專利名稱：梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Treponema pallidum, TP)引起的性傳播疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過(guò)性接觸、輸血、創(chuàng)口或者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液播散全身，使機(jī)體幾乎所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性的，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂(lè)觀地預(yù)言([1]WH0. Global prevalence andincidence of selected curable sexually transmitted infections:Overview andestimates [J] · Geneva: WHO, WH0/HIV/AIDS, 2001:1-30.):“ 由于有高靈敏度檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒是一種能夠通過(guò)公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，由于至今仍然缺乏高靈敏的檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒依然是嚴(yán)重危害人類健康的全世界范圍的公共衛(wèi)生問(wèn)題。中國(guó)疾病控制中心的官方數(shù)據(jù)顯示2010年我國(guó)梅毒(Syphilis)的發(fā)病數(shù)為375309例，比2009年同期增長(zhǎng)24. 50%。報(bào)告發(fā)病數(shù)僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核居第三位，居于性傳播疾病首位(中國(guó)疾控中心http://www.chinacdc. net. cn)。近年來(lái),有關(guān)梅毒與艾滋病之間存在著互相促進(jìn)的研究結(jié)果([2]Buchacz, K. , Klausner, J. D. , Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P. D. and Schwendemann, J. HIVincidence among men diagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, andLos Angeles, 2004to 2005[J] · Jaids-J Acq Tmm Def,2008, 47(2):234-240. [3]Ghanem, K.G. , Erbelding, E. J. , Wiener, Z. S. , et al. Serological response to syphilis treatmentin HIV-positive and HIV-negative patients attending sexually transmitteddiseases clinics [J]. Sex Transm Infect, 2007，83 (2) :97_101.),使得梅毒的控制越發(fā)困難而且重要。無(wú)疑，人們對(duì)梅毒的防控過(guò)于樂(lè)觀，對(duì)梅毒的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。盡管青霉素成功應(yīng)用于治療各期梅毒已經(jīng)有50年歷史，但治療失敗可見(jiàn)于任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法的選擇[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，. 20(10): 1491-1494)在對(duì)健康體檢者、門診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)，這些人群存在一定比例的梅毒感染率，推測(cè)本地區(qū)人群梅毒的檢出率應(yīng)該在2. 59%以上。顯然，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒正以過(guò)去500年任何國(guó)家和地區(qū)都未曾有過(guò)的速度在中國(guó)傳播，由于存在隱性感染以及無(wú)法統(tǒng)計(jì)的私人診所患者患病率，目前看到的梅毒發(fā)病率或許只是梅毒現(xiàn)狀的冰山一角([5]Lin, L. R. , Fu, Z. G. , Dan, B. , Jing, et al. Developmentof a colloidal gold—immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPNl7and TPN47[J]. Diagn Micr InfecDis, 2010，68(3) : 193-200. [6]Tucker JD, C. X. , Peeling RW. Syphilis and socialupheaval in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(18):1658-1661. [7]Chen, Z. Q. , Zhang, G.C. , Gong, X. D. , Lin, C. , Gao, X. , Liang, G. J. , Chen, X. S. , and Cohen, M. S. Syphilis inchina:Results of a national surveillance programme[J]. Lancet, 2007, 369:132-138.[8]Li-Rong Lin,Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al. Evaluation of a colloidalgold—immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specifcIgM antibody in syphilis serofast reaction patients:a serologic marker for therelapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease. 2011, 70:10-16)。實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷梅毒必不可少的方法，也是判斷療效和復(fù)發(fā)的重要依據(jù)，包括暗視野顯微鏡檢查和血清學(xué)試驗(yàn)。梅毒螺旋體感染早期，梅毒抗體還未產(chǎn)生或含量較低時(shí)，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但敏感度較低，且易受肛門周圍非致病螺旋體的影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測(cè)兩大類型。反應(yīng)素檢測(cè)對(duì)早期梅毒檢測(cè)靈敏度不高，而且生物假陽(yáng)性率較高，是主要用于療效觀察的一項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)([9]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)TRUST/TPPA與IgM抗體聯(lián)合檢測(cè).中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志.2010，152(05):446-448)。梅毒特異性抗體檢測(cè)的敏感性和特異性均較反應(yīng)素高。但是，梅毒特異性抗體檢測(cè)仍然存在著靈敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測(cè)到梅毒患者各類組織、體液中存在梅毒螺旋體，能證明梅毒螺旋體存在，那么這些棘手問(wèn)題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官，少量梅毒螺旋體即可導(dǎo)致兔睪丸炎，因此，兔感染試驗(yàn)被視為梅毒螺旋體檢測(cè)的最靈敏的方法。然而，兔感染試驗(yàn)操作繁瑣，觀察時(shí)間要求3個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能得到結(jié)果，臨床可操作性差。PCR擴(kuò)增技術(shù)以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴(kuò)增模板，通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了病原體的快速檢測(cè)，具有高效、靈敏和特異等優(yōu)勢(shì)。從理論上分析，通過(guò)優(yōu)化、改良PCR擴(kuò)增技術(shù)，其檢測(cè)的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗(yàn)，而檢測(cè)時(shí)間僅僅需要2個(gè)小時(shí)([10]HAYP E, CLARKE JR,TAYL0R-R0BINS0N D, et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patientswith syphilis and hiv infection using the polymerase chain reaction [J].Genitourin Med, 1990，66 (6) : 428-32)，有望成為解決這些棘手問(wèn)題的最佳方法。.盡管國(guó)內(nèi)外有些企業(yè)研發(fā)出梅毒PCR檢測(cè)試劑，但尚未有進(jìn)入臨床應(yīng)用的有注冊(cè)文號(hào)PCR檢測(cè)試劑，而僅僅停留在科研應(yīng)用。更嚴(yán)重的是，目前的PCR檢測(cè)試劑在研發(fā)過(guò)程中由于未經(jīng)嚴(yán)格的比對(duì)試驗(yàn)，無(wú)一例外的存在靈敏度和特異性嚴(yán)重不足，其準(zhǔn)確性不高，是目前梅毒PCR技術(shù)在臨床中應(yīng)用的瓶頸。
flaA 鞭毛基因(flagellar filament outer layer protein gene)編碼鞭毛鞘蛋白，該基因擁有聞保守基因序列，僅在螺旋體中存在，有研究將此基因作為祀基因，檢測(cè)標(biāo)本中梅毒螺旋體 DNA([11] Isaacs R D, Radolf J. Expression in escherichia coli ofthe 37_kilodalton endoflagellar sheath protein of treponema pallidum by useof the polymerase chain reaction and a t7expression system[J]. Infection andimmunity, 1990, 58 (7) : 2025-2034.)。flaA鞭毛基因在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經(jīng)梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻(xiàn)血員、孕產(chǎn)婦、婚前體檢、手術(shù)患者和輸血前篩查等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，有著目前常用的血清學(xué)檢測(cè)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
所述梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含fla-A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。所述耐熱DNA聚合酶瓶可采用Tag酶瓶。所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。所述6個(gè)含fla-A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度可分別為I. O X 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和l.OX 107copies/mL,共 6 個(gè)濃度。所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和fla_A基因引物、探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有3’ 一 5’ DNA聚合酶活性、5’ 一 3’ DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。所述梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟I)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(kù)(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體fla_A基因，fla_A基因探針和引物的設(shè)計(jì)米用 PCR 引物探針設(shè)計(jì)軟件 primer premier 5.0、Oligo 6· O、TM Utility vl. 3> ClustalX等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE(10mM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM TA)溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存；2) fla-A基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的fla-A基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置lmin，力口入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并_20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；
3) fla-A基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，其具體方法如下包含fla-A基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋，以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍；4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、fla-A基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液；5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液IOOml 經(jīng) 5000r/min, 4°C離心 5min,以 IOml 緩沖液 I 重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;力口入5ml緩沖液II，75°C水浴45min,4°C, 15000r/min離心IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá)30%,4°C,1500r/min離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA ；7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本；制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品；8)制備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。在步驟I)中，所述fla-A基因探針和引物的序列如表I所示；表I
靶基因序列名稱引物/探針序列_
I:游I 物.IS1-CGTGGAAGGATTTCCGAAAGGAGCr1TTTGA-S'
fh A I、·;游iJ I秒丄! F列 5'-CCCTGtAG ACCCAΓCCGACCC；TC；-3,
_光探計(jì) 11·列 S'-FAM-AAGACAAAGGGTATGCCAC-BHQ I -3'所述ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)可采用Nanedrop，美國(guó)產(chǎn)品，所述濃度測(cè)定的終濃度可為50μΜ。在步驟2)中，所述紫外分光光度計(jì)可采用752型紫外分光光度計(jì)。在步驟3)中，所述梯度稀釋可選 I. OX 102copies/mL、I. OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL>l.OX 105copies/mL>l.OX 106copies/mL>l.OX 107copies/mL 6 個(gè)濃度作標(biāo)準(zhǔn)品。 在步驟4)中，所述PCR緩沖液為pH=5. (TlO. O之間的穩(wěn)定緩沖時(shí)，最適ρΗ=7· 0 9· O ;引物的濃度為25ρπι01/μ L，熒光探針的濃度為20pmol/yL, dNTPs的濃度為2mmol/L ;續(xù)離子的濃度為15 20mmol/L。在步驟5)中，所述緩沖液 I 可為 50mmol/L tris-HCl, 50mmoI /T, Glucose, lmmol/LEDTA, pH8. 0 ;所述緩沖液 II可為 5mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/LPMSF, 0. 5%Tween 20,0. 5%NP 40 ;所述緩沖液III可為 50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/LKCl,lmmol/L DTT, 0. 5%PMSF, 50% 甘油。在步驟6)中，所述樣本可包括組織、全血、分泌物等臨床標(biāo)本；所述分泌物可包括皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分等的分泌物。在步驟8)中，耐熱DNA聚合酶的用量可為8 10U/反應(yīng)。flaA鞭毛基因(flagellar filament outer layer protein gene)編碼鞭毛鞘蛋 白，該基因擁有聞保守基因序列，僅在螺旋體中存在，有研究將此基因作為祀基因，檢測(cè)標(biāo)本中梅毒螺旋體DNA。flaA鞭毛基因在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經(jīng)梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻(xiàn)血員、孕產(chǎn)婦、婚前體檢、手術(shù)患者和輸血前篩查等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，有著目前常用的血清學(xué)檢測(cè)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I為本發(fā)明所述梅毒螺旋體f I a-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的組裝示意圖。在圖I中，I 6分別為6個(gè)含fla-A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶(標(biāo)準(zhǔn)品的6個(gè)濃度分別為 I. O X 102copies/mL、I. O X 103copies/mL、l.OX 104copies/mL、l.OX 105copies/mL、
I.OX 106copies/mL和I. 0X 107copies/mL) ；7為PCR反應(yīng)液瓶；8為含收集管的離心柱；9為陰性質(zhì)控品瓶；10為陽(yáng)性質(zhì)控品瓶；11為Tag酶瓶；12為蛋白酶K瓶；13為裂解液瓶；14為無(wú)水乙醇瓶；15為抑制物去除液瓶；16為第I清洗緩沖液瓶；17為洗脫液瓶；18為第2清洗緩沖液；19為外包裝盒。圖2為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果。在圖2中。橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品濃度copies/mL，縱坐標(biāo)代表閾值循環(huán)數(shù);標(biāo)記·:標(biāo)準(zhǔn)品 Slope -3. 533205，intercept 45. 18945，R2 0. 999687。圖3為本發(fā)明建立的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)的擴(kuò)增曲線。在圖3中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為較正后的熒光強(qiáng)度；其中I 3為梅毒螺旋體陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，4 5為梅毒螺旋體陰性擴(kuò)增曲線，6為閾值線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。參見(jiàn)圖I，本發(fā)明所述梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)施例設(shè)有6個(gè)含fla-A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶(標(biāo)準(zhǔn)品的6個(gè)濃度分別為I. O X 102copies/mL,
I.OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和1.0X107copies/mL) I 6、PCR反應(yīng)液瓶7、含收集管的離心柱8、陰性質(zhì)控品瓶9、陽(yáng)性質(zhì)控品瓶10、Tag酶瓶11、蛋白酶K瓶12、裂解液瓶13、無(wú)水乙醇瓶14、抑制物去除液瓶15、第I清洗緩沖液瓶16、洗脫液瓶17、第2清洗緩沖液18和外包裝盒19。所述6個(gè)含fla_A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶I 6、PCR反應(yīng)液瓶7、含收集管的離心柱8、陰性質(zhì)控品瓶9、陽(yáng)性質(zhì)控品瓶10、Tag酶瓶11、蛋白酶K瓶12、裂解液瓶13、無(wú)水乙醇瓶14、抑制物去除液瓶15、第I清洗緩沖液瓶16、洗脫液瓶17和第2清洗緩沖液18均布在外包裝盒19內(nèi)。其中PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因的引物探針混合物。其中所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有3’ 一 5’ DNA聚合酶活性，5’ 一 3’ DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫度的聚合酶。所述的耐熱聚合酶最好是95半衰期>45min的高溫聚合酶。質(zhì)控品包含陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。所述梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試 劑盒的制備方法，包括以下步驟I)靶基因篩選從GENBANK中篩選梅毒螺旋體高特異性、高靈敏度的fla_A基因。fla_A基因的引物、突光探針的設(shè)計(jì)米用 primer premier 5. 0、01igo 6. 0、TM Utility vl. 3、Clustal X等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性。合成的引物和探針用TE (IOmMTri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA)溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)(Nanedrop，美國(guó))進(jìn)行濃度測(cè)定，并將終濃度調(diào)成50 μ M，-20°C保存。2) fla-A基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的fla-A基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置Imin，加入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用752型紫外分光光度計(jì)定量并-20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。3) fla-A基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作包含fla-A基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260 X 50 X 2 X 100 X IO-6 X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行一定比例梯度稀釋，選 I. O X 102copies/mL、l.OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL、l.OX 105copies/mL、l.OX 106copies/mL、l.OX 107copies/mL 6 個(gè)濃度作標(biāo)準(zhǔn)品，分別以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍。4) PCR反應(yīng)液制備PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因引物探針混合物共同組成PCR反應(yīng)液。5)耐熱DNA聚合酶的制備大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液菌懸液 IOOml 經(jīng) 5000r/min, 4°C 離心 5min,以 IOml 緩沖液 I (50mmol/Ltris-HCl, SOmmoI /LGlucose, lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml緩沖液II (5mmol/L Tris2HCl,50mmol/L KCl,lmmol/L EDTA,lmmol/L PMSF,0. 5%Tween20,0. 5%NP40)，75°C水浴 45min,4°C,15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá) 30%,4°C, 1500r/min 離心 lOmin。沉淀溶于 Iml 緩沖液III (50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/L KCl, lmmol/LDTT, 0. 5%PMSF，50%甘油)中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存。6)樣品處理方法的建立
使用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本主要包括組織、全血、分泌物(皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物)等臨床標(biāo)本。采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA。7)質(zhì)控品制備陰性質(zhì)控品制備選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本。陽(yáng)性質(zhì)控品制備選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品8)制備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶(Tag酶)、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。以下給出采用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者的臨床標(biāo)本I.標(biāo)本處理I. I分泌物(皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物)加入ImL滅菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子；吸取全部液體轉(zhuǎn)至I. 5mL離心管中，12，OOOrpm離心5min ;去上清，沉淀加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上清,沉淀備用。I. 2硬下疳及皮損部位組織標(biāo)本用適量滅菌生理鹽水清洗送檢組織沾帶的血液；取約50mg組織，加ImL滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻漿，轉(zhuǎn)移至I. 5mL離心管中，12, OOOrpm離心5min ;去上清,沉淀加滅菌生理鹽水ImL混勻，12, OOOrpm離心5min ;去上清，沉淀備用。I. 3全血肝素抗凝靜脈血5mL，加等量的生理鹽水懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫中，水平離心500g 20min。吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個(gè)核細(xì)胞，盡量全部吸出PBMC。加I 2倍量Hanks液(洗滌液)，混勻后離心200 Xg lOmin，低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板，去上清液。用同樣洗滌液洗滌細(xì)胞2次，每次離心500Xg lOmin，洗去殘留的淋巴細(xì)胞分離液，沉淀備用。2.質(zhì)控品處理取出陰性質(zhì)控品，8，OOOrpm離心數(shù)秒，100 μ L質(zhì)控品加入等量DNA濃縮液充分混勻；去上清，沉淀加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上清,沉
淀備用。3. DNA提取(娃膠膜_離心柱法)用200 μ L的生理鹽水懸浮沉淀，加入50 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L的裂解液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，37°C溫育20min ；加入200 μ L無(wú)水乙醇，漩渦振蕩15s以充分混勻；將混合液全部吸至離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩沖液I加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩沖液II加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將離心柱_收集管于室溫下最大轉(zhuǎn)速離心3min ;將離心柱取出，放置于新的I. 5mL離心管。打開離心柱蓋子,60°C放置2min (使用干式恒溫器，不能使用水浴鍋)；在離心柱的膜的正上方小心加入60°C預(yù)熱的洗脫液50μ L,蓋緊管蓋,室溫靜置Imin后，12，OOOrpm離心lmin。離心管內(nèi)即為核酸溶液,建議立即使用，如需保存，置于-20°C。4.標(biāo)準(zhǔn)品處理8，OOOrpm離心數(shù)秒，備用。5. PCR擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入2μ L處理后的樣品(包括樣本、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品)40μ L的PCR反應(yīng)液和3μ L的Taq酶，8，OOOrpm離心數(shù)秒，放入PCR儀器樣品槽進(jìn)行擴(kuò)增；95°C IOmin; 95 °C 15s, 55 °C 2min，72°C 30s (共 10 個(gè)循環(huán))；95°C 15s, 50 °C 20s,72°C 20s (共40個(gè)循環(huán))。6.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)，計(jì)算得到各待測(cè)標(biāo)本中的梅毒DNA的量(copies/mL)。所述的熒光定量PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)對(duì)PCR系統(tǒng)(例如7000,7300，7500，7900 等)；BioRad 實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系統(tǒng)、Roche 的 iCycler 等。以下給出梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的性能檢定I)精密度試驗(yàn)對(duì)同一樣本每天進(jìn)行I批次檢測(cè)，每批重復(fù)檢測(cè)2次，共進(jìn)行20天。收集20天的有效數(shù)據(jù)，進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)。2)分析靈敏度以 2000copies/mL、1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL4個(gè)濃度樣品每天重復(fù)8次檢測(cè)，連續(xù)做3次，95%檢出陽(yáng)性的最低濃度值為分析靈敏度。3)特異性臨床常見(jiàn)泌尿生殖道感染患者分泌物標(biāo)本150例，其中淋病50例、支原體感染50例、尖銳濕疣50例，分別進(jìn)行DNA提取，熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)做梅毒患者和正常人生殖道拭子為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)方法的特異性。4)線性范圍根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，維持相關(guān)系數(shù)在O. 97以上，判斷方法的線性范圍。5)試劑穩(wěn)定性用兩個(gè)濃度水平臨床樣本，每個(gè)濃度水平樣本重復(fù)測(cè)定至少6次，計(jì)算平均值。新配制及穩(wěn)定期末工作液應(yīng)在同次運(yùn)行中測(cè)定，將儀器帶來(lái)的不精密度減到最小。測(cè)定新配制的試劑工作液和穩(wěn)定期末試劑工作液兩組平均值之間的一致性。以下給出具體實(shí)施例。實(shí)施例II)靶基因篩選參考文獻(xiàn)，從GENBANK中篩選梅毒螺旋體高特異性、高靈敏度的f Ia_A基因。fla-A基因引物、突光探針的設(shè)計(jì)采用primer premier 5. 0、01igo 6. 0、TM Utility vl. 3、Clustal X等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性。合成的引物和探針用 TEdOmM Tri-HCl, ρΗ5· 0,0. ImM TA)溶解，使用 ND-1000UV-VIS 波長(zhǎng)紫外 /可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)(Nanedrop，美國(guó))進(jìn)行濃度測(cè)定，并將終濃度調(diào)成50 μ M，-20°C保存。2) fla-A基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的fla-A基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置Imin，加入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR、Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用752型紫外分光光度計(jì)定量并_20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。3) fla-A基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作包含fla-A基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260 X 50 X 2 X 100 X IO-6 X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行一定比例梯度稀釋，選 I. O X 102copies/mL、l.OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL、l.OX 105copies/mL、l.OX 106copies/m L、l.OX 107copies/mL 6 個(gè)濃度作標(biāo)準(zhǔn)品，分別以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍。4) PCR反應(yīng)液制備PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因引物探針混合物共同組成PCR反應(yīng)液。5)耐熱DNA聚合酶的制備大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液菌懸液 IOOml 經(jīng) 5000r/min, 4°C 離心 5min,以 IOml 緩沖液 I (50mmol/Ltris-HCl, SOmmoI /LGlucose, lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml緩沖液
II(5mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,lmmol/L EDTA,lmmol/L PMSF,0. 5%Tween20,0. 5%NP40)，75°C水浴 45min,4°C,15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá) 30%,4°C, 1500r/min 離心 IOrnin0 沉淀溶于 Iml 緩沖液III (50ml mol/LTris-HCl, 10mmol/L KCl, lmmol/LDTT, 0. 5%PMSF，50%甘油)中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，_20°C凍存。6)樣品處理方法的建立使用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本主要包括組織、全血、分泌物(皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物)等臨床標(biāo)本。采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA。7)質(zhì)控品制備陰性質(zhì)控品制備選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本。陽(yáng)性質(zhì)控品制備選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品8)制備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶(Tag酶)、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。9)標(biāo)本處理生殖泌尿道分泌物棉拭子加入ImL滅菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子；吸取全部液體轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中，12，000印111離心51^11 ;去上清，沉淀加滅菌生理鹽水ImL混勻，12, OOOrpm離心5min ;去上清,沉淀備用。10)質(zhì)控品處理取出陰性質(zhì)控品，8，OOOrpm離心數(shù)秒，100 μ L質(zhì)控品加入等量DNA濃縮液充分混勻；去上清，沉淀加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上清，沉淀備用。IDDNA提取(硅膠膜-離心柱法):用200 μ L的生理鹽水懸浮沉淀，加入50 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L的裂解液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，37°C溫育20min ；加入200 μ L無(wú)水乙醇，漩渦振蕩15s以充分混勻；將混合液全部吸至離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩沖液I加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩沖液II加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將離心柱_收集管于室溫下最大轉(zhuǎn)速離心3min ;將離心柱取出，放置于新的I. 5mL離心管。打開離心柱蓋子,60°C放置2min (使用干式恒溫器，不能使用水浴鍋)；在離心柱的膜的正上方小心加入60°C預(yù)熱的洗脫液50 μ L,蓋緊管蓋,室溫靜置Imin后，12，OOOrpm離心lmin。離心管內(nèi)即為核酸溶液,建議立即使用，如需保存，置于-20°C。12)標(biāo)準(zhǔn)品處理8，OOOrpm離心數(shù)秒，備用。13) PCR擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入2μ L處理后的樣品(包括樣本、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品)40 μ L的PCR反應(yīng)液和3 μ L的Taq酶，8，OOOrpm離心數(shù)秒，放入PCR儀器樣品槽進(jìn)行擴(kuò)增；95°C IOmin; 95 °C 15s, 55 °C 2min，72°C 30s (共 10 個(gè)循環(huán))；95°C 15s, 50 °C 20s,72°C 20s (共40個(gè)循環(huán))。14)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到各待測(cè)標(biāo)本中的梅毒DNA的量(copies/mL)實(shí)施例2與實(shí)施例I相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本為硬下疳及皮損部位組織標(biāo)本，標(biāo)本用適量滅菌生理鹽水清洗送檢組織沾帶的血液；取約50mg組織，加ImL滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻衆(zhòng)，轉(zhuǎn)移至I. 5mL離心管中，12，OOOrpm離心5min ;去上清,沉淀加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上清，沉淀的DNA提取和PCR擴(kuò)增同實(shí)施例I。實(shí)施例3與實(shí)施例I相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本為全血，肝素抗凝靜脈血5mL，加等量的生理鹽水懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫中，水平離心500g20min。吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個(gè)核細(xì)胞，盡量全部吸出PBMC。加I 2倍量Hanks液(洗滌液)，混勻后離心200 Xg lOmin，低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板,去上清液。用同樣洗滌液洗滌細(xì)胞2次，每次離心500Xgl0min，洗去殘留的淋巴細(xì)胞分離液，沉淀的DNA提取和PCR擴(kuò)增同實(shí)施例I。實(shí)施例4性能驗(yàn)證試驗(yàn)按實(shí)施例I的方案制備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，然后進(jìn)行性能驗(yàn)證。I)精密度試驗(yàn)對(duì)同一樣本每天進(jìn)行I批次檢測(cè),每批重復(fù)檢測(cè)2次，共進(jìn)行20天。收集20天的有效數(shù)據(jù)，進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)。2)分析靈敏度以 2000copies/mL、1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL4個(gè)濃度樣品每天重復(fù)8次檢測(cè)，連續(xù)做三次，95%檢出陽(yáng)性的最低濃度值為分析靈敏度。
3)特異性臨床常見(jiàn)泌尿生殖道感染患者分泌物標(biāo)本150例，其中淋病50例、支原體感染50例、尖銳濕疣50例，分別進(jìn)行DNA提取，熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)做梅毒患者和正常人生殖道拭子為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)方法的特異性。4)線性范圍根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，維持相關(guān)系數(shù)在O. 97以上，判斷方法的線性范圍。5)試劑穩(wěn)定性用兩個(gè)濃度水平臨床樣本，每個(gè)濃 度水平樣本重復(fù)測(cè)定至少6次，計(jì)算平均值。新配制及穩(wěn)定期末工作液應(yīng)在同次運(yùn)行中測(cè)定，將儀器帶來(lái)的不精密度減到最小。測(cè)定新配制的試劑工作液和穩(wěn)定期末試劑工作液兩組平均值之間的一致性。
權(quán)利要求
1.梅毒螺旋體fIa-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述梅毒螺旋體f Ia-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含fla-A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。
2.如權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述耐熱DNA聚合酶瓶采用Tag酶瓶；所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品； 所述6個(gè)含fla-A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度可分別為I. OX 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和l.OX 107copies/mL,共 6 個(gè)濃度。
3.如權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和fla_A基因引物、探針組成的混合物； 所述耐熱DNA聚合酶具有3’ 一 5’ DNA聚合酶活性、5’ 一 3’ DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。
4.如權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)靶基因篩選，具體方法如下 從基因庫(kù)中篩選梅毒螺旋體fla-A基因，fla-A基因探針和引物的設(shè)計(jì)采用PCR引物探針設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存，所述TE為IOmM Tri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA ； 2)fla-A基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下 以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的fla-A基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置lmin，加入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并-20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品； 3)fla-A基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，其具體方法如下 包含fla-A基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取IOyL質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋，以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍； 4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下 采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、fla-A基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液；5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下 大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液IOOml經(jīng)5000r/min, 4°C離心5min,以IOml緩沖液I重懸菌液，4°C, 5000r/min,離心5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml緩沖液II，75°C水浴 45min, 4°C, 15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá) 30%, 4°C, 1500r/min 離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存； 6)建立樣品處理方法，其具體方法如下 使用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜_離心柱法提取模板DNA ； 7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下 制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本； 制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品； 8)制備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述fla-A基因探針和引物的序列如下所示 靶基因序列名稱引物/探針序列 I-JI 物,I5'~CGTGGAAGGATTTCCGAAAGGAGCGTTTGA-3' Λ 4 KMi; iJ I 勿!列5'-CCCTGC AGTACCCATCCG.ACCCTC-3' 尖光深計(jì).)r;列5'-FAM-AAGACAAAGGGTATGCC AC-BHQI -3'
6.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體fIa-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述梯度稀釋選I. OX 102copies/mL、I. OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL>l.OX 105copies/mL>l.OX 106copies/mL>l.OX 107copies/mL 6 個(gè)濃度作標(biāo)準(zhǔn)品。
7.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述PCR緩沖液為pH=5. (TlO. O之間的穩(wěn)定緩沖時(shí)，ρΗ=7. (T9. O ;引物的濃度為25ρπι01/μ L，熒光探針的濃度為20ρπιΟ1/μ L，dNTPs的濃度為2mmol/L ;鎂離子的濃度為 15 20mmol/Lo
8.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟 5)中，所述緩沖液 I 為 50mmol/L tris-HCl, 50mmoI /T, Glucose, lmmol/L EDTA,ρΗ8· 0 ;所述緩沖液 II 為 5mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/L PMSF,0.5%Tween 20,0. 5%NP 40 ;所述緩沖液III為 50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/L KCl, lmmol/LDTT, 0. 5%PMSF, 50% 甘油。
9.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述樣本包括組織、全血、分泌物臨床標(biāo)本；所述分泌物可包括皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物。
10.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟8)中，耐熱DNA聚合酶的用量為8 IOU/反應(yīng)。
全文摘要
梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒及其制備，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含fla-A基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。先篩選靶基因，再構(gòu)建fla-A基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，制作fla-A基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線后，再制備PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶，建立樣品處理方法后制備質(zhì)控品，最后完成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102634451SQ201210140509
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者劉莉莉, 張長(zhǎng)弓, 徐竟波, 楊天賜, 林麗蓉, 童曼莉 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院