專利名稱：弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶及同源物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肌醇六磷酸酶，其核苷酸序列，生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法及其用途。本發(fā)明涉及用于飼料添加劑的酶的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及肌醇六磷酸酶，其可以用來增進(jìn)食品和動(dòng)物飼料中的磷酸酯消化。
背景技術(shù)：
肌醇六磷酸是谷類和豆類中磷的主要儲(chǔ)存形式。不過，單胃動(dòng)物如豬、家禽和魚并不能夠代謝或吸收肌醇六磷酸(phytate)(或植酸(phytic acid))并且因此將其排泄出去，這引起家畜高產(chǎn)區(qū)的磷污染。另外植酸還在單胃動(dòng)物中通過螯合諸如鈣、銅和鋅的金屬制劑而充當(dāng)抗?fàn)I養(yǎng)劑。為了為這些動(dòng)物的生長和健康提供足夠的磷酸酷，向它們的膳食中添加無機(jī)磷酸酷。這種添加成本高并且進(jìn)一步增加了污染問題。肌醇六磷酸被肌醇六磷酸酶(phytase)所轉(zhuǎn)化，所述酶一般催化肌醇六磷酸水解成低級(jí)的肌醇磷酸酯和無機(jī)磷酸酷。肌醇六磷酸酶可以用作動(dòng)物飼料的添加劑，在飼料中它們提高有機(jī)磷對(duì)于動(dòng)物的可用性并且減少環(huán)境的磷酸酯污染(Wodzinski RJ1UllahAH. Adv Appl Microbiol. 42，263-302(1996))。真菌(WyssM.等 Appl. Environ. Microbiol. 65 (2)，367-373 (1999) ; BerkaR. M.等Appl. Environ. Microbiol. 64(11), 4423-4427(1998);Lassen S.等Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001))和細(xì)菌(Greiner R.等 Arch. Biochem. Biophys. 303 (I)，107-113(1993);Kerovuo 等 Appl. Environ. Microbiol. 64(6)，2079-2085(1998);Kim H. ff.等Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234(2003);Greiner R.等 Arch. Biochem. Biophys. 341(2), 201-206(1997);Yoon SJ.等 Enzyme and microbial technol. 18，449-454(1996);ZininN.V.等FEMS Microbiol. Lett. 236，283-290(2004)))來源的許多肌醇六磷酸酶已經(jīng)在文獻(xiàn)中得以描述。不過，到目前為止，這些肌醇六磷酸酶中沒有一種呈現(xiàn)有效用作動(dòng)物飼料添加物所需的特性。特別地，真菌肌醇六磷酸酶趨于對(duì)蛋白水解不穩(wěn)定(Igbasan F. A.等Arch. Anim. Nutr. 53，353-373 (2000))并且因此易于降解，而大多數(shù)細(xì)菌肌醇六磷酸酶只對(duì)于肌醇六磷酸具有狹窄的底物特異性并且難以降解中等程度磷酸化的肌醇磷酸酯(Greiner R.等，Arch. Biochem. Biophys. 303 (I)，107-113 (1993) ；Kerovuo J 等 Biochem.J. 352，623-628(2000))。因此，需要改進(jìn)的肌醇六磷酸酶
發(fā)明內(nèi)容
在寬泛的方面，本發(fā)明涉及源自細(xì)菌的肌醇六磷酸酶及其修飾形式。特別地本發(fā)明涉及源自細(xì)菌弗氏檸檬酸桿菌的野生型肌醇六磷酸酶，及其與野生型酶相比顯示改進(jìn)特性的變體/修飾形式。本發(fā)明是有益的，因?yàn)樗峁┬碌募〈剂姿崦?，其具有使它們作為飼料酶特別有用和有效的特性。特別地本發(fā)明涉及本文所述的分離的和/或純化的新肌醇六磷酸酶多肽或其功能片段或變體或修飾形式。本發(fā)明還提供編碼所述所述肌醇六磷酸酶的核酸和氨基酸序列。為了有效地作為食品或動(dòng)物飼料的酶添加剤，肌醇六磷酸酶必須組合許多不同的特性。為了能夠在動(dòng)物胃的酸性環(huán)境中降解肌醇六磷酸，它必須在低pH，優(yōu)選在廣泛的pH值范圍上有活性。此外，它必須具有高度的比活并且優(yōu)選高度熱穩(wěn)定性以便使得蛋白質(zhì)能夠承受高溫，而所述高溫通常用于飼料如飼料團(tuán)粒的制備中。所述酶具有寬泛的底物特異性也是重要的，以便使得它不僅能水解肌醇六磷酸而 且能水解肌醇六磷酸降解的中間產(chǎn)物，如肌醇五磷酸、肌醇四磷酸和肌醇三磷酸。對(duì)于豬的肌醇六磷酸降解的研究顯示這些肌醇寡磷酸酯另外還在小腸和大腸中在很大程度上保持不可溶，并且因而難以被動(dòng)物和消化道微生物群產(chǎn)生的堿性磷酸酶所接近(SchlemmerU.等Arch. Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001)) 已經(jīng)鑒定了不同酶的底物特異性譜的變化。例如，由枯草芽孢桿菌的肌醇六磷酸酶產(chǎn)生的肌醇三磷酸基本上耐受這種酶的進(jìn)ー步水解(Kerovuo J.等 Biochem J. (200)352,623-628) 在本發(fā)明的另一方面提供包含本文所述的新的肌醇六磷酸酶或其修飾形式的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)或經(jīng)轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)基因的生物體。在本發(fā)明的另ー個(gè)方面涉及轉(zhuǎn)基因生物，其已修飾來表達(dá)本文所述的新的肌醇六磷酸酶或其修飾形式并且因此能夠生產(chǎn)肌醇六磷酸酶。本發(fā)明進(jìn)一歩提供生物技術(shù)生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的手段和方法，及其作為飼料添加劑的用途。本發(fā)明的各方面在權(quán)利要求書和下面的注解中進(jìn)行介紹。為了便于參考，現(xiàn)在將本發(fā)明的這些和其它方面在合適的節(jié)段標(biāo)題之下進(jìn)行討論。不過，在每個(gè)節(jié)段之下的教導(dǎo)并不一定限于每個(gè)特定節(jié)段。本發(fā)明所用的術(shù)語〃生產(chǎn)〃、〃產(chǎn)生〃、〃生產(chǎn)的〃、〃可生產(chǎn)的〃、〃產(chǎn)品〃與各自相應(yīng)的術(shù)語“制各”、“正在制各”、“經(jīng)制備的”、“制品”、“經(jīng)生成的”、“生成”和“可制備的”同義。本發(fā)明所用的術(shù)語〃表達(dá)(expression) 〃，〃表達(dá)(expresses) 〃，〃經(jīng)表達(dá)的〃和”可表達(dá)的〃與各自相應(yīng)的術(shù)語〃轉(zhuǎn)錄(transcription) 〃，〃轉(zhuǎn)錄(transcribes) 〃，〃經(jīng)轉(zhuǎn)錄的〃和〃可轉(zhuǎn)錄的〃同義。本發(fā)明所用的術(shù)語〃轉(zhuǎn)化〃和〃轉(zhuǎn)染〃指將核酸序列導(dǎo)入宿主、宿主細(xì)胞、組織或器官中的方法。涉及可以用于本發(fā)明中的核苷酸序列的其它方面包括包含本發(fā)明序列的構(gòu)建體；包含用于本發(fā)明的序列的載體；包含用于本發(fā)明的序列的質(zhì)粒；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化組織；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化器官；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化宿主；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化生物。本發(fā)明還包括利用其來表達(dá)用于本發(fā)明的核苷酸序列的方法，如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括其轉(zhuǎn)移方法。本發(fā)明進(jìn)ー步涉及分離所述核苷酸序列的方法，如由宿主細(xì)胞中分離。涉及用于本發(fā)明中的氨基酸序列的其它方面包括編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的構(gòu)建體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的載體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的質(zhì)粒；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化組織；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化器官；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化宿主；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還包括利用其純化用于本發(fā)明的氨基酸序列的方法，如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括其轉(zhuǎn)移方法，隨后純化所述序列。


圖I :顯示來自弗氏檸檬酸桿菌P3-42的重組肌醇六磷酸酶的SDSPAGE分析，所述重組肌醇六磷酸酶通過DEAE-瓊脂糖層析法進(jìn)行純化。該圖給出了包含弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶樣品的泳道的數(shù)碼照相圖像的掃描圖形。 圖2 :顯示來自弗氏檸檬酸桿菌P3-42的肌醇六磷酸酶的pH譜。圖3 :顯示來自弗氏檸檬酸桿菌P3-42的純化重組肌醇六磷酸酶的底物特異性，以具有不同程度磷酸化作用的肌醇磷酸酯級(jí)分和模式底物作為底物。縮寫IP6—肌醇六磷酸；1P5，IP4和IP3 -分別指同分異構(gòu)肌醇五_，四-和三磷酸的混合物。Fru P2—果糖
I,6- ニ磷酸，F(xiàn)ru Pl一果糖6-磷酸。SEQ ID NO: I列出了為了鑒定細(xì)菌菌株而獲得的序列。SEQ ID NO: 2列出了包含來自弗氏檸檬酸桿菌P3-42的肌醇六磷酸酶的序列。SEQ ID NO: 3列出了弗氏檸檬酸桿菌P3-42肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列。發(fā)明詳細(xì)內(nèi)容本發(fā)明表征了ー種酶，其包含對(duì)應(yīng)于弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶或其修飾形式、變體、功能等同物或有效片段的氨基酸序列。 術(shù)語"肌醇六磷酸酶"意指能夠催化磷酸酯包括肌醇六磷酸的水解并釋放無機(jī)磷酸酯的蛋白質(zhì)或多肽。除了肌醇六磷酸之外，肌醇六磷酸酶至少能夠水解某些中間程度磷酸化的肌醇磷酸酷。術(shù)語"對(duì)應(yīng)于弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶"意指不需獲自弗氏檸檬酸桿菌的酶。相反，該酶必須具有與弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶基本上相同的功能特性或序列。術(shù)語〃其功能等同物”意指該酶必須具有與野生型弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶基本上相同的功能特性。術(shù)語"修飾形式"或"變體"意指該酶由其原始形式修飾而來，但基本上保留了與野生型弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶基本上相同的酶學(xué)功能特性。特別地，術(shù)語〃變體〃或〃修飾形式〃包含這樣的肌醇六磷酸酶，其具有源自親本/野生型肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入、和/或缺失，總稱為突變。修飾形式或變體與親本酶相比可以改變酶特性。優(yōu)選地，修飾形式或變體具有提高的熱穩(wěn)定性、提高的胃蛋白酶穩(wěn)定性、提高的比活、更寬泛的底物特異性、或其它對(duì)于酶的應(yīng)用有利的修飾。術(shù)語"功能性"或"有效"片段意指基本上保留相同酶學(xué)功能或作用的弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶的片段或部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的這方面的酶具有與弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶的序列相同的序列或至少75%同一(同源)的序列。
適當(dāng)?shù)兀撁赴鏢EQ ID NO: 3所示的氨基酸序列或與其具有至少75%同一性(同源性)的序列或其功能片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離和/或純化的多肽，其具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或與其具有至少75%同一性(同源性)的序列或其有效片段。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述肌醇六磷酸酶的特性在于它源自以編號(hào)NCIMB 41247保藏的弗氏檸檬酸桿菌菌株P(guān)3-42。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的任何實(shí)施方案的肌醇六磷酸酶，其包含下列位置(根據(jù)SEQ ID No. 3中的編號(hào)方法進(jìn)行編號(hào))上的一個(gè)或多個(gè)突變22，23，24，28，46，53，57，67，74，75，77，78，79，82，88，95，96，97，98，101，102，103，105，109，112，122，126，136，140，142，143，148，151，152，154，156，160，161，164，168，170，I76，177，195，199，203，204, 205，206，207，215，224, 225，229，233，235，274, 279，288，301，307，308，322，343，358，360, 362，365，366，367，370, 383，384，385，386，391，393，395，397，408和 414。這些位置的特性在于該酶在這些位置上的誘變帶來所需酶特性的改進(jìn)。優(yōu)選的突變包括A22T,E23K, E23Q, E24D, M28L, K46E, K46R, D53K, D53N, D57Y, G67R, G74R, E75K, E75V, V77I,S78T, E79V, Q82H, Q82K, Q82R, F88Y, N95D, N95P, N96P,N96S,N96Y, Q97T,T98G, T98P, S101F, P102L, G103E,V105I, A109T, Dl12V, D112Y, F122Y,L126I, Y136N, E140V, K142R, T143I,T143P, N148D, K151G, M152K, M152V, T154I, S156T,L160F, K161N, N164D,E168D, A170T, L176Q,L176V, Y177F, S195T,T199I, T203I, T203L,T203S, T203W, E204A, E204G, E204H, E204I, E204N, E204R, E204V, K205P, K205R, S206R, S206T, T207A, T207S, L215F, D224H, N225D, N225E, P229S, S233C, S235A, Q274H, Q274L, Q279E, R288M, L301S, E307Y, N308D, N308T, A322V, G343A, K358R, K360N, T362A, T362I, N365D, T366S, D367N, Q370H, D383V,I384F, I384L, I384M, Q385R, P386Q, K391N, A393P，K395T, D397N, S408I 和L414I或在每個(gè)位置上的保守性突變。"保守性突變"意指對(duì)于與所示氨基酸殘基相比在氨基酸特性上保守的氨基酸殘基進(jìn)行的突變。氨基酸特性包括殘基大小、疏水性、極性、電荷、PK-值以及本領(lǐng)域已知的和在下面更加詳細(xì)描述的其它氨基酸特性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)下列位置上突變
23，46，53，75，82，88，95，96，98，112，143，152，176，177，199，203，204，205，225，229，233，274，288，307，308，362，370，384 和 385。在這些具體位置上的優(yōu)選突變包括E23K, E23Q, K46E, K46R, D53K, D53N, E75K, E75V, Q82H, Q82K, Q82R, F88Y,N95D,N95P, N96P, N96S,N96Y, T98G, D112V, D112Y, T143I,T143P, M152K, M152V,L176Q, L176V, Y I 77F, T I 99 I，T2O 3 I，T2O 3L, T2O 3S，T2O 3W，E204A,E204G,E204H, E204I, E204N, E204R, E204V, K205P, K205R, N225D, N225E, P229S, S233C, Q274H, Q274L，R288M, E307Y, N308D, N308T, T362A, T362I, Q370H, I384F, I384L, I384M 和 Q385R 或每個(gè)位置上的保守性突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含選自下組的ー個(gè)突變的肌醇六磷酸酶P229S;D112V ；Q82R;Q274H;D112Y ；F88Y;K46E;S233C;R288M;I384L;Q385R;Q274L;E307Y ；T199I;Q82K 和 Τ203Ι。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了包含選自下組的突變組合的肌醇六磷酸酶K46E/Q82H;Q82K/V105I;N148D/T362I;K46E/L414I;F88Y/Y136N;T154I/P386Q;N95P/N96S;N95P/N96P;Q97T/T98G;D224H/N225E;Y177F/T199I;Q274L/Q370H;K46E/N96Y ；N148D/L301S;E24D/R288M;E140V/A322V ；K46E/S195T;E75K/N365D;T98P/S235A;L160F/L215F;Q274L/K395T;G67R/Q279E/N308T;K161N/P229S/R288M;D53N/D57Y/M152V ；F122Y/S156T/P229S;T199I/S206R/T207S;E23K/K46E/Q82H;K46E/Q82H/Q385R;T203W/E204N/K205R;T203W/E204H/K205R;T203W/E204R/K205R;T203ff/E204A/K205R;A22T/K151G/N308D;E23K/E75K/F88Y ；M152K/N225D/L301S;S78T/Q274L/S408I;L176Q/T199I/T366S;K46E/V77I/T203S;K46R/T199I/D367N;G74R/E204G/R288M;A22T/T199I/S206T/T207A ;Q82R/F88Y/L126I/I384L;K46E/Q82H/E168D/Q274L;Q82K/T154I/Q279E/N308T;Q82R/D112V/Q274H/T362A;E24D/E79V/N95D/K360N;E23K/M28L/A109T/T143P/I384L;D53N/D57Y/T199I/P229S/R288M;K46E/ Q82H/N148D/T154I/T362I;D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R;D53N/D57Y/T154I/P229S/R288M;Y136N/T199I/T203L/E204I/K205P;E23Q/S101F/Q274L/I384M/K391N;K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D383V ； D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P;D53K/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/F88Y/M152V/P229S/Q279E/N308T;D53N/D57Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P;K46E/D53N/D57Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A393P;Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P;Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I384L/P386Q/A393P;H18Q/D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P;Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I384F/A393P/D397N;D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D/N164D/Q274H/T362I/I384L/A393P;D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N95P/P102L/V105I/Y136N/N148D/Y177F/Q274H/Q279E/T362I/A393P，和;D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/Q274L/G343A/T362I/I384L/A393P。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了包含選自下列突變組合的肌醇六磷酸酶D57Y/F88Y/N95P/Q97T/N148D/M152V/T154I/Y177F/Q274H/I384L;D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/Q97T/M152V/Y177F/Q274H/Q279E/T362I/I384L;D53N/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/N148D/T154I/Q274H/T362I/I384L/P386Q;Q82R/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y136N/N148D/T154I/Y177F/P386Q/A393P;D53N/Q82K/F88Y/N95P/N96P/T98G/Y136N/N148D/T154I/I384L/P386Q/A393P;
D57Y/Q82KF88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/N148D/T154I/Y177F/Q274H/I384L/P386Q/A393P;D53N/Q82K/F88Y/N95P/Q97T/T98G/D 112V/Y 136N/N 148D/T154I/Q274H/Q279E/I384L/P386Q/A393P 和D53N/D57Y/Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/T98G/V105I/Y136N/N148D/M152V/Y177F/I384L/P386Q。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選肌醇六磷酸酶是由SEQ ID NO:3所列氨基酸序列組成的變體，并且具有ー種或多種上面列出的氨基酸突變，或上面列出的突變組合中的ー種。在這些實(shí)施方案中，命名法指示一種肌醇六磷酸酶，其包含SEQ ID NO:3中所示氨 基酸序列，具有參照SEQ ID NO:3中氨基酸位置所指示的突變。下面對(duì)該命名法作更加詳細(xì)描述。關(guān)于下列任ー種特性，這些變體適當(dāng)?shù)仫@示改善的特性溫度穩(wěn)定性，pH范圍，胃蛋白酶穩(wěn)定性，比活，底物特異性。本文公開了測(cè)定這些特性的合適方法。特別地，肌醇六磷酸酶特性的改進(jìn)針對(duì)食品和飼料加工條件下的酶穩(wěn)定性，胃部通行過程中的酶穩(wěn)定性，和人或動(dòng)物胃和/或腸道中的酶活性和穩(wěn)定性，使得改進(jìn)的變體特別適于用作飼料添加剤。因而，這些改進(jìn)除其他參數(shù)外還包括在升高溫度下提高穩(wěn)定性，優(yōu)選在65°C以上的溫度下，提高針對(duì)蛋白水解消化的穩(wěn)定性，優(yōu)選消化道的蛋白酶，提高低PH下的催化活性，優(yōu)選pH5. 5以下的催化活性，和從肌醇六磷酸上釋放磷酸酯基團(tuán)的一般效率等參數(shù)。適當(dāng)?shù)兀谝粋€(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶或功能等同物的特征在于所述肌醇六磷酸酶具有1000U/mg或更高的比活，其中所述比活通過將所述肌醇六磷酸酶在包含2mM肌醇六磷酸，O. 8mM CaCl2的200mM醋酸鈉緩沖液的溶液pH 3. 5中溫育而進(jìn)行測(cè)定。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶或其功能等同物的特征還可以適當(dāng)?shù)貫樗黾〈剂姿崦冈赑H 3和pH 4-4. 5附近具有兩個(gè)活性最大值，其中所述活性通過將所述肌醇六磷酸酶在包含2mM肌醇六磷酸，O. 8mM CaCl2的200mM醋酸鈉緩沖液的溶液中溫育而進(jìn)行測(cè)定。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中提供了制備肌醇六磷酸酶變體的方法，所述方法包括a)選擇親本肌醇六磷酸酶，其中親本肌醇六磷酸酶選自i.與SEQ ID No 3具有至少75%同源性的親本肌醇六磷酸酶ii.源自朽1檬酸桿菌屬(Citrobacter spp.)的親本肌醇六磷酸酶b)在親本肌醇六磷酸酶中制造至少ー種變化，所述變化為氨基酸殘基插入、缺失或取代，以獲得肌醇六磷酸酶變體c)篩選肌醇六磷酸酶變體，它與親本肌醇六磷酸酶相比具有i.較高的熱穩(wěn)定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備肌醇六磷酸酶變體。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中提供一種制備肌醇六磷酸酶變體的方法，所述方法包括:a)將編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列進(jìn)行誘變，其中所述親本肌醇六磷酸酶選自i.與SEQ ID No 3具有至少75%同源性的親本肌醇六磷酸酶ii.源自檸檬酸桿菌屬的親本肌醇六磷酸酶b)將步驟㈧中獲得的突變DNA序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，和c)篩選表達(dá)肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，所述肌醇六磷酸酶變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有iv.更高的熱穩(wěn)定性和/或V.更高的比活*和/或·vi.更高的蛋白水解穩(wěn)定性和/或制備由宿主細(xì)胞表達(dá)的肌醇六磷酸酶變體。在以上本發(fā)明的涉及制備肌醇六磷酸酶變體的實(shí)施方案中，優(yōu)選篩選肌醇六磷酸酶變體的更高的熱穩(wěn)定性。在以上本發(fā)明的涉及制備肌醇六磷酸酶變體的實(shí)施方案中，優(yōu)選篩選肌醇六磷酸酶變體的更聞的熱穩(wěn)定性和更聞的蛋白水解穩(wěn)定性。在以上本發(fā)明的涉及制備肌醇六磷酸酶變體的實(shí)施方案中，優(yōu)選篩選肌醇六磷酸酶變體的更聞的熱穩(wěn)定性和更聞的蛋白水解穩(wěn)定性和更聞的比活。所述親本肌醇六磷酸酶優(yōu)選源自弗氏檸檬酸桿菌，更加優(yōu)選弗氏檸檬酸桿菌P3-42。在制備肌醇六磷酸酶變體的方法中，所述方法包括將編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列進(jìn)行誘變，優(yōu)選將編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，更加優(yōu)選易錯(cuò)PCR (error prone PCR),還要更加優(yōu)選錯(cuò)誤閾值 PCR (error threshold PCR)。優(yōu)選的編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列的誘變方法是易錯(cuò)PCR，更加優(yōu)選錯(cuò)誤閾值PCR，其它突變方法可以取代易錯(cuò)PCR/錯(cuò)誤閾值PCR使用，或結(jié)合易錯(cuò)PCR/錯(cuò)誤閾值PCR使用。參見實(shí)施例12，其提供了合適的易錯(cuò)PCR和錯(cuò)誤閾值PCR方法的參照。其他方法披露于當(dāng)用在涉及肌醇六磷酸酶變體制備方法的實(shí)施方案的語境中時(shí)，術(shù)語‘在宿主細(xì)胞中表達(dá)’優(yōu)選定義為在本文定義的活體生物、器官或細(xì)胞中生產(chǎn)肌醇六磷酸酶變體。不過，考慮到為了選擇的目的，肌醇六磷酸酶變體也可以通過體外方法進(jìn)行生產(chǎn)，所述方法利用分離自ー個(gè)或多個(gè)活體生物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制。本發(fā)明的變體肌醇六磷酸酶的這種體外生產(chǎn)也可以用于選擇優(yōu)選的變體肌醇六磷酸酶。體外表達(dá)可以適當(dāng)?shù)乩脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。關(guān)于參考文件請(qǐng)參見Promega公司的‘In vitro Expression Guide’(部分號(hào) BR053)。變體表型的定義優(yōu)選利用實(shí)施例12中所公開的方法來測(cè)定具有更高熱穩(wěn)定性(熱穩(wěn)定性差異)的變體。通過制備肌醇六磷酸酶變體的方法制備的變體肌醇六磷酸酶優(yōu)選具有至少I. 5的熱穩(wěn)定性差異，更加優(yōu)選2，2. 5，3，3. 5，4，5，6，7，8，9，最優(yōu)選地至少10。
優(yōu)選通過實(shí)施例12中所公開的方法來測(cè)定具有更高蛋白水解穩(wěn)定性的變體。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體優(yōu)選具有至少至少45%，優(yōu)選50%，55%，更加優(yōu)選至少60%的蛋白水解穩(wěn)定性。其它變體實(shí)施方案在其它實(shí)施方案中本發(fā)明提供制備包含肌醇六磷酸酶變體的動(dòng)物飼料的方法。a)選擇親本肌醇六磷酸酶，其中所述親本肌醇六磷酸酶選自i.與SEQ ID No 3具有至少75%同源性的親本肌醇六磷酸酶ii.源自檸檬酸桿菌屬的親本肌醇六磷酸酶
b)在親本肌醇六磷酸酶中制造至少ー種變化，所述變化為氨基酸殘基插入、缺失或取代，以獲得肌醇六磷酸酶變體c)篩選肌醇六磷酸酶變體，它與親本肌醇六磷酸酶相比具有i.較高的熱穩(wěn)定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備肌醇六磷酸酶變體e)向動(dòng)物飼料中添加制備的肌醇六磷酸酶變體。在其它實(shí)施方案中本發(fā)明提供制備包含肌醇六磷酸酶變體的動(dòng)物飼料的方法。a)將編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列進(jìn)行誘變，其中所述親本肌醇六磷酸酶選自iii.與SEQ ID No 3具有至少75%同源性的親本肌醇六磷酸酶iv.源自檸檬酸桿菌屬的親本肌醇六磷酸酶b)將步驟(A)中獲得的突變DNA序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，和c)篩選表達(dá)肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，所述變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有vii.更高的熱穩(wěn)定性和/或viii.更高的比活*和/或ix.更高的蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的肌醇六磷酸酶變體f)向動(dòng)物飼料中添加制備的肌醇六磷酸酶變體。制備肌醇六磷酸酶變體的方法的優(yōu)選方面還應(yīng)用到制備包含肌醇六磷酸酶變體的動(dòng)物飼料的以上方法中。在另一方面，本發(fā)明提供分離和/或純化的編碼包含對(duì)應(yīng)于弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列的酶或其同源物的核酸分子或核苷酸序列。適當(dāng)?shù)厮龇蛛x和/或純化的核酸分子編碼包含如SEQ ID NO:3所示氨基酸或與其具有至少75%同一性(同源性)的序列或其有效片段的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含SEQ ID N0:3并在本文所列出的優(yōu)選位置上包括突變或包括本文所列出的任意特定突變或突變組合的多肽。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離和/或純化的核酸分子，其包含與SEQ ID NO:2相同，或互補(bǔ)，或含有對(duì)SEQ ID NO: 2的任意密碼子的合適的密碼子取代，或包含與SEQ IDN0:2具有至少75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%序列同源性的序列的核苷酸序列。在又一方面，本發(fā)明涉及如下所示的核苷酸序列和核苷酸序列的用途(a)如SEQ ID NO:2所給出的核苷酸序列，(b)如SEQ ID N0:2所給出的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段的核苷酸序列；(c)如SEQ ID N0:2所給出的核苷酸序列的補(bǔ)體(complement)的核苷酸序列；(d)如SEQ ID N0:2所給出的核苷酸序列的變體、 同源物、衍生物或片段的補(bǔ)體的核苷酸序列；(e)能夠與SEQ ID NO:2所給出的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(f)能夠與SEQ ID N0:2所給出的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段雜交的核苷酸序列；(g)能夠與SEQ ID NO:2所給出的核苷酸序列雜交的核苷酸序列的補(bǔ)體的核苷酸序列；(h)能夠與SEQ ID NO: 2所給出的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段雜交的核苷酸序列的補(bǔ)體的核苷酸序列；(i)能夠與SEQ ID NO:2所給出的核苷酸序列的補(bǔ)體雜交的核苷酸序列；(j)能夠與SEQ ID N0:2所給出的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段的補(bǔ)體雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的核苷酸序列可以包含編碼SEQ ID No. 3或其變體，修飾形式，同源物或衍生物的序列。特別地，本發(fā)明提供包含如本文所述的肌醇六磷酸酶或其同源物或衍生物的質(zhì)粒或載體系統(tǒng)。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒或載體系統(tǒng)包含如SEQ ID NO:2所給出的核苷酸序列或與其至少75%同源的序列或其有效片段。適當(dāng)?shù)厮鲑|(zhì)粒或載體系統(tǒng)是ー種表達(dá)載體，用于在微生物中表達(dá)任ー種由SEQ ID NO: 2或與其至少75%同源(同一)的序列所給出的核酸序列編碼的酶。此外，本發(fā)明提供質(zhì)粒或載體系統(tǒng)，來表達(dá)本文所述的任一種改進(jìn)的酶或變體。本文介紹了合適的表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面提供了用編碼本文所述的肌醇六磷酸酶的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明這方面的宿主細(xì)胞包含肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶含有SEQ ID No 3的氨基酸序列，或其功能片段，或與其至少75%同源的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生肌醇六磷酸酶。在本發(fā)明的另一方面提供了用編碼根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。肌醇六磷酸酶是如本文所述的弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶或其同源物或衍生物。適當(dāng)?shù)兀黾〈剂姿崦赴琒EQ ID No :3給出的氨基酸序列，或其功能片段，或與其至少75%同源(同一)的序列。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生肌醇六磷酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明中的核苷酸序列可獲自(盡管它實(shí)際上不一定要獲自)弗氏檸檬酸桿菌，盡管將認(rèn)識(shí)到分離和/或純化自等同菌株的酶可以等同地使用。適當(dāng)?shù)厮鏊拗骷?xì)胞源自微生物包括細(xì)菌和真菌，包括酵母。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)菌細(xì)胞。合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括來自不同原核分類組的細(xì)菌，所述分類組包括變形菌門(proteobacteria),包括a，にy，A和e細(xì)部的成員，革蘭氏陽性細(xì)菌如放線菌綱(Actinomycetes),硬壁菌門(Firmicutes)、梭菌屬(Clostridium)和近緣生物，黃桿菌屬(flavobacteria)、藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、綠色硫細(xì)菌(greensulfurbacteria)、綠色無硫細(xì)菌(green non-sulfurbacteria)和 archaea。特別優(yōu)選的是腸桿菌科(Enterobacteriaceae),如大腸桿菌,屬于、細(xì)部和低GC革蘭氏陽性細(xì)菌如桿菌屬(Bacillus)的變形菌門。合適的真菌宿主細(xì)胞包括酵母，所述酵母選自下組子囊菌門(Ascomycota)，包括酵母綱(Saccharomycetes),如畢赤酵母屬(Pichia)、漢森酵母屬(Hansenula)、和酵母屬(saccharmyces),裂通酵母綱(Schizosaccharmycetes),如粟酒裂通酵母(Schizosacchromyces pombe),和變形子囊菌門(anamorphic Ascomycota),包括曲霉屬(Aspergillusノ。其它合適的真核宿主細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞，如SF9，SF21, Trychplusiani和M121細(xì)胞。例如，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以有益地在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)。除了在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞 中表達(dá)之外，肌醇六磷酸酶基因還可以在完整的昆蟲生物體中表達(dá)。病毒載體如桿狀病毒可以感染完整的昆蟲。大型昆蟲，如蠶蛾，提供高產(chǎn)量的異源蛋白?？梢愿鶕?jù)常規(guī)提取技術(shù)將蛋白質(zhì)從昆蟲中提取出來。適用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括所有能夠在昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)外源蛋白的載體。其它宿主細(xì)胞包括選自下組的植物細(xì)胞原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚、胚珠、合子等。本發(fā)明還提供已經(jīng)轉(zhuǎn)化并包含本發(fā)明的重組DNA的完整植物。術(shù)語〃植物〃 一般包括真核藻類、有胚植物，所述有胚植物包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)和種子植物門(Spermatophyta),所述種子植物門諸如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是微生物。優(yōu)選的微生物包括原核細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選地大腸桿菌(E. coli)、枯草芽孢桿菌(B. Subtilis)和桿菌屬的其它物種，酵母，優(yōu)選多形漢森氏酵母(Hansenula Polymorpha)和粟酒裂通酵母。在本發(fā)明的另一方面提供了細(xì)菌細(xì)胞菌株弗氏檸檬酸桿菌P3-42，由DaniscoGlobal Innovation, Sokeritehtaantie 20，F(xiàn)IN_02460Kantvik, Finland 保藏，保藏號(hào)NCIMB 41247?？梢詫⑦@種細(xì)胞直接摻入飼料中。在另一方面，提供了一種生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法，包括用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在肌醇六磷酸酶的表達(dá)條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中提取所述肌醇六磷酸酶。適當(dāng)?shù)厮龇椒ㄊ巧a(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)如SEQ IDNO:3所給出的氨基酸序列或與其具有至少75%同源性的序列或其有效片段，以及從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中提取分泌的蛋白。本發(fā)明的另ー方面提供ー種包含根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的飼料組合物。優(yōu)選地，所述飼料組合物包含濃度為10-10000U/kg飼料的肌醇六磷酸酶，優(yōu)選200-2000U/kg飼料，更加優(yōu)選500-1000U/kg飼料。在一個(gè)實(shí)施方案中，飼料組合物包含根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。在另一方面提供根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在食品或動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
優(yōu)選的方面在隨附的權(quán)利要求書和后面的介紹以及實(shí)施例部分中給出優(yōu)選的方面。其它優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明是有益的，因?yàn)樗峁┝司哂性S多特性的肌醇六磷酸酶，這些特性使得它們作為動(dòng)物飼料的添加劑特別有用。特別地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在低pH下具有活性，優(yōu)選pH 2-5. 5的范圍，活性最大值在pH 3和4. 5左右。適當(dāng)?shù)乇景l(fā)明的肌醇六磷酸酶在胃環(huán)境的低pH下具有活性。另外，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在天然宿主和在異源表達(dá)期間都可以有效地分泌，由此帶來更加有效的生產(chǎn)和分離用于添加到飼料中。
而且，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有寬泛的底物特異性，包括五_，四-，三-和ニ磷酸酯底物，由此增加了可用于動(dòng)物的總的磷酸酷。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶還具有1000U/mg+/-大約10%的高度比活。本發(fā)明的產(chǎn)品可以用作食品和飼料的添加剤/補(bǔ)充物。該產(chǎn)品還可以用于各種肌醇磷酸酯的商業(yè)生產(chǎn)。肌醇六磷酸/植酸/肌醇六磷酸酶植酸(肌肌醇六磷酸(myo-inositol hexakisphosphate))是谷類、豆類、油籽作物中的重要組分。鹽的形式,肌醇六磷酸,是磷在這些植物中的主要儲(chǔ)存形式。肌醇六磷酸酶催化植酸的磷酸單酯水解，這導(dǎo)致逐步形成肌肌醇五-，四-，三-，ニ -和單磷酸酷，以及無機(jī)磷酸酯的釋放。本文所用的術(shù)語〃野生型肌醇六磷酸酶〃或〃野生型〃指具有天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶。術(shù)語〃肌醇六磷酸酶變體〃或〃變體〃或〃修飾形式〃指具有源自親本肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，其具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入，和/或缺失，它們總稱為〃突變"。術(shù)語〃親本肌醇六磷酸酶〃或〃親本酶〃指由其衍生出肌醇六磷酸酶變體的肌醇六磷酸酶。親本肌醇六磷酸酶可以是野生型肌醇六磷酸酶或另ー種肌醇六磷酸酶變體。特別地，在本發(fā)明中，"親本肌醇六磷酸酶〃可以源自弗氏檸檬酸桿菌。適當(dāng)?shù)兀ㄓH本肌醇六磷酸酶"源自如本文所述的弗氏檸檬酸桿菌菌株P(guān)3-42，其優(yōu)選具有SEQ ID NO: 3中給出的氨基酸序列。分離的一方面，優(yōu)選核苷酸或氨基酸序列為分離的形式。術(shù)語〃分離的〃意指該序列至少基本上不含至少ー種其它組分，而這種組分是與該序列天然相關(guān)聯(lián)的，如天然所發(fā)現(xiàn)的那樣。純化的一方面，優(yōu)選核苷酸或氨基酸序列為純化的形式。術(shù)語〃純化的〃意指該序列處于相對(duì)純的狀態(tài)例如至少大約90%純，或至少大約95%純或至少大約98%純。核苷酸序列本發(fā)明的范圍包括編碼如本文所定義的特定特性的酶的核苷酸序列。本文所用的術(shù)語"核苷酸序列"指寡核苷酸序列，核酸或多核苷酸序列，及其變體，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因組或合成或重組起源的，其可以是雙鏈或單鏈的，不管代表有義鏈還是反義鏈。涉及本發(fā)明的術(shù)語〃核苷酸序列〃或〃核酸分子〃包括基因組DNA，cDNA,合成DNA和RNA。優(yōu)選地它意指DNA，更加優(yōu)選編碼本發(fā)明的cDNA序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)涉及和當(dāng)被本發(fā)明的自身范圍所包括時(shí)，核苷酸序列并不包括處于天然環(huán)境之中、并與其天然相關(guān)聯(lián)的ー個(gè)或多個(gè)序列相連的根據(jù)本發(fā)明的天然核苷酸序列，而所述天然相關(guān)聯(lián)的序列也處于其天然環(huán)境之中。為了方便參考，我們將把這種優(yōu)選的實(shí)施方案稱為“非天然核苷酸序列”。在這點(diǎn)上，術(shù)語"天然核苷酸序列"意指處于其天然環(huán)境之中的完整核苷酸序列，以及當(dāng)它與天然相關(guān)聯(lián)的完整啟動(dòng)子可操作性連接之時(shí)，所述啟動(dòng)子也處于天然環(huán)境之中。不過，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列可以是其天然生物中表達(dá)后分離和/或純化的核苷酸序列產(chǎn)物。不過，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列優(yōu)選可以在其天然生物中由核苷酸序列所表達(dá)，但是其中所述核苷酸序列并不在該生物中與所述核苷酸序列天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子的控制之下。 核苷酸序列的制備一般，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列或用于本發(fā)明的核苷酸序列是利用重組DNA技術(shù)制備的(S卩，重組DNA)。不過，在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，可以利用本領(lǐng)域公知的化學(xué)方法全部或部分地合成核苷酸序列(參見Caruthers MH(1980) Nuc Acids Res SympSer 215-23 和 Horn T等，(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。由產(chǎn)生所述酶的任何細(xì)胞或生物可以鑒定和/或分離和/或純化出編碼具有如本文所定義的特定特性的酶或適于修飾的酶的核苷酸序列。本領(lǐng)域已知多種方法來鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列。例如，一旦已經(jīng)鑒定和/或分離和/或純化了合適的序列，就可以使用制備更多序列的PCR擴(kuò)增技木。例如，利用來自產(chǎn)生所述酶的生物的染色體DNA或信使RNA可以構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果已知該酶的氨基酸序列或該酶的部分氨基酸序列，可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并用來由基因組文庫鑒定編碼酶的克隆，所述文庫由所述生物制備?；蛘?，可以利用包含與另ー種已知酶基因同源的序列的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針來鑒定編碼酶的克隆。在后一種情況中，利用低嚴(yán)格度的雜交和洗滌條件。或者，可以通過將基因組DNA片段插入表達(dá)載體，如質(zhì)粒中，用得到的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌，隨后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪平板到包含該酶底物(例如對(duì)于產(chǎn)葡萄糖苷酶(麥芽糖酶)的酶，底物為麥芽糖)的瓊脂板上，由此得以鑒定表達(dá)該酶的克隆，來鑒定編碼酶的克隆。在又一個(gè)備選方案中，可以通過已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成性制備編碼酶的核苷酸序列，例如由 Beucage S. L.等，(1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869 所述的氨基憐酸酯(phosphoroamidite)方法,或由Matthes 等，(1984)EMBO J. 3, p 801-805所述的方法。在氨基磷酸酯方法中，在自動(dòng)DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火并克隆在合適的載體中。核苷酸序列可以是混合的基因組和合成起源的，混合的合成和cDNA起源的，或混合的基因組和cDNA起源的，通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成的、基因組的或cDNA起源(根據(jù)需要)的片段而制備。每ー個(gè)連接的片段都對(duì)應(yīng)于完整核苷酸序列的各部分。還可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)利用特定引物來制備DNA序列，例如在US 4，683，202或在Saiki R K等，(Science (1988) 239，pp 487-491)中所述的。由于遺傳密碼的簡并性，可以輕易地生產(chǎn)核苷酸序列，其中對(duì)于ー些或所有由原始核苷酸序列編碼的氨基酸改變了三聯(lián)體密碼子用法，由此產(chǎn)生與原始核苷酸具有低同源性的核苷酸序列，但是它編碼與原始核苷酸序列所編碼的相同、或變體氨基酸序列。例如，對(duì)于大多數(shù)氨基酸來說，遺傳密碼的簡并性是在三聯(lián)體密碼子中的第三個(gè)位置上(擺動(dòng)位置)(參考文獻(xiàn)見 Stryer, Lubert, Biochemistry, Third Edition, Freeman Press, ISBN0-7167-1920-7)，因此，所有三聯(lián)體密碼子都在第三位置上發(fā)生“擺動(dòng)”的核苷酸序列與原始核苷酸序列將具有大約66%的同一性，然而，改變的核苷酸序列將與原始核苷酸序列編碼相同或變異的一級(jí)氨基酸序列。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列對(duì)于編碼氨基酸的至少ー個(gè)三聯(lián)體密碼子改變了三聯(lián)體密碼子用法，但是它與原始核苷酸序列編碼的多肽序列 具有相同、或變體多肽序列。另外，具體的生物一般對(duì)于用來編碼氨基酸的三聯(lián)體密碼子有所偏好。優(yōu)選的密碼子用法表是隨處可得的，并且可以用來制備密碼子優(yōu)化基因。常規(guī)使用這些密碼子優(yōu)化技術(shù)來優(yōu)化異源宿主中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。分子進(jìn)化一旦分離和/或純化了編碼酶的核苷酸序列，或鑒定了推定的編碼酶的核苷酸序列，可以希望修飾選定的核苷酸序列，例如希望對(duì)序列進(jìn)行突變從而制備根據(jù)本發(fā)明的具有改進(jìn)穩(wěn)定性特征的酶?？梢岳煤铣尚怨押塑账醽韺?dǎo)入突變。這些寡核苷酸包含位于所需突變位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸序列。在Morinaga 等(Biotechnology (1984) 2，p646_649)中描述了合適的方法。在Nelson 和 Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)中描述了將突變導(dǎo)入編碼酶的核苷酸序列的另ー種方法。除了諸如上面所述的定點(diǎn)誘變之外，還可以例如利用商業(yè)試劑盒如來自Stratagene的GeneMorph PCR誘變?cè)噭┖?或來自Clontech的Diversify PCR隨機(jī)誘變?cè)噭┖须S機(jī)導(dǎo)入突變。獲得新序列的第三種方法是對(duì)非同一性的核苷酸序列進(jìn)行片段化，通過利用任一種限制性酶或酶如DNA酶I，并重新組配編碼功能性蛋白質(zhì)的完整核苷酸序列?；蛘呖梢允褂茅`個(gè)或多個(gè)非同一性核苷酸序列并在完整核苷酸序列的組配過程中導(dǎo)入突變。因而，有可能在體內(nèi)或體外在核苷酸序列中產(chǎn)生多個(gè)定點(diǎn)或隨機(jī)突變，隨后通過各種方法篩選編碼多肽的提高的功能性。作為非限制性實(shí)例，可以將多核苷酸序列的突變或天然變體與野生型或其它突變或天然變體重組以產(chǎn)生新的變體。也可以針對(duì)所編碼多肽的提高的功能性篩選這些新的變體。通過本領(lǐng)域公知的各種方法，例如錯(cuò)誤閾值誘變(Error Threshold Mutagenesis)(WO 92/18645)，寡核苷酸介導(dǎo)的隨機(jī)誘變(US5, 723，323)，DNA 改組(US 5，605，793)，外介導(dǎo)的(exo-mediated)基因組配(W00058517)，或RCR某重組鏈反應(yīng)(EP 1230390和US 6, 821, 758)產(chǎn)生新的優(yōu)選變體。例如在 WO 0134835、WO 02/097130、WO 03/012100、W003/057247.W0 2004/018674,US 6，303，344 和 US 6，132，970 中描述了其它合適的方法。上述和類似的分子進(jìn)化方法的應(yīng)用可以鑒定和選擇本發(fā)明的酶的變體而無任何蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的現(xiàn)有知識(shí)，所述變體具有優(yōu)選的特性，并且可以生產(chǎn)不可預(yù)測(cè)但有益的突變或變體。本領(lǐng)域有許多應(yīng)用分子進(jìn)化以優(yōu)化或改變酶活性的實(shí)例，這些實(shí)例包括，但不限于下列的ー種或多種在宿主細(xì)胞中或體外優(yōu)化的表達(dá)和/或活性，增強(qiáng)的酶學(xué)活性，改變的底物和/或產(chǎn)物特異性，增強(qiáng)或降低的酶學(xué)或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在優(yōu)選的環(huán)境條件，例如，溫度、pH、底物中改變的酶學(xué)活性/特異性。氨基酸序列本發(fā)明的范圍還包括具有如本文所定義的特異性質(zhì)的酶的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語〃氨基酸序列〃與術(shù)語〃多肽〃和/或術(shù)語〃蛋白質(zhì)〃同義。在一些情況下，術(shù)語〃氨基酸序列〃與術(shù)語〃肽〃同義。在一些情況下，術(shù)語〃氨基酸序列〃與術(shù)語〃酶〃同義。 氨基酸序列可以由合適的來源制備/分離，或者它可以合成制備或者它可以通過利用重組DNA技術(shù)來制備。本發(fā)明所包括的酶可以結(jié)合其它酶使用。因而本發(fā)明還包括酶的組合，其中所述組合包含本發(fā)明的酶和另ー種酶，其可以是根據(jù)本發(fā)明的另ー種酶。在后面的部分中對(duì)這方面進(jìn)行討論。當(dāng)涉及或者當(dāng)被本發(fā)明的自身范圍所包括時(shí)，氨基酸序列優(yōu)選不是天然酶。在這一點(diǎn)上，術(shù)語〃天然酶〃意指在其天然環(huán)境下的完整酶，并且由其天然核苷酸序列表達(dá)。變體/同源物/衍生物本發(fā)明還包括酶的任何氨基酸序列或編碼這種酶的任何核苷酸序列的變體、同源物和衍生物的用途。在這里，術(shù)語“同源物”意指與氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的實(shí)體。在這里，術(shù)語〃同源性〃可以等同干“同一性”。適當(dāng)?shù)?，在本文中〃同源的〃指在利用下面更加詳?xì)介紹的比對(duì)算法來比對(duì)其序列之后兩種酶之間的序列同一性。在本文中，同源的氨基酸序列用來包括可以與序列至少75，80,81, 85或90%同一，優(yōu)選地至少95，96，97，98或99%同一的氨基酸序列。一般，同源物將例如與目標(biāo)氨基酸序列包含相同的活性位點(diǎn)。盡管同源性也可以用相似性(即具有類似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)來考慮，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選用序列同一性表示同源性。“功能片段”意指保留該多肽的特征性特性的多肽片段。在本發(fā)明的上下文中，肌醇六磷酸酶的功能片段是保留完整蛋白質(zhì)的肌醇六磷酸切割能力的片段。在本文中，同源的核苷酸序列用來包括可以與編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列(目標(biāo)序列)至少75，80, 81，85或90%同一性，優(yōu)選地至少95，96，97，98或99%同一的核苷酸序列。一般，同源物將包含與目標(biāo)核苷酸序列編碼相同活性位點(diǎn)的序列。盡管同源性也可以用相似性(即具有類似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)來考慮，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選用序列同一性表示同源性。對(duì)于氨基酸序列和核苷酸序列來說，可以通過肉眼，或者更常借助于易于得到的序列比較程序來進(jìn)行同源性比較。這些商業(yè)上現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列之間的％同源性。
可以在連續(xù)的序列上計(jì)算％同源性，即將ー個(gè)序列與另ー個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)，并且ー個(gè)序列中的每個(gè)氨基酸都直接與另ー個(gè)序列中的相應(yīng)氨基酸直接比較，一次ー個(gè)殘基。這稱作“無缺ロ”比對(duì)。一般，這種無缺ロ比對(duì)只在相對(duì)短的殘基數(shù)上進(jìn)行。盡管這是非常簡單和一致的方法，但它沒有考慮到，例如，在除此之外相同的序列對(duì)中，一個(gè)插入或缺失將引起后面的氨基酸殘基被排除在比對(duì)之外，因而當(dāng)進(jìn)行整體比對(duì)時(shí)可能導(dǎo)致％同源性大大降低。因此，大多數(shù)序列比較方法被設(shè)計(jì)來產(chǎn)生優(yōu)化的比對(duì)，其考慮了可能的插入和缺失，而不會(huì)對(duì)整體同源性分值不當(dāng)罰分。這通過在序列比對(duì)中插入“缺ロ”以試圖最大化局部同源性來實(shí)現(xiàn)。不過，這些更加復(fù)雜的方法對(duì)每個(gè)出現(xiàn)在比對(duì)中的缺ロ賦予“缺ロ罰分”，從而對(duì)于相同數(shù)目的同一氨基酸，具有盡可能少的缺ロ的序列比對(duì)(其反映了兩條對(duì)比序列之間的較高相關(guān)性)將獲得比具有很多缺ロ的序列更高的得分。通常使用“遠(yuǎn)交缺ロ成本(affine gap costs) ”,它對(duì)缺ロ的存在罰相對(duì)高的分,并且對(duì)所述缺口中姆ー個(gè)后續(xù)的殘基罰較少的分。這是最常用的缺ロ評(píng)分系統(tǒng)。高的缺ロ罰分，理所當(dāng)然地會(huì)產(chǎn)生具有較少缺ロ的最優(yōu)比對(duì)。大多數(shù)比對(duì)程序允許對(duì)缺ロ罰分進(jìn)行修改。不過，在將所述軟件用于序列比較時(shí)，優(yōu)選使用缺省值。例如當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包時(shí),對(duì)于缺ロ的氨基酸序列的缺省缺ロ罰分為-12，而對(duì)于每ー個(gè)延伸來說為-4。因此，最大％同源性的計(jì)算，首先需要產(chǎn)生最優(yōu)比對(duì)，這種比對(duì)考慮到了缺ロ罰分。用于進(jìn)行這種比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(Devereux等，1984, Nucleic Acids Research 12:387)?？梢赃M(jìn)行序列比較的其他軟件的例子包括，但不局限于 BLAST 軟件包(參見 Ausubel 等，1999, Short Protocols in MolecularBiology,第四版，第 18 章)，F(xiàn)ASTA(Atschul 等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和 GENETORKS比較工具系列。BLAST和FASTA都可得到，用于脫機(jī)和聯(lián)機(jī)檢索(參見Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology,第 7-58 到 7-60 頁)。不過，對(duì)于ー些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種稱作BLAST2序列的新工具也可以用于比較蛋白和核苷酸序列(見FEMS Microbiol Lettl999 174(2) :247-50 ；FEMSMicrobiol Lett 1999177 (I) : 187-8 和 tatianaOncbi. nlm. nih. gov)。盡管最終同源性百分比可以根據(jù)同一性而測(cè)量，對(duì)比過程自身一般不以全或無成對(duì)比較為基礎(chǔ)。相反，通常使用按比例繪制的(scaled)相似性評(píng)分矩陣將得分分配到每個(gè)以化學(xué)相似性或進(jìn)化距離為基礎(chǔ)而進(jìn)行的成對(duì)比較。這種常用矩陣的ー個(gè)例子是BL0SUM62矩陣，即BLAST程序系列的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序一般用公共默認(rèn)值或如果已提供，則使用自定義符號(hào)比較表(更詳細(xì)內(nèi)容見用戶手冊(cè))。對(duì)于ー些應(yīng)用，優(yōu)選將公共默認(rèn)值用于GCG軟件包，或在使用其它軟件的情況下，使用缺省矩陣，如BL0SUM62?；蛘撸梢岳肈NASISTM (Hitachi軟件)中的多重比對(duì)特征，基于類似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988), Gene 73 (I), 237-244)的算法來計(jì)算百分比同源性。一旦軟件產(chǎn)生最優(yōu)對(duì)比，就有可能計(jì)算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。軟件一般作為序列比較的一部分進(jìn)行此計(jì)算并產(chǎn)生以數(shù)字表示的結(jié)果。
序列也可以有產(chǎn)生沉默改變并導(dǎo)致產(chǎn)生功能等同物的氨基酸殘基缺失、插入或取代?？梢愿鶕?jù)氨基酸特性(如殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或雙親性)的相似而進(jìn)行有意的氨基酸取代，所以將氨基酸以官能團(tuán)分類在一起是有用的。氨基酸可以僅僅以它們的側(cè)鏈特性而分類在一起。不過，包括突變數(shù)據(jù)等更加有用。由此衍生的氨基酸組有可能由于結(jié)構(gòu)的原因而是保守的。這些組能夠以Venn圖表的形式描述(LivingstoneC. D.和 Barton GJ.、丄993) Protein sequence alignments: a strategy for thehierarchical analysis of residue conservation〃Compiit. Appl Biosci. 9:745-756)(Taylor ff. R. (1986)〃The classification of amino acid conservation〃J.Theor.Biol. 119;205-218)。例如根據(jù)下表可以制備保守性取代，所述表描述了普遍接受的氨基酸分類的Venn圖表。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其包含對(duì)應(yīng)于弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶或其同源物、修飾形式、功能等同物或有效片段的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求I的分離的多肽，其包含如SEQID NO:3中所示的氨基酸序列或與其具有至少75%同一性(同源性)的序列或其功能片段。
3.一種分離的多肽，其具有如SEQ ID N0:3中所給出的氨基酸序列或與其具有至少75%同一性(同源性)的序列或其功能片段。
4.一種肌醇六磷酸酶，其特征在于它源自以登錄號(hào)NCIMB 41247保藏的弗氏檸檬酸桿菌菌株P(guān)3-42。
5.一種肌醇六磷酸酶或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶具有至少 1100U/mg的比活，其中所述比活通過將所述肌醇六磷酸酶在下列溶液中溫育而測(cè)定，所述溶液包含溶于200mM醋酸鈉緩沖液、pH 3. 5中的2mM肌醇六磷酸、O. 8mM CaCl2。
6.一種肌醇六磷酸酶或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶在pH 3和pH4-4. 5附近具有兩個(gè)活性最大值，其中所述活性通過將所述肌醇六磷酸酶在溶液中溫育而進(jìn)行測(cè)定，所述溶液包含溶于200mM醋酸鈉緩沖液中的2mM肌醇六磷酸、O. 8mM CaCl20
7.如權(quán)利要求1-6中任ー項(xiàng)的分離的多肽或肌醇六磷酸酶，其在下列位置(根據(jù)SEQID No. 3中的編號(hào)方法進(jìn)行編號(hào))包含一個(gè)或多個(gè)突變:22, 23，24，28，46，53，57，67，74，75，77，78，79，82，88，95，96，97，98，101，102，103，105，109，112，122，126，136，140，142，143，148，151，152，154，156，160，161，164，168，170，176，177，195，199，203，204，205，206，207，215，224，225，229，233，235，274，279，288，301，307，308，322，343，358，360，362，365，366，367，370，383，384，385，386，391，393，395，397，408, 414。
8.如權(quán)利要求7中的分離的多肽或肌醇六磷酸酶，其中所述肌醇六磷酸酶包含ー種或多種下列突變A22T, E23K, E23Q, E24D, M28L, K46E, K46R, D53K, D53N, D57Y,G67R,G74R,E75K,E75V, V77I,S78T,E79V, Q82H, Q82K, Q82R,F88Y, N95D,N95P, N96P,N96S, N96Y, Q97T,T98G, T98P, S101F, P102L, G103E, V105I, A109T,D112V, D112Y, F122Y,L126I, Y136N, E140V, K142R, T143I, T143P, N148D, K151G, M152K, M152V, T154I, S156T, L160F，K161N, N164D, E168D, A170T, L176Q, L176V, Y177F, S195T, T199I, T203I, T203L, T203S, T203ff,E204A, E204G,E204H, E204I, E204N, E204R, E204V, K205P,K205R, S206R, S206T, T207A, T207S, L215F, D224H, N225D, N225E, P229S, S233C, S235A, Q274H, Q274L, Q279E, R288M, L301S, E307Y, N308D, N308T, A322V, G343A, K358R, K360N, T362A, T362I, N365D, T366S, D367N, Q370H, D383V, I384F,I384L, I384M, Q385R, P386Q, K391N, A393P, K395T, D397N, S408I, L414I。
9.如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中的分離的多肽或肌醇六磷酸酶，其包含選自下組的ー種突變P229S; Dl 12V ；Q82R; Q274H; Dl 12Y ；F88Y ；K46E; S233C; R288M; I384L; Q385R; Q274L; E307Y ；T199I;Q82K 和 T203I。
10.如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的分離的多肽或肌醇六磷酸酶，其包含選自下組的突變組合K46E/Q82H;Q82K/V105I;N148D/T362I;K46E/L414I;F88Y/Y136N;T154I/P386Q;N95P/N96S;N95P/N96P;Q97T/T98G;D224H/N225E;Y177F/T199I;Q274L/Q370H;K46E/N96Y ；N148D/L301S;E24D/R288M;E140V/A322V ；K46E/S195T;E75K/N365D;T98P/S235A;L160F/L215F;Q274L/K395T;G67R/Q279E/N308T;K161N/P229S/R288M;D53N/D57Y/M152V ；F122Y/S156T/P229S;T199I/S206R/T207S;E23K/K46E/Q82H;K46E/Q82H/Q385R;T203W/E204N/K205R;T203ff/E204H/K205R;T203ff/E204R/K205R;T203ff/E204A/K205R;A22T/K151G/N308D;E23K/E75K/F88Y ；M152K/N225D/L301S;S78T/Q274L/S4081;L176Q/T199I/T366S;K46E/V77I/T203S;K46R/T199I/D367N;G74R/E204G/R288M;A22T/T199I/S206T/T207A;Q82R/F88Y/L126I/I384L;K46E/Q82H/E168D/Q274L;Q82K/T154I/Q279E/N308T;Q82R/D112V/Q274H/T362;E24D/E79V/N95D/K360N;E23K/M28L/A109T/T143P/I384L;D53N/D57Y/T199I/P229S/R288M;K46E/Q82H/N148D/T154I/T362I;D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R;D53N/D57Y/T154I/P229S/R288M;Y136N/T199I/T203L/E204I/K205P;E23Q/S101F/Q274L/I384M/K391N;K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D383V ；D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P;D53K/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/F88Y/M152V/P229S/Q279E/N308T;D53N/D57Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P;K46E/D53N/D57Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A393P;Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P;Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I384L/P386Q/A393P;H18Q/D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P;Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I384F/A393P/D397N;D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D/N164D/Q274H/T362I/I384L/A393P;D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N95P/P102L/V105I/Y136N/N148D/Y177F/Q274H/Q279E/T362I/A393P;D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/Q274L/G343A/T362I/I384L/A393P。
11.一種分離的核酸分子，其編碼弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶，或其同源物。
12.如權(quán)利要求11的分尚的核酸分子,其編碼多肽,所述多肽包含如SEQID N0:3所不的氨基酸序列或與其具有至少75%同一性(同源性)的序列或其有效片段。
13.—種分離的核酸分子,其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID N0:2相同、或互補(bǔ)、或含有對(duì)SEQ ID NO: 2的任意密碼子的任意合適的密碼子取代，或包含與SEQ IDNO:2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%序列同源性的序列。
14.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中的分離的多肽或肌醇六磷酸酶。
15.一種分離的核酸分子，其包含如SEQ ID NO:2中給出的序列。
16.ー種質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)，其包含如權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中的分離的多肽或肌醇六磷酸酶或其同源物或衍生物。
17.如權(quán)利要求16中的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)，其包含如權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)中的核酸序列。
18.如權(quán)利要求16中的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)，其包含如SEQID NO:2中給出的核酸序列或與其具有至少75%同源性的序列或其有效片段。
19.如權(quán)利要求16-18任ー項(xiàng)中的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)，其中所述質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)是用于在宿主細(xì)胞或微生物中表達(dá)各個(gè)肌醇六磷酸酶或其同源物、修飾形式、功能等同物或有效片段的表達(dá)載體。
20.用權(quán)利要求16-19任ー項(xiàng)中的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20中的宿主細(xì)胞，其包含肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶包含根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的如SEQ ID NO: 3中所給出的氨基酸序列或其功能片段，或與其具有至少75%同源性的序列或其變體。
22.如權(quán)利要求20或21中的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞源自微生物，所述微生物包括細(xì)菌和真菌，所述細(xì)菌例如枯草芽孢桿菌、大腸桿菌，所述真菌包括酵母，例如多形漢森氏酵母、粟酒裂殖酵母、啤酒糖酵母。
23.如權(quán)利要求22中的宿主細(xì)胞，其中所述微生物是原核細(xì)菌細(xì)胞，并且優(yōu)選大腸桿菌。
24.—種細(xì)菌細(xì)胞菌株弗氏檸檬酸桿菌P3-42，其以登錄號(hào)NCIMB 41247保藏。
25.一種生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)如SEQ IDNO:3所給出的氨基酸序列、或與其具有至少75%同源性的序列或其修飾形式或變體或有效片段，以及從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中分離所述肌醇六磷酸酶。
26.ー種食品或動(dòng)物飼料組合物，其包含如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的肌醇六磷酸酶。
27.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中的肌醇六磷酸酶在食品或動(dòng)物飼料中的用途。
28.—種生產(chǎn)食品或動(dòng)物飼料的方法，包含向所述食品或動(dòng)物飼料上噴灑液體形式的如權(quán)利要求ι- ο任一項(xiàng)的肌醇六磷酸酶的步驟。
29.—種生產(chǎn)食品或動(dòng)物飼料的方法，包含將作為干燥產(chǎn)品的如權(quán)利要求1-10任ー項(xiàng)的肌醇六磷酸酶與所述食品或動(dòng)物飼料混合的步驟。
30.一種制備肌醇六磷酸酶變體的方法，該方法包含 a)選擇親本肌醇六磷酸酶，其中所述親本肌醇六磷酸酶選自 i.與SEQ ID No 3具有至少75%同源性的親本肌醇六磷酸酶 .源自檸檬酸桿菌屬的親本肌醇六磷酸酶 b)在親本肌醇六磷酸酶中制造至少ー種變化，以獲得肌醇六磷酸酶變體，所述變化是氨基酸殘基的插入、缺失或取代 c)篩選肌醇六磷酸酶變體，所述肌醇六磷酸酶變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有 i.較高的熱穩(wěn)定性和/或 ii.比活和/或 iii.蛋白水解穩(wěn)定性和/或 d)制備肌醇六磷酸酶變體。
31.一種制備肌醇六磷酸酶變體的方法，該方法包含 a)將編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列進(jìn)行誘變，其中所述親本肌醇六磷酸酶選自i.與SEQ ID No 3具有至少75%同源性的親本肌醇六磷酸酶 .源自檸檬酸桿菌屬的親本肌醇六磷酸酶 b)將步驟(a)中獲得的突變DNA序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，和 c)篩選表達(dá)肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，所述肌醇六磷酸酶變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有 iv.更高的熱穩(wěn)定性和/或 V.更高的比活*和/或 vi.更聞的蛋白水解穩(wěn)定性和/或 e)制備由宿主細(xì)胞表達(dá)的肌醇六磷酸酶變體。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種分離的多肽，其包含對(duì)應(yīng)于弗氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶或其同源物、修飾形式、功能等同物或有效片段的氨基酸序列。本發(fā)明還描述了用編碼細(xì)菌肌醇六磷酸酶或修飾形式的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及這種肌醇六磷酸酶或修飾形式在食品或動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23L1/03GK102676467SQ20121013888
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2005年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月4日
發(fā)明者烏爾里克·凱特林, 伯吉塔·勒斯納, 克勞斯·佩爾蘭加, 奧利弗·肯希, 安德烈·科爾特曼, 安德賴·米亞斯尼科夫, 維杰·庫馬 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司