專利名稱：一種泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于血紅蛋白及體外重組表達技術領域，具體涉及ー種泥蚶血紅蛋白(Tg-HbIIA)及其應用。
背景技術：
血紅蛋白(hemoglobin, Hb)是所有脊椎動物和部分無脊椎動物血液中所含有的一大類含鐵的呼吸蛋白，具有多重生物學功能，是最具有研究價值的蛋白質家族之一。 在無脊椎動物中具有血紅蛋白的比較少見，ー個有趣的現象是以泥蚶為代表的蚶科貝類的血液中存在大量的血紅蛋白，而絕大多數貝類的攜氧蛋白是血藍蛋白，如鮑類、蛤類等(Lieb, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2001，98:4546-4551)。早有研究者提出血藍蛋白比較原始，在演化過程中逐漸被血紅蛋白取代(Mangum, et al, Biol Bull, 1987，173:205-221.)。研究表明貝類血藍蛋白和脊椎動物血紅蛋白不但具有攜氧的主要功能，而且還具有抗菌、抗病毒等免疫功能(Jiang, et al, Nat Immunol. 2007, 8:1114-1122·)。研究發(fā)現泥蚶血紅蛋白在受到弧菌、LPS和PGN等致病因子刺激后，表達量會急劇上升，表明泥蚶血紅蛋白基因參與了抗菌免疫反應。隨著重組DNA技術和其他現代生物技術的發(fā)展，不斷有新的功能基因被發(fā)現、克隆和表達，人們開創(chuàng)了用基因重組技術體外生產蛋白質的新紀元。在已有的重組蛋白表達體系中，大腸桿菌原核表達系統(tǒng)因其操作方便、價格低廉、高效表達和穩(wěn)定性等優(yōu)點成為重組蛋白質的首選表達系統(tǒng)。血紅蛋白體外表達的研究僅限于人、豬等大動物，在人血紅蛋白體外表達的研究中，已經通過大腸桿菌、真菌實現了體外表達，顯示在真菌中表達量不如大腸桿菌高。關于無脊椎動物血紅蛋白的體外表達還未見報道，由于無脊椎動物與脊椎動物血紅蛋白氨基酸序列及蛋白結構方面的差異，因此，構建合適的表達載體，尋找簡便、高效的表達方法是貝類血紅蛋白表達現在面臨的問題。表達人血紅蛋白的目的是尋找天然血液的替代品，從而解決用血緊張的局面，而在貝類等水產動物的研究中，我們的目的是篩選大量表達且具有活性的抗菌血紅蛋白工程菌株，繼而生產大量高效、低毒、無污染的抗菌蛋白產品，作為飼料免疫添加劑或生產免疫蛋白制劑用于貝類育苗和健康養(yǎng)殖。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種來自于泥蚶的血紅蛋白(Tg-HbIIA)，并可將克隆的泥蚶血紅蛋白基因通過大腸桿菌體外表達，以彌補現有技術的不足。本發(fā)明提供ー種泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1 ；本發(fā)明還提供一種核苷酸，用于編碼上述的血紅蛋白(Tg-HbIIA)，所述的核苷酸的序列為SEQ ID NO 2o本發(fā)明還提供用于表達上述的血紅蛋白(Tg-HbIIA)的重組質粒。本發(fā)明的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA用于制備免疫增強劑，例如作為飼料添加劑和細菌性疾病疫苗。
本發(fā)明表達的泥蚶血紅蛋白基因HbIIA融合蛋白具有廣譜的殺菌活力，特別是對水產動物致病菌弧菌類有較強的殺菌效果，這為研制新型的具有抗微生物活性的藥物和在水產養(yǎng)殖業(yè)上作為替代抗菌素的新型病害預防治療制劑奠定了基礎。與傳統(tǒng)從天然資源提取血紅蛋白的方法相比。本發(fā)明的制備方法血紅蛋白大批量、無毒性，使低成本的規(guī)?；a成為可能，為海洋養(yǎng)殖貝類飼料添加劑和細菌性疾病疫苗的研制提供了一種新的途徑。


圖I :本發(fā)明的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA的電泳圖，
其中1泳道純化的重組Tg-HbIIA的SDS-PAGE電泳圖，2 泳道用 His 抗體鑒定 Tg-HbIIA 的 Western Blotting 結果圖。
具體實施例方式I.泥蚶血細胞RNA的提取和反轉取鮮活的泥蚶，用針管抽取泥蚶血竇中的血液，取Iml血液放入離心管中，3500轉/秒離心一分鐘，去上清，保留血細胞，用Trizol試劑抽提RNA。用紫外分光光度計檢測A280、A260的相對吸收值，同時采用電泳檢查RNA完整性。用M-MLV反轉錄酶試劑盒反轉RNA，得到cDNA第一條鏈。2.泥蚶血紅蛋白基因(Tg-Hb)含ORF的cDNA的亞克隆和驗證依據Tg-Hb基因成熟肽cDNA序列設計弓丨物HbIIA-ORF-Fl 5’ GCAAACGAGAAGAACTAAAGCAAC 3’HbIIA-ORF-Rl 5’ CCATTGATGGTTGGTCCAGATA 3’以獲得編碼該基因成熟肽的基因片段。PCR反應程序94° C變性4 min, I個循環(huán)；94° C 變性 50 S，55° C 退火 50s，72。C 延伸 I min，35 個循環(huán)；72° C 延伸 10 min,I個循環(huán)；4° C保溫。，把擴增出的片度連入pGEM-T vector (Promega, USA),并測序獲得本發(fā)明篩選到的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA的核苷酸序列SEQ ID NO :2，翻譯出的氨基酸序列為 SEQ ID NO lo3.泥蚶血紅蛋白(Tg-Hb)重組質粒構建本發(fā)明中采用的重組載體為Novagen公司的ρΕΤ原核表達系統(tǒng)載體pET_30b，也可以選用其它的原核表達載體，該載體能夠使目標序列與硫氧還蛋白(Trx-Tag)融合，通常能夠增加重組蛋白中可溶性蛋白比例。重組子構建步驟如下I)使用5’末端和3’末端分別添加了 XhoI和Hind III特定酶切位點的基因特異性引物 Tg-Hb-EF (5， CTAAGCTTATGGTTGATGCAGCAG 3，)和 Tg-Hb-ER(5，ATCTCGAGCAAGGCAGCTTGGAC 3’)擴增目的基因。2)將擴增片段純化回收，與pGEM-T載體連接，構建亞克隆。3)轉化ToplO感受態(tài)細胞后篩選陽性克隆，提取質粒。4)使用限制性內切酶酶切亞克隆質粒，對酶切產生的目的片段純化回收。5)回收目的片段與同樣雙酶切的表達載體連接，完成載體的構建。6)選取3個重組子送出測序，確認閱讀框正確和堿基序列正確。
4.載體轉化和表達I)將經過測序鑒定正確的陽性克隆轉入含有氨芐青霉素(100 yg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min, 37 ° C培養(yǎng)過夜。2)利用 EZ Spin Column Plasmid Mini-Preps 44 Kit 提取質粒，在紫外分光光度計上測定其濃度，并將質粒稀釋至10 ng/μ I。3)取I μ I稀釋后的質粒轉化200 μ I表達宿主菌BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細胞。4)將轉化產物接入10 ml LB培養(yǎng)基中(含100 μ g/ml氨芐青霉素，34 μ g/ml氯霉素)，200 r/min, 37 ° C培養(yǎng)過夜。5)第二天將培養(yǎng)物轉接入300 ml同樣的培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ° C培養(yǎng)1-3 h，中間每隔20分鐘檢測濃度一次，當0D600達到O. 5-0. 6時，加入終濃度為I mM的IPTG
繼續(xù)培養(yǎng)4 h。6)4 ° C,5000rpm,離心IOmin離心收集菌體沉淀。提取的適當菌體加入100 μ IPBS緩沖液后100 ° C沸水中煮IOmin后離心，取上清，進行15%的SDS-PAGE分離膠電泳分析，Coomassie brilliant blue R-250染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并記錄結果。剰余菌體于-20 ° C凍存?zhèn)溆谩?.重組蛋白的純化本發(fā)明采用的蛋白純化Kit為Τ0Υ0Β0公司MagExtractor His-Tag NPK-700。該純化Kit利用了組氨酸側鏈上的咪唑基與金屬離子(Ni2+)等的螯合的特性，可以使基因重組技術制備的His-Tag融合重組蛋白的純化效率大大提高。其中添加的磁珠是與鎳螯合的瓊脂磁珠，與His-Tag的選擇性結合能力非常出色，能夠從菌體破碎液中直接純化His-Tag融合蛋白。變性狀態(tài)下重組蛋白的純化步驟如下I)在洗凈吸附液中加入尿素，使尿素濃度達到8M，并用IM HCl調解pH為8. O。2)菌體加入變性吸附洗凈液后，加入5M NaCl，使終濃度達到3M。3)于冰浴中超聲波破碎。4) 12000 rpm 離心 Imin，回收上清。5)上清中加入磁珠，室溫震蕩l(T30min (強度大)。6)稍離心分離磁珠，棄去上清。7)加入變性吸附洗凈液。8)使用震蕩器攪拌IOs。9)稍離心分離磁珠。10)加入變性溶出液，室溫下使用微型試管混勻器攪拌f IOmin (強度大)。11)瞬間高速分離。12)回收上清液。6.重組蛋白的復性分離純化后的重組蛋白，依次在含有8 M、6 M、4 M、3 M、2 M、1 M和0 M尿素的50 mM Tris緩沖液(pH 8. O)中透析各4 h (4° C)，將裂解液中的鹽酸胍替換出來。利用SDS-PAGE法鑒定透析后所獲得的純化樣品的純度。7. SDS 電泳和 Western Blotting 鑒定
進行4% 20% SDS-PAGE梯度分離膠電泳分析，上樣6 μ g HbIA純化蛋白，Coomassie brilliant blue R-250染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并記錄結果重組蛋白的濃度測定。在蛋白相對分子質量約23. 6 KDa處有明顯特異性蛋白條帶，與預期大小一致，而空載體菌和未誘導菌均無此特異性表達條帶。用His抗體進行重組蛋白的Western Blotting鑒定，將SDS-PAGE分離后電轉移至硝酸纖維素膜上，將膜置于30g/L的脫脂奶粉溶液中與4° C封閉過夜。然后滴加Tg-HbIIA抗His抗體于37° C反應2h，最后用DAB顯色試劑盒顯色(圖I)。表達的目的蛋白經Western blotting驗證能被His抗體識別，檢測的His標簽融合蛋白Tg-Hb純度>75%，濃度為2. 16 mg/ml。8重組血紅蛋白抗菌活性檢測采用Bradford法對重組蛋白的含量進行測定后，再分別以副溶血弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為供試菌種，進行瓊脂孔擴散抑菌試驗。抑菌試驗 結果表明，重組Tg-HbIIA具有顯著的抗陰性性菌活性，其對供試的副溶血弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌表現出明顯的抑制作用，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌僅表現出微弱的的抑菌活性。以2齡泥蚶為實驗對象，分四組，每組放置50個健康泥蚶，在餌料中分別添加100mg/kg, 200mg/kg, 500mg/kg的本發(fā)明的血紅蛋白及不添加的對照組,投喂24小時后，用半致死濃度副溶血弧菌浸泡感染實驗，研究表明未投喂含血紅蛋白的泥蚶60小時后只有20%的純活率，而投喂含本發(fā)明血紅蛋白的各組顯示推遲死亡的現象，且血紅蛋白濃度越高，純活率越高，投喂免疫500mg/kg的感染79. O小時后，仍然有58%的存活率。由此可以看出，本發(fā)明的血紅蛋白Tg-HbIIA作為免疫增強劑對抵抗細菌感染有較好的效果。
權利要求
1.ー種泥蚶血紅蛋白Tg-HbllA，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
2.—種核苷酸,用于編碼權利要求I所述的泥紺血紅蛋白Tg-HbIIA。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其序列為SEQID NO :2。
4.ー種表達權利要求I所述的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA的重組質粒。
5.ー種免疫增強劑,包含有權利要求I所述的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA，其氨基酸序列為SEQ ID NO1，核苷酸的序列為SEQ ID NO2。本發(fā)明的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA用于制備免疫增強劑。本發(fā)明表達的泥蚶血紅蛋白基因HbIIA融合蛋白具有廣譜的殺菌活力，特別是對水產動物致病菌弧菌類有較強的殺菌效果，這為研制新型的具有抗微生物活性的藥物和在水產養(yǎng)殖業(yè)上作為替代抗菌素的新型病害預防治療制劑奠定了基礎。與傳統(tǒng)從天然資源提取血紅蛋白的方法相比。本發(fā)明的制備方法血紅蛋白大批量、無毒性，使低成本的規(guī)模化生產成為可能，為海洋養(yǎng)殖貝類飼料添加劑和細菌性疾病疫苗的研制提供了一種新的途徑。
文檔編號C12N15/12GK102643342SQ20121013873
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月6日 優(yōu)先權日2012年5月6日
發(fā)明者包永波, 林志華, 董迎輝 申請人:浙江萬里學院