專利名稱：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌IsdB蛋白活性片段的重組蛋白、及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB活性片段IsdB2重組蛋白、及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌指的是對(duì)惡唑類青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌，是一種存在人和動(dòng)物的體表、鼻咽、會(huì)陰部及腸道的革蘭陽(yáng)性菌，通常引發(fā)皮膚軟組織感染、菌血癥以及轉(zhuǎn)移并發(fā)癥，如肺炎、心內(nèi)膜炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎。自1961年被英國(guó)學(xué)者Jevons首次發(fā)現(xiàn)，目前已成為全球ICU病房、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染經(jīng)久不愈，全身感染死亡率高達(dá)20%。因其傳播途徑廣泛，易暴發(fā)流行，又由于其致病性強(qiáng)，變異性大，且呈多重耐藥而成為臨床 上治療的難點(diǎn)，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”，這一特點(diǎn)使其極有可能作為未來(lái)軍事斗爭(zhēng)的細(xì)菌武器和生物恐怖戰(zhàn)劑。當(dāng)前，MRSA已與乙型肝炎、AIDS被列為世界三大最難解決的感染性疾病，并位居首位。在國(guó)外，2005年美國(guó)的MRSA感染監(jiān)控資料顯示，美國(guó)全年的嚴(yán)重感染人數(shù)為9. 4萬(wàn)多人，致死病例約為I. 9萬(wàn)人，這一數(shù)字甚至超過(guò)艾滋病致死人數(shù)。在國(guó)內(nèi)，2008年中國(guó)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)協(xié)作網(wǎng)(CHINET)檢測(cè)結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)主要地區(qū)12所教學(xué)醫(yī)院MRSA平均檢出率為55. 9%，最高為77. 5%，屬于MRSA感染的嚴(yán)重國(guó)家之一。以上海為例，2004年該地區(qū)14所醫(yī)院金黃色葡萄球菌中MRSA的平均檢出率為63. 9%，最高為86. 5%，而2006年MRSA的平均檢出率為64. 6%，最高達(dá)92. 5%。由此可見(jiàn)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不斷攀升，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，萬(wàn)古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最后一道防線，但1997年以來(lái)耐萬(wàn)古霉素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌相繼被分離出來(lái)，可見(jiàn)抗生素的發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，使得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌即將面臨無(wú)抗生素可治的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，加強(qiáng)對(duì)MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美國(guó)研發(fā)的MRSA疫苗已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)階段，因此，研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、高效、安全、經(jīng)濟(jì)的MRSA疫苗對(duì)控制MRSA感染、耐藥性發(fā)展、生物恐怖防御和提高國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。由于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌致病因子包括莢膜多糖、ClfA, IsdB、腸毒素、TSST-U α-溶血素以及凝固酶等數(shù)十種，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護(hù)性抗原的難度較大，方法繁瑣，不利于疫苗的產(chǎn)業(yè)化制備。利用基因工程技術(shù)將菌體有效的保護(hù)性抗原進(jìn)行克隆表達(dá)使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB是一種外膜蛋白抗原，IsdB不僅是MRSA —個(gè)重要外膜錨釘?shù)鞍?，在MRSA定植粘附中期重要作用，同時(shí)它也是MRSA從宿主獲得鐵的一個(gè)主要工具。細(xì)菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，這些外膜蛋白作為抗體和免疫細(xì)胞攻擊的主要靶標(biāo)，可以介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌最直接有效的殺滅作用，是決定免疫反應(yīng)是否對(duì)人體具有保護(hù)性的關(guān)鍵因素。利用生物信息學(xué)對(duì)IsdB進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能分析，發(fā)現(xiàn)IsdB是兩次跨膜蛋白，由胞外區(qū)以及跨膜區(qū)組成。由于IsdB是的細(xì)胞壁錨定蛋白，因此其捕獲血紅蛋白主要由胞外區(qū)的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。這為設(shè)計(jì)亞單位疫苗提供了理論基礎(chǔ)。亞單位疫苗是去除病原體中與激發(fā)保護(hù)性免疫無(wú)關(guān)甚或有害的成分，但保留有效免疫原成分的新型疫苗。然而，亞單位疫苗由于具有諸多局限性，例如其在受體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)較多是短暫性的，不能引起長(zhǎng)期有效的免疫性，因此選擇的合適的免疫原成分就成為需要解決的重大問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的高耐藥性，本發(fā)明提供一種耐甲氧西林金黃色 葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重組蛋白，其可應(yīng)用于制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的亞單位疫苗以及相關(guān)的檢測(cè)試劑盒。鑒于ISdB蛋白為兩次跨膜蛋白，其胞外區(qū)對(duì)應(yīng)34飛28的氨基酸序列，并且其捕獲血紅蛋白主要由胞外區(qū)的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，為了在最大限度上保持IsdB的結(jié)構(gòu)和功能不發(fā)生較大的變化，本發(fā)明同時(shí)截短IsdB (SEQ IDNO :1)氨基端I 33個(gè)氨基酸和羧基端的f 23個(gè)氨基酸后對(duì)IsdB活性片段進(jìn)行克隆、表達(dá)和保護(hù)性免疫的評(píng)價(jià)，將IsdB截短后的片段命名為IsdB2。本發(fā)明所述活性片段IsdB2包含IsdB蛋白的胞外區(qū)，其氨基酸序列為為SEQ IDNO 3或在SEQ ID NO 3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干個(gè)氨基酸后得到的與SEQID NO :3具有相同或相似功能的序列；優(yōu)選地，所述活性片段的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，即所示序列的氨基端和羧基端分別缺失33和23個(gè)氨基酸后所獲得的示于SEQ ID NO 4的序列，即同時(shí)截短IsdB (SEQ ID NO :1)氨基端33個(gè)氨基酸和羧基端的23個(gè)氨基酸后獲得的序列。本發(fā)明還提供一種用于表達(dá)IsdB2重組蛋白的重組表達(dá)載體，其包含編碼所述IsdB2重組蛋白的核苷酸序列以及載體序列。所述編碼IsdB2重組蛋白的核苷酸序列可以是SEQ ID NO :4或在SEQ ID NO :4的一端或兩端添加或缺失若干個(gè)核苷酸后得到的編碼與SEQ ID NO :3所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列；優(yōu)選地，所述核苷酸序列為編碼SEQ ID NO :3氨基酸序列的SEQ IDNO :4。本發(fā)明優(yōu)選采用pGEX-6p_2載體來(lái)構(gòu)建重組表達(dá)載體，表達(dá)IsdB2重組蛋白，pGEX是由Smith和Johnson于1987年構(gòu)建的表達(dá)融合蛋白的載體,其主要特點(diǎn)是載體上接有一個(gè)分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，所表達(dá)的融合蛋白中就含有一個(gè)GST標(biāo)簽，此標(biāo)簽是蛋白純化的標(biāo)記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、步驟簡(jiǎn)單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構(gòu)象和免疫原性。因此，本發(fā)明還提供一種宿主菌，其導(dǎo)入有上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還提供一種表達(dá)IsdB2重組蛋白的方法，其包含以下步驟1)根據(jù)編碼IsdB2重組蛋白的核酸序列設(shè)計(jì)正向引物isdB2-F和反向引物isdB2-R;2)使用步驟I)設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出編碼IsdB2重組蛋白的基因片段；3)將步驟2)所獲得的基因片段克隆至表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化至宿主菌；以及4)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達(dá)IsdB2重組蛋白。本發(fā)明設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物的優(yōu)選核苷酸序列分別示于SEQID N0:5和SEQ ID NO6o所使用的宿主菌優(yōu)選大腸桿菌XLlbule。本發(fā)明還提供一種IsdB2重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種IsdB2重組蛋白在制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)此截短的保護(hù)性抗原成分IsdB2蛋白，表達(dá)量 高，便于分離純化，而且高效安全。IsdB2重組蛋白可以直接與佐劑(如Al (OH) 3佐劑、MF59、AS03、ASO4、不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑、分枝桿菌卡介苗佐劑等)配合使用，適用于注射免疫接種。本發(fā)明的基因工程重組蛋白的表達(dá)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1) IsdB2重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒在原核表達(dá)系統(tǒng)一大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)；2)選擇pGEX載體系列時(shí)，IsdB2重組蛋白以融合蛋白形式表達(dá)；表達(dá)載體上接有一個(gè)分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，所表達(dá)的融合蛋白中就含有一個(gè)GST標(biāo)簽，此標(biāo)簽就成為蛋白純化的標(biāo)記，使得純化條件溫和、步驟簡(jiǎn)單、不需要變性劑的加入，從而純化后的蛋白能最大限度保持其空間構(gòu)象和免疫原性；表達(dá)率約為30%，純化出來(lái)的IsdB2重組蛋白純度大于95% ；3)IsdB2重組蛋白均能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體。利用本發(fā)明IsdB2重組蛋白制備的亞單位疫苗可通過(guò)皮下(肌肉)注射途徑進(jìn)行免疫接種，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度IgG抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答。并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述基因工程重組多價(jià)疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保護(hù)效果。為進(jìn)一步的聯(lián)合疫苗和多亞單位融合疫苗研究打下基礎(chǔ)，同時(shí)為防治疫苗和診斷試劑盒的研制及應(yīng)用具有重要的作用。為了使本發(fā)明目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。


圖I是IsdB2基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道M :核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道I 3 目的基因片段IsdB2 (1785bp)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為表達(dá)載體pGEX-6p-2_IsdB (1785bp)的酶切鑒定結(jié)果泳道M :核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道1-6 :重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-2_IsdB經(jīng)酶切后的鑒定結(jié)果，其中泳道4表示酶切后分離的片段4000bp和1785bp ；圖3表示不同溫度下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)結(jié)果泳道M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)
泳道1、3、5、7、9 :表達(dá)載體分別在30°C、25°C、18°C、16°C、12°C下誘導(dǎo)表達(dá)后，在上清中獲得的蛋白。泳道2、4、6、8 :表達(dá)載體分別在30°C、25°C、18°C、16°C下誘導(dǎo)表達(dá)后，在沉淀中獲
得的蛋白。圖4表示重組表達(dá)載體在16 °C過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得含GST標(biāo)簽的融合蛋白，其中泳道M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道1、2:重組表達(dá)載體在16°C下過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)后，在上清中獲得含GST標(biāo)簽的融合蛋白；泳道3、4 :重組表達(dá)載體在16°C下過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)后，在沉淀中獲得的蛋白。 圖5表示含GST標(biāo)簽的融合蛋白酶切結(jié)果泳道M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道I :酶切前，含有GST標(biāo)簽的融合蛋白；泳道2 :酶切后，在上清獲取的目的蛋白；泳道3 :酶切后,第一次洗漆用于結(jié)合表達(dá)蛋白的GlutathioneSepharose 4B凝膠柱(beads)獲取的目的蛋白；泳道4 :酶切后，第二次洗滌beads獲取的目的蛋白；泳道5 :酶切后，非特異性結(jié)合在beads的目的蛋白和特異性結(jié)合在beads上的酶和GST標(biāo)簽。圖6是利用在線生物信息軟件對(duì)IsdB蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果圖。圖7是利用Porter軟件對(duì)IsdB 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果圖，其中“H”表示α螺旋“Ε”表示β折疊“C”表示無(wú)規(guī)則卷曲“Τ”表示β轉(zhuǎn)角。圖8利用SWISS-MODEL軟件通過(guò)同源模建在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找模板，對(duì)IsdB進(jìn)行
三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。圖9利用SWISS-MODEL軟件通過(guò)同源模建在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找模板，對(duì)IsdB進(jìn)行
三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。圖10是重組表達(dá)載體測(cè)序后與IsdB2的核酸序列對(duì)比結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所使用的菌株與各種試劑如下I.菌株、質(zhì)粒金黃色葡萄球菌MRSA-252國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株由美國(guó)ACTT提供；菌株XL-Iblue大腸桿菌為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pGEX_6p_2 為美國(guó) GE Healthcare 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pET_22b為美國(guó)merck公司產(chǎn)品；2.試劑primeSTAR HS DNA Polymerase>DNA Marker、限制性內(nèi)切酶 BamHI 和 Not I、蛋白Marker為大連TakaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒、超薄回收試劑盒以及顯色液為天根公司產(chǎn)品；
T4DNA Ligase 為 Fermentas 公司產(chǎn)品；谷胱甘妝-瓊脂糖凝膠Glutathione Sepharose 4B為美國(guó)GE Healthcare公司亮抑妝Leupeptin hemisulfate 和胃蛋白抑制劑 PepstatinA 購(gòu)自德國(guó) AppliCh公司；苯甲基磺酰氟PMSF來(lái)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。本發(fā)明中所使用PBS、Tris等化學(xué)試劑均為市售的分析純；本發(fā)明中所使用TB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基等均為市售的生化制品。實(shí)施例I :耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB活性片段IsdB2的克隆I.首先根據(jù)MRSA_252IsdB蛋白全長(zhǎng)基因序列，應(yīng)用生物信息軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，分析結(jié)果參見(jiàn)附圖6-9，從而確定需要擴(kuò)增的IsdB2目的基因片段。2.根據(jù)分析結(jié)果，采用PCR方法自MRSA-252基因組擴(kuò)增IsdB2目的基因片段，擴(kuò)增步驟如下I)設(shè)計(jì)PCR引物如下，分別為SEQ ID NO :5_6 (下劃線示酶切位點(diǎn)堿基序列)isdB2-F SEQ ID NO 55，-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAGC-3’BamH IisdB2-R SEQ ID NO :65’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-3，Not I本實(shí)施例將編碼SEQ ID NO :4所示IsdB2氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 3作為目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以選擇衍生自SEQ ID NO2所示核苷酸序列、在其對(duì)應(yīng)編碼蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO: I所示)氨基端和羧基端分別缺失1-33和1-23個(gè)密碼子后所獲得的任意序列作為目的基因片段。2) _80°C冷凍庫(kù)中取出保存的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252專用固體培養(yǎng)基上，于37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，再挑取單菌落接種于MRSA-252專液體體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)，參照細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提MRSA基因組。3)以MRSA-252全基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增IsdB2基因片段PCR體系
模扳(239.2 ng/μ )2.5μ1
isdB2-F (50μΜ)Ιμ
isdB2-R (50μΜ)Ιμ
Taq _2.5μ1
dNTP2 μ!
BufferΙ5μ權(quán)利要求
1.一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重組蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO :3或在SEQ ID NO: 3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干個(gè)氨基酸后得到的與SEQ ID NO :3具有相同或相似功能的序列。
2.—種權(quán)利要求I所述IsdB2重組蛋白的重組表達(dá)載體，其特征在于，包含編碼所述IsdB2重組蛋白的核苷酸序列以及載體序列。
3.如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQID N0:4或在SEQ ID NO :4的一端或兩端添加或缺失若干個(gè)核苷酸后得到的編碼與SEQ ID NO :3所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列。
4.如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述載體序列為pGEX-6p-2載體序列。
5.—種宿主菌,其特征在于,導(dǎo)入有權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體。
6.ー種表達(dá)權(quán)利要求I所述IsdB2重組蛋白的方法，其特征在于，包含以下步驟 .1)根據(jù)編碼IsdB2重組蛋白的核酸序列設(shè)計(jì)正向引物和反向引物； .2)使用步驟I)設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出編碼IsdB2重組蛋白的基因片段； .3)將步驟2)所獲得的基因片段克隆至表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化至宿主菌；以及 .4)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達(dá)IsdB2重組蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟I)中所設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物的核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。
8.權(quán)利要求I所述的IsdB2重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的IsdB2重組蛋白在制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重組蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID No3或在SEQID NO3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干個(gè)氨基酸后得到的與SEQID NO3具有相同或相似功能的序列。本發(fā)明還公開(kāi)了構(gòu)建所述重組蛋白的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化宿主菌而制備該重組蛋白的方法，以及所述重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗以及相關(guān)檢測(cè)試劑盒中的用途。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)此截短的保護(hù)性抗原成分IsdB2蛋白，表達(dá)量高，便于分離純化，而且高效安全。所述基因工程重組多價(jià)疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保護(hù)效果。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102675433SQ20121014038
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者馮強(qiáng), 盧陸, 曾浩, 童文德, 蔡昌芝, 鄒全明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué), 重慶原倫生物科技有限公司