)Western Blot檢測(cè)Akt磷酸化水平的變化(左),右為對(duì)Western Blot結(jié)果的輝度掃描定量圖。
具體實(shí)施例方式用于本發(fā)明的chemerin包括含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(其中，第I 一20位為信號(hào)肽)的多肽及其保留chemerin生物學(xué)活性的活性片段。本發(fā)明的chemerin還包括具有與chemerin蛋白相同功能的、SEQ ID N0:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加ー個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為I 0個(gè)以內(nèi)，更 佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。下表顯示了代表性的氨基酸取代。
權(quán)利要求
1.具有抗癌活性的多肽在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中含有(1)YFPGQFAFS ;或 (2)在YFPGQFAFS中經(jīng)過(guò)取代、缺失、添加或化學(xué)修飾ー個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基且保留YFPGQFAFS的生物學(xué)活性或功能的變異體。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述YFPGQFAFS的變異體為AAPGQFAFXg，其中，X1. X2為芳香族殘基或疏水殘基，X9為絲氨酸殘基或C末端羧基中的羥基被氨基取代的天冬氨酸殘基(D-CONH2)15
3.如權(quán)利要求I 2中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述YFPGQFAFS的變異體選自AFPGQFAFS、YAPGQFAFS、YFAGQFAFS、YFPAQFAFS、YFPGAFAFS、YFPGQAAFS、YFPGQFAAS、YFPGQFAFA、LFPGQFAFS、IFPGQFAFS、FLPGQFAFS、YLPGQFAFS、YVPGQFAFS、YFPGQFAFD-C0NH2、QRAGEDPHSFYFPGQFAF 或 FPGQFAFS。
4.如權(quán)利要求I 3中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽選自(1)YFPGQFAFS、AFPGQFAFS、YAPGQFAFS、YFAGQFAFS、YFPAQFAFS、YFPGAFAFS、YFPGQAAFS、YFPGQFAAS、YFPGQFAFA、LFPGQFAFS、IFPGQFAFS、FLPGQFAFS、YLPGQFAFS、YVPGQFAFS、YFPGQFAFD-C0NH2、QRAGEDPHSFYFPGQFAF 或 FPGQFAFS ； (2)SEQID NO:2所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO: 2中經(jīng)過(guò)取代、缺失、添加或化學(xué)修飾ー個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基且保留SEQ ID NO:2的生物學(xué)活性或功能的氨基酸序列；和 (3)SEQID N0:49所示的氨基酸序列，或在SEQ ID N0:49中經(jīng)過(guò)取代、缺失、添加或化學(xué)修飾ー個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基且保留SEQ ID NO:49的生物學(xué)活性或功能的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求I 4中任ー項(xiàng)所述多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求I 5中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽用于制備抑制患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的藥物。
7.如權(quán)利要求I 5中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽用于制備抗腫瘤血管生成的藥物。
8.權(quán)利要求I 4中任ー項(xiàng)所述多肽、所述多肽的編碼序列或含有所述編碼序列的多核苷酸構(gòu)建物在制備抑制Akt信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求I 8中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥選自甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌或前列腺癌。
10.如權(quán)利要求I 8中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥為肝癌。
11.ー種用于癌癥預(yù)后的診斷試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測(cè)樣品中的視黃酸受體應(yīng)答蛋白2水平的試劑。
12.如權(quán)利要求11所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性結(jié)合視黃酸受體應(yīng)答蛋白2編碼序列或其受體的編碼序列的核苷酸引物。
13.如權(quán)利要求11所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性結(jié)合視黃酸受體應(yīng)答蛋白2或其受體的抗體。
14.如權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括指導(dǎo)進(jìn)行癌癥診斷的說(shuō)明書(shū)。
15.能檢測(cè)視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的試劑在制備用于癌癥預(yù)后診斷的試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的肝癌分子標(biāo)志物視黃酸受體應(yīng)答蛋白2，更具體而言涉及一種具有抗癌活性的含有YFPGQFAFS序列或其變異體的多肽。本發(fā)明還涉及該多肽在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中、制備抑制Akt信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種用于癌癥預(yù)后的檢測(cè)試劑盒，通過(guò)檢測(cè)對(duì)象樣品中視黃酸受體應(yīng)答蛋白2的表達(dá)量對(duì)癌癥患者的生存期進(jìn)行評(píng)估。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102772782SQ20121013821
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者劉將, 印宏坤, 李晶晶, 謝東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院