專利名稱：貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置及貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種用于大規(guī)模體外培養(yǎng)哺乳類動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞及人類細(xì)胞的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置及貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
采用大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法。20世界60-70年代，用于大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就已創(chuàng)立。近數(shù)十年來，由于人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細(xì)胞介素等生物制品的需求猛增，采用傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)從動物組織中獲取生物制品的量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。隨著細(xì)胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)逐漸趨于成熟。所謂細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)(large-scale culture technology)是指在人工條件下(設(shè)定ph、溫度、溶氧等)，在細(xì)胞生物反應(yīng)器(bioreactor)中高密度大量培養(yǎng)用于生產(chǎn)生物制品的動物細(xì)胞的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、cho (中華倉鼠卵巢)細(xì)胞、BHK-21(倉鼠腎細(xì)胞)、Veix)細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，它是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)使用轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)進(jìn)行貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)具有勞動強(qiáng)度大、占地空間大、單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小、細(xì)胞生長密度低、產(chǎn)品質(zhì)量不均一、培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受限的缺點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，特別是培養(yǎng)表達(dá)特異性蛋白的哺乳動物細(xì)胞，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，已不能滿足細(xì)胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物的需求。自70年代以來，采用微載體技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞及其生物反應(yīng)器(Bioreactor)得到了較快的發(fā)展，生物反應(yīng)器的種類越來越多，規(guī)模越來越大，較常見的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器有空氣提升反應(yīng)器、中空纖維管反應(yīng)器、無泡攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器等。八十年代以來，人們逐漸開始采用微載體技術(shù)以生物反應(yīng)器培養(yǎng)代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。動物細(xì)胞是一種無細(xì)胞壁的真核細(xì)胞，生長緩慢,對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。采用傳統(tǒng)的生物化工技術(shù)進(jìn)行動物細(xì)胞大量培養(yǎng)，除了要滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)要求外，有必需建立合理的控制模型，進(jìn)行PH和溶氧(DO)的最佳控制。細(xì)胞生物反應(yīng)器可通過微機(jī)有序地定量地控制加入動物細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮?dú)夂投趸妓姆N氣體的流量，使其保持最佳的比例來控制細(xì)胞培養(yǎng)液中的PH值和溶氧水平，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)，以滿足動物細(xì)胞的生長對PH值和溶解氧的需要。如為提高或達(dá)到一定的溶氧水平可改變通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中氧氣和氮?dú)獾谋壤齺韺崿F(xiàn)控制DO值的目的。細(xì)胞生物反應(yīng)器采用二氧化碳/碳酸氫鈉(C02/NaHC03)緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液的pH值。目前微載體培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)多種類型細(xì)胞，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞，但由于微載體對細(xì)胞有一定要求，仍有多種細(xì)胞無法采用微載體技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。
現(xiàn)在，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都有不斷的發(fā)展，并且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，人們對細(xì)胞培養(yǎng)的態(tài)度也已經(jīng)發(fā)生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物和疫苗，尤其是那些相對較大、較復(fù)雜或糖基化(glycosylated)的蛋白質(zhì)來說，細(xì)胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。60年代初，英國AVRI研究所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，從最初的200ml和800ml玻璃容器開始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養(yǎng)規(guī)模。使用的是基于Eagle’s配方的培養(yǎng)基,補(bǔ)充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后,WelIcome (現(xiàn)為Cooper動物保健)集團(tuán)分布于歐洲、非洲和南美洲8個國家的生產(chǎn)廠商，應(yīng)用此項技術(shù)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，已掌握了 5000L的細(xì)胞罐大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。目前，國內(nèi)很多企業(yè)仍然采用轉(zhuǎn)瓶技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，然而由于轉(zhuǎn)瓶技術(shù)具有不能大規(guī)模制備產(chǎn)品、生產(chǎn)批次間質(zhì)量差異大、產(chǎn)品無法監(jiān)控的缺點(diǎn)，新的生產(chǎn)線已經(jīng)不允許采用轉(zhuǎn)瓶技術(shù)。 由于微載體技術(shù)工藝操作復(fù)雜，對細(xì)胞生物反應(yīng)器的要求高，設(shè)備完全依賴進(jìn)口。目前國內(nèi)企業(yè)對微載體技術(shù)的工藝不能完全掌握，只有少數(shù)企業(yè)可以做到300L的培養(yǎng)規(guī)模，國際上也僅有少數(shù)企業(yè)掌握了 1000L以上的培養(yǎng)技術(shù)，無法超過5000L的培養(yǎng)規(guī)模，嚴(yán)重制約了疫苗及生物工程藥物的研究及生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種結(jié)構(gòu)簡單、工藝操作簡單、生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量均一、培養(yǎng)過程容易監(jiān)控、能滿足大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置。本發(fā)明的第一目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括中部具有空腔的殼體，該殼體的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細(xì)胞生長層、過濾層和支撐層，細(xì)胞生長層位于過濾層的上方，支撐層位于過濾層的下方，細(xì)胞生長層、過濾層、支撐層三者將殼體的內(nèi)部空腔分割為位于細(xì)胞生長層的上方的上部空腔和位于支撐層下方的下部空腔，上部空腔內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道，殼體的上部設(shè)置有與該上部空腔連通的至少一個進(jìn)液口和至少一個出液口，下部空腔為透過液流道，所述殼體的下部設(shè)置有與該下部空腔連通的至少一個透過液口。所述殼體的上部空腔內(nèi)設(shè)置有多塊縱向的擋板，這些擋板均勻的水平排開，相鄰的擋板交錯與殼體的左壁、右壁連接，相鄰擋板相互平行且相鄰擋板之間留有間隙，這些擋板與殼體的內(nèi)壁之間構(gòu)成了迂回的狹長的所述流道，所述進(jìn)液口設(shè)置于該流道的起始處，所述出液口設(shè)置于該流道的終止處。所述細(xì)胞生長層為細(xì)胞親和性良好的一層或兩層以上的疏松多孔結(jié)構(gòu)或所述細(xì)胞生長層具有帶透液孔的光滑表面。所述過濾層為設(shè)置有過濾孔的細(xì)胞截留層，其中，過濾孔的孔徑小于40um。本發(fā)明的另一目的在于提供一種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明的另一目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括透過液容器、權(quán)利要求1-4中所述的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置以及通過補(bǔ)液調(diào)節(jié)該貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的細(xì)胞培養(yǎng)條件的儲液裝置，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的透過液口通過管路與透過液容器連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的出液口通過管路與儲液裝置的進(jìn)液口連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的進(jìn)液口通過管路與儲液裝置的出液口連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置與儲液裝置之間的管路設(shè)置有循環(huán)泵。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置創(chuàng)造性地將切向流技術(shù)與固定床技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，其兼具結(jié)構(gòu)簡單、工藝操作簡單、生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量均一、培養(yǎng)過程容易監(jiān)控的優(yōu)點(diǎn)，它能穩(wěn)定地進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。本發(fā)明的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的儲液裝置能夠通過補(bǔ)液控制貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的整個細(xì)胞培養(yǎng)過程的培養(yǎng)條件，與貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置配合完成整個細(xì)胞培養(yǎng)過程。


圖I是本發(fā)明的整體結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是本發(fā)明的俯視圖；圖3是本發(fā)明的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。在圖I、圖2中1_殼體；2_細(xì)胞生長層；3_過濾層；4_支撐層；5_上部空腔；6-流道；7-下部空腔；8-進(jìn)液口 ；9-出液口 ；10_透過液口 ；11_擋板。在圖3中12_貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置；13-透過液容器；14-儲液裝置；15-循環(huán)泵。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述。如圖I所示，一種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括中部具有空腔的殼體1，該殼體I的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細(xì)胞生長層2、過濾層3和支撐層4，細(xì)胞生長層2位于過濾層3的上方，支撐層4位于過濾層3的下方，細(xì)胞生長層2、過濾層3、支撐層4三者將殼體I的內(nèi)部空腔分割為位于細(xì)胞生長層2的上方的上部空腔5和位于支撐層4下方的下部空腔7，上部空腔5內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道6，殼體I的上部設(shè)置有與該上部空腔5連通的至少一個進(jìn)液口 8和至少一個出液口 9，下部空腔7為透過液流道，殼體I的下部設(shè)置有與該下部空腔7連通的至少一個透過液口 10。傳統(tǒng)死端過濾技術(shù)液體的流動方向垂直于過濾膜，隨著時間的推移，顆粒會逐漸在濾膜表面堆積，最終造成堵塞。由于細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不可避免的會有部分細(xì)胞老化死亡，從而產(chǎn)生細(xì)胞碎片，造成濾膜的堵塞，本發(fā)明運(yùn)用了切向流過濾技術(shù)，切向流技術(shù)將液體流動方向平行于過濾膜，因而液體在流動的同時會將大量的顆粒從濾膜表面帶走，避免了堵塞的情況。由于細(xì)胞生長的過程中需要消耗大量的營養(yǎng)，也會產(chǎn)生大量的代謝廢物，因此在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不斷的換培養(yǎng)液才能保證細(xì)胞的正常生長。同時，蛋白或病毒也存在于培養(yǎng)液中，及時的收獲才能得到最大的設(shè)備利用率。因而，利用切向流技術(shù)進(jìn)行換液非常適合細(xì)胞培養(yǎng)工藝。如圖2所示，殼體I的上部空腔5內(nèi)設(shè)置有多塊縱向的擋板11，這些擋板11均勻的水平排開，相鄰的擋板11交錯與殼體I的左壁、右壁連接，相鄰擋板11相互平行且相鄰擋板11之間留有間隙，這些擋板11與殼體I的內(nèi)壁之間構(gòu)成了迂回的狹長的流道6，進(jìn)液口 8設(shè)置于該流道6的起始處，出液口 9設(shè)置于該流道6的終止處。培養(yǎng)基在狹長的流道6內(nèi)流動，將營養(yǎng)物帶給細(xì)胞，同時，將代謝廢物帶走。在本發(fā)明中，細(xì)胞生長層2為細(xì)胞親和性良好的一層或兩層以上的疏松多孔結(jié)構(gòu)或細(xì)胞生長層2具有帶透液孔的光滑表面，這可以在有限空間內(nèi)提供最大的細(xì)胞接觸表面，培養(yǎng)基可自由穿透該細(xì)胞生長層2到達(dá)過濾層3，該細(xì)胞生長層2可采用纖維素及其衍生物、聚酯纖維(尼龍)、殼聚糖及其衍生物、膠原蛋白、明膠、聚乳酸、聚乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚氨酯泡沫微載體、海藻酸鹽、葡聚糖、玻璃、陶瓷等材料或上述材料相結(jié)合制成。過濾層3為設(shè)置有過濾孔的細(xì)胞截留層，其中，過濾孔的孔徑小于40um，在保證培養(yǎng)基透過的同時，保證細(xì)胞不會穿過該過濾層3。支撐層4保證過濾層3不會在壓力下破損。如圖3所示，一種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括透過液容器13、貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12以及通過補(bǔ)液調(diào)節(jié)該貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12的細(xì)胞培養(yǎng)條件的儲液裝置14，貼壁型細(xì) 胞培養(yǎng)裝置12的透過液口 10通過管路與透過液容器13連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12的出液口 9通過管路與儲液裝置14的進(jìn)液口 8連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12的進(jìn)液口 8通過管路與儲液裝置14的出液口 9連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12與儲液裝置14之間的管路設(shè)置有循環(huán)泵15。采用本發(fā)明進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法如下。I、貼壁將貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12與細(xì)胞接種瓶進(jìn)行無菌連接，通過蠕動泵循環(huán)將細(xì)胞接種瓶內(nèi)的接種液送入貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12內(nèi)，打開透過液口，以達(dá)到濃縮細(xì)胞的目的，待接種濃縮液將貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12的上部空腔5的流道6剛好充滿時，將貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12的出液口 9封閉，在進(jìn)液口 8加壓或在透過液口 10抽液，使流道6的液體排空，這樣細(xì)胞即可與細(xì)胞生長層2緊密接觸，在恒溫環(huán)境中靜置一段時間，細(xì)胞即可粘附到細(xì)胞生長層2上，達(dá)到貼壁的目的。2、培養(yǎng)將貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12與儲液裝置14按照附圖3連接，儲液裝置14可采用能控制溫度、溶氧、PH參數(shù)的發(fā)酵罐(或?qū)⒄w系統(tǒng)安裝于恒溫環(huán)境中)，保證細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定溫度條件，在培養(yǎng)過程中，通過蠕動泵將培養(yǎng)基注入貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12的流道6中，在給細(xì)胞提供營養(yǎng)的同時，將細(xì)胞代謝產(chǎn)物帶走。3、消化培養(yǎng)結(jié)束后，將貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置12中的培養(yǎng)基快速排干，加入消化液，靜置一段時間后，通過透過液口 10排出消化液，通過進(jìn)液口 8加入新鮮培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時間循環(huán)后，通過出液口 9收集細(xì)胞。4、感染及收獲病毒對于疫苗生產(chǎn)，可在培養(yǎng)結(jié)束后加入病毒，待病毒達(dá)到收獲密度后，通過透過液口10收集病毒液或直接通過出液口 9收集病毒。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上內(nèi)容僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行的簡單修改或者等同替換，均不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置包括中部具有空腔的殼體，該殼體的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細(xì)胞生長層、過濾層和支撐層，細(xì)胞生長層位于過濾層的上方，支撐層位于過濾層的下方，細(xì)胞生長層、過濾層、支撐層三者將殼體的內(nèi)部空腔分割為位于細(xì)胞生長層的上方的上部空腔和位于支撐層下方的下部空腔，上部空腔內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道，殼體的上部設(shè)置有與該上部空腔連通的至少一個進(jìn)液口和至少一個出液口，下部空腔為透過液流道，所述殼體的下部設(shè)置有與該下部空腔連通的至少一個透過液口。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述殼體的上部空腔內(nèi)設(shè)置有多塊縱向的擋板，這些擋板均勻的水平排開，相鄰的擋板交錯與殼體的左壁、右壁連接，相鄰擋板相互平行且相鄰擋板之間留有間隙，這些擋板與殼體的內(nèi)壁之間構(gòu)成了迂回的狹長的所述流道，所述進(jìn)液口設(shè)置于該流道的起始處，所述出液口設(shè)置于該流道的終止處。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述細(xì)胞生長層為細(xì)胞親和性良好的一層或兩層以上的疏松多孔結(jié)構(gòu)或所述細(xì)胞生長層具有帶透液孔的光滑表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述過濾層為設(shè)置有過濾孔的細(xì)胞截留層，其中，過濾孔的孔徑小于40um。
5.—種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于該貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括透過液容器、權(quán)利要求1-4中所述的貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置以及通過補(bǔ)液調(diào)節(jié)該貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的細(xì)胞培養(yǎng)條件的儲液裝置，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的透過液口通過管路與透過液容器連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的出液口通過管路與儲液裝置的進(jìn)液口連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置的進(jìn)液口通過管路與儲液裝置的出液口連接，貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置與儲液裝置之間的管路設(shè)置有循環(huán)泵。
全文摘要
一種貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置及貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。其中，裝置包括殼體，該殼體的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細(xì)胞生長層、過濾層和支撐層，細(xì)胞生長層、過濾層、支撐層三者將殼體的內(nèi)部空腔分割為上部空腔和下部空腔，上部空腔內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道，殼體的上部設(shè)置有與該上部空腔連通的進(jìn)液口和出液口，殼體的下部設(shè)置有與該下部空腔連通的透過液口。本發(fā)明的裝置創(chuàng)造性地將切向流技術(shù)與固定床技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，其兼具結(jié)構(gòu)簡單、工藝操作簡單、生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量均一、培養(yǎng)過程容易監(jiān)控的優(yōu)點(diǎn)，它能穩(wěn)定地進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。本發(fā)明的系統(tǒng)的儲液裝置能夠通過補(bǔ)液控制細(xì)胞培養(yǎng)條件，與貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)裝置配合完成整個細(xì)胞培養(yǎng)過程。
文檔編號C12M3/04GK102703319SQ20121014006
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者敦振毅 申請人:敦振毅