專利名稱：蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法。
背景技術：
神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)具有廣泛的臨床應用前景，主要表現(xiàn)在促進神經(jīng)元的發(fā)育和分化，減輕病理狀態(tài)下神經(jīng)元損傷，促進神經(jīng)元修復和再生；誘導血管內皮細胞，促進血管生成；提高細胞溶酶體內各種水解酶活性，增強巨噬細胞吞噬能力，及誘導細胞凋亡等。蛇毒神經(jīng)生長因子(Venom NGF, vNGF)與人類NGF的同源性在66 % -80 %之間，對人類神經(jīng)細胞具有可靠的正向調節(jié)作用，作用機制相通，存在相似的多肽刺激和激活領域。目前，國內外已對vNGF進行了大量的基礎性研究，但有關臨床應用的研究和實踐甚少，主要受限于以下原因由于NGF促進生長和誘導細胞凋亡的雙重功效，療效尚不十分確切；vNGF原料不易獲取，純化過程繁雜；進入體內后，活性維持和作用效果不 詳。故而，迄今為止，vNGF尚未能在臨床上得到較好的應用。目前，在已知的神經(jīng)生長因子P鏈118個氨基酸序列中，以小鼠NGF的cDNA為探針，已從人的DNA文庫中克隆出人類NGF的基因編碼鼠、人類、牛、雞胚和蛇的NGF cDNA已經(jīng)被測序和克隆。因為蛇毒中NGF含量最豐富，同時蛇類NGF與人類的同源性在66 % -80 %之間，但對人類神經(jīng)細胞依然具有可靠的正向調節(jié)作用，作用機制相通，存在相似的多肽刺激和激活領域，因此備受人們關注。vNGF的代表株是一種活化的重組蛇毒神經(jīng)生長因子一sputa NGF，被證明在體內外均是無毒的，更具安全性。對比11株已登錄的vNGF的mRNA序列，我們發(fā)現(xiàn)vNGF具有高度的同源性，介于93 % -99 %，其變異點主要集中在441位點、541位點和555位點。Kostiza等根據(jù)亞基數(shù)目以及亞基之間的結合方式將蛇毒分為四類，并指出@ -亞基是NGF的活性部位。NGF生物活性的發(fā)揮是通過受體介導的，NGF受體有兩類TrKA和P75，分別以高、低親和力結合NGF。TrkA受體屬于酪氨酸激酶家族，與NGF結合后，可激活Ras、Akt等多條信息途徑，調節(jié)神經(jīng)細胞的存活、生長和分化。P75受體的效應主要是誘導細胞凋亡。本研究以sputa NGF為模板，通過基因重組構建2個組蛋白標記的融合蛋白質作為研究模型的不同多肽刺激物；通過不同長度的功能多肽片段刺激研究模型細胞一雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織和大鼠腎上腺嗜鉻細胞(pheochromocy toma cells,PC12),解析其兩個不同受體TrKA和P75的活化狀態(tài)，及細胞內信號轉導的信息表達水平和磷酸化水平，利用特異性細胞信號分子活化抑制劑阻斷細胞內特定分子的信號轉導，綜合判斷vNGF的功能區(qū)域，從而鑒定vNGF的具有活性的多肽組成和序列，為具有單一取向的蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的新藥生產提供分子生物學數(shù)據(jù)和奠定理論基礎。

發(fā)明內容
為解決現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明目的是提供一種利用基因重組技術分段篩選蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的方法。
本發(fā)明所述蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法，其包括以下步驟一、融合蛋白質的構建選擇活化的重組蛇毒神經(jīng)生長因子，以sputa NGF(vNGF)為模板，進行功能區(qū)域斷點分析，然后通過PCR引物法構建至少兩個不同長度的片段序列，并作標記。二、質粒表達系統(tǒng)的構建將上述片段序列分別組裝在pBluscriptll SK+質粒中，構建vNGF的轉移載體，并使其在DH5a中克隆，形成活性多肽質粒轉移系統(tǒng)，然后利用單一酶切點的黏性末端連接方法將具有相同黏性末端的至少兩個不同長度的基因片段和目的片段連接，分別組裝在PQE30質粒的BamHI和HindIII酶切位點之間，克隆并表達vNGF的活性多肽。三、通過6X組氨酸回收提純技術進行分離、鑒定、提純，形成vNGF活性多肽的刺激物原液。
四、驗證原核表達VNGFP片段的生物活性，進行多肽篩選。所述片段序列為2個，分別為vNGF Fl片段，對應20-388基因位點，計369bp ;vNGF F2片段，對應389-751基因位點，計363bp。所述驗證原核表達vNGF片段的生物活性的方法為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤培養(yǎng)檢測法。本發(fā)明所述蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法，其有益效果是本發(fā)明通過蛇毒神經(jīng)生長因子氨基酸和核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)其變異點主要集中在441位點、541位點和555位點。并以此為基礎確定以sputa NGF為模板進行了功能區(qū)域的斷點分析，提出以sputa NGF為模板，通過基因重組構建2個組蛋白標記的融合蛋白質作為研究模型的不同多肽刺激物的設計方案，研究蛇毒神經(jīng)生長因子多肽的活性，以進行篩選。對sputa NGF的應用基礎研究提供分子生物學支持。


附圖I為pQE30的基因序列，其中I為HindIII酶切位點，2為BamHI酶切位點，3為啟動子，4為翻譯起始點,5為終止子,6為終止序列。附圖2為vNGF的基因序列。
具體實施例方式下面將以具體實施例來詳細說明本發(fā)明，在此本發(fā)明的示意性實施例以及說明用來解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的限定。實施例I :本發(fā)明所述蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法，通過對已登錄的28個vNGF可參考序列進行分子樹原序列分析，對比11株登錄的vNGF mRNA序列,發(fā)現(xiàn)vNGF具有聞度的同源性，介于93%-99%，其變異點主要集中在441位點、541位點和555位點，對11個vNGFmRNA序列分別進行了氨基酸和核苷酸同源性分析，并以此為基礎，以vNGF為模板進行了功能區(qū)域的斷點分析，以此為基礎，篩選步驟如下一、融合蛋白質的構建提出以vNGF為模板，通過PCR引物法構建2個不同長度的片段序列，分別為所述片段序列為2個，分別為vNGF Fl片段，對應20-388基因位點，計369bp ；vNGF F2片段，對應389-751基因位點，計363bp，構建2個組蛋白標記的融合蛋白質。二、質粒表達系統(tǒng)的構建因為pBluscriptll SK+質粒和pQE30質粒是目前應用效果最好的轉移載體和多肽表達載體，將上述2個序列在pBluscriptIISK+質粒中構建vNGF的轉移載體，并在DH5a中克隆，形成活性多肽質粒轉移系統(tǒng)。然后利用單一酶切點的黏性末端連接方法將具有相同黏性末端的2個不同長度的基因片段和目的片段連接，分別組裝在PQE30質粒的BamHI和HindIII之間，鑒定插入方向，克隆并表達vNGF的活性多肽。三、通過6X組氨酸回收提純技術進行分離、鑒定、提純，形成sputaNGF活性多肽的刺激物原液。活性多肽的回收與提純在必要時通過8M尿素蛋白質復性方法獲得可溶性蛋白，并輔以肝素親和層析和雙層陽離子交換層析方法予以回收和提純。四、驗證原核表達vNGF ^片段的生物活性的方法為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 (pheochromocytoma cells,PC12)培養(yǎng)檢測法將vNGF與PCI2置于無血清培養(yǎng)液中，vNGF與PCI2細胞上的受體結合，使PC12細胞長出軸突向神經(jīng)細胞方向分化。觀察上述兩個實驗的陽性反應和陰性反應條件下效應細胞的TrKA和P75受體的表達量以及活性，確定有效多肽。分別取FI、F2片段基因重組原核表達蛋白，采用上述PC12細胞培養(yǎng)檢測法定性檢測結果Fl蛋白組細胞在培養(yǎng)10天后，細胞生長出大量神經(jīng)樣纖維，F(xiàn)2蛋白組細胞培養(yǎng)10天后，細胞多數(shù)呈球形，少量細胞有神經(jīng)樣纖維。定量檢測分別取25ng / ml的FI、F2基因重組原核表達蛋白、10%小牛血清、5%馬血清、85%1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，F(xiàn)l組細胞聚集成團并長出神經(jīng)樣纖維，F(xiàn)2組細胞聚集成團未見纖維生長。活性測定取致敏PC12細胞適量，接種于盛有活性測定培養(yǎng)液IOml (10%小牛血清、5%馬血清、85%1640培養(yǎng)基)的培養(yǎng)瓶中，分別加入適量的上述刺激物原液使培養(yǎng)液中的vNGF濃度控制在能促使活性細胞團比例為3(T70之間，或加入對照生理鹽水。同法培養(yǎng)24h后于顯微鏡下觀察，隨機計數(shù)10個視野.每個視野各10個細胞團，明顯長出突觸的記為活性細胞團?；钚詥挝欢x為實驗組活性細胞團數(shù)減去空白對照組活性細胞團數(shù)與總觀察細胞團數(shù)相比乘以100%，求得活性細胞團所占比例，Iml活性測定培養(yǎng)液中，促進產生50%活性細胞團的vNGF量為一個活性單位。經(jīng)測定，F(xiàn)l基因重組原核表達蛋白12. 67ng/ml為I個活性單位，F(xiàn)2基因重組原核表達蛋白70. 25ng/ml為I個活性單位。以上結果證明，F(xiàn)l基因重組原核表達蛋白其活性、表達量都高于F2，其為所要篩選的目的vNGF活性多肽。本發(fā)明所述蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法，其有益效果是本發(fā)明通過對蛇毒神經(jīng)生長因子氨基酸和核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)其變異點主要集中在441位點、541位點和555位點。并以此為基礎確定以sputa NGF為模板進行了功能區(qū)域的斷點分析，提出以sputa NGF為模板，通過基因重組構建2個組蛋白標記的融合蛋白質作為研究模型的不同多肽刺激物的設計方案，研究蛇毒神經(jīng)生長因子多肽的活性，以進行篩選。對sputa NGF的應用基礎研究提供分子生物學支持。以上對本發(fā)明實施例所提供的技術方案進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發(fā)明實施例的原理以及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只適用于幫助理解本發(fā)明實施例的原理；同時，對于本領域的一般技術人員，依據(jù)本發(fā)明實施例，在具體實施方 式以及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發(fā)明的限制。
權利要求
1.蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 一、融合蛋白質的構建選擇活化的重組蛇毒神經(jīng)生長因子，以vNGF為模板，進行功能區(qū)域斷點分析，然后通過PCR引物法構建至少兩個不同長度、不同組合的片段序列，并作標記； ニ、質粒表達系統(tǒng)的構建將上述片段序列分別組裝在pBluscriptll SK+質粒中，構建vNGF的轉移載體，并使其在DH5a中克隆，形成活性多肽質粒轉移系統(tǒng)，然后利用單ー酶切點的黏性末端連接方法將具有相同黏性末端的至少兩個不同長度的基因片段和目的片段連接，分別組裝在PQE30質粒的BamHI和HindIII酶切位點之間，克隆并表達vNGF的活性多肽； 三、通過6X組氨酸回收提純技術進行分離、鑒定、提純，形成vNGF活性多肽的刺激物原 液； 四、驗證原核表達vNGFP片段的生物活性，進行多肽篩選。
2.如權利要求I所述蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法，其特征在于 所述片段序列為2個，分別為vNGF Fl片段，對應20-388基因位點，計369bp ；vNGF F2片段，對應389-751基因位點，計363bp。
3.如權利要求I所述蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法，其特征在于 所述驗證原核表達vNGF片段的生物活性的方法為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤培養(yǎng)檢測法。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選方法。其包括利用sputa NGF(vNGF)為模板構建融合蛋白質；通過pBluscriptIISK+和pQE30構建質粒表達系統(tǒng)；通過6X組氨酸回收提純技術進行分離、鑒定、提純，形成vNGF活性多肽的刺激物原液；驗證原核表達vNGFβ片段的生物活性。本發(fā)明以sputa NGF為模板進行了功能區(qū)域的斷點分析，提出以sputa NGF為模板，通過基因重組構建2個組蛋白標記的融合蛋白質作為研究模型的不同多肽刺激物的設計方案，研究蛇毒神經(jīng)生長因子多肽的活性，以進行蛇毒神經(jīng)生長因子活性多肽的篩選，并對sputa NGF的應用基礎研究提供分子生物學支持。
文檔編號C12N15/63GK102816766SQ20121013854
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權日2012年5月4日
發(fā)明者徐軍, 吳鵬, 祁榮, 張忠 申請人:沈陽醫(yī)學院