專利名稱：一種提高植物發(fā)酵沼氣產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3-葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌和應(yīng)用工程菌提高植物發(fā)酵沼氣產(chǎn)量的方法。具體是一種應(yīng)用攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3-葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌對植物原料進(jìn)行預(yù)處理以及與天然的沼氣發(fā)酵微生物共同厭氧消化植物生產(chǎn)沼氣的方法。
背景技術(shù)：
沼氣是一些有機(jī)物質(zhì)在一定的溫度、濕度、酸度條件下，隔絕空氣，經(jīng)微生物發(fā)酵而產(chǎn)生的一種以甲烷為主的可燃混合氣體，是一種有多種用途的可再生能源。它能夠代替石化燃料而應(yīng)用于動力和熱的產(chǎn)生，也能作為車用燃?xì)猓€能替代天然氣作為生產(chǎn)一些化學(xué)制劑的原料。通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣是一條CO2零排放的生產(chǎn)途徑。沼氣發(fā)酵必須有微生物參與。沼氣發(fā)酵微生物是一個統(tǒng)稱,包括發(fā)酵性細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌、食氫產(chǎn)甲烷菌、食乙酸產(chǎn)甲烷菌五大類群。植物物質(zhì)(包括農(nóng)林廢棄物，能源作物和水生植物等)是生產(chǎn)沼氣的主要原料來源，由于能夠通過光合作用而再生，資源十分的豐富。然而，在沼氣發(fā)酵中，植物的發(fā)酵時間較長，有效成分轉(zhuǎn)化為沼氣的效率較低，通常小于50%。植物的粗纖維約占植物總物質(zhì)的70 80%。粗纖維主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素物質(zhì)，其中纖維素所占的比例最大。纖維素和半纖維素水解后生成能被沼氣發(fā)酵微生物食物鏈中之下游微生物所能利用的糖。但是纖維素分子之間被木質(zhì)素鑲嵌，被鑲嵌著的纖維素不能被水解。木質(zhì)素是由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元通過醚鍵、碳-碳鍵聯(lián)結(jié)而成的高分子化合物。用物理、化學(xué)或生物的方法于發(fā)酵之前對植物材料進(jìn)行預(yù)處理使木質(zhì)素水解，但是其作用很難達(dá)到完全。植物發(fā)酵沼氣的預(yù)處理是其生產(chǎn)過程的瓶頸問題之一，是研究的熱點(diǎn)之一。當(dāng)前，對植物原料的預(yù)處理的物理法主要是機(jī)械粉碎法、高溫?zé)峤忸A(yù)處理以及輻射預(yù)處理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊設(shè)備；化學(xué)處理法具有工藝簡單、效率高等特點(diǎn)，但所需無機(jī)酸、堿濃度高，處理后的纖維素和半纖維素?fù)p失大(回收率僅約50% )。與化學(xué)法預(yù)處理和物理法預(yù)處理相比，生物法具有反應(yīng)溫和、能耗較小，設(shè)備簡單，不會帶來環(huán)境污染等諸多優(yōu)點(diǎn)。復(fù)合菌種方法和白腐真菌方法是生物法預(yù)處理植物原料的主要研究方向。前者一般包括多株具有分解木質(zhì)素的微生物及由霉菌、細(xì)菌和放線菌等多種微生物組成的輔助功能菌的聯(lián)合應(yīng)用。其優(yōu)勢在于能夠在分泌木質(zhì)素酶上互補(bǔ)，使形成完整的木質(zhì)素酶系，并且在生長上相互依存。但是，由于這些微生物的種類不同，其生長條件(包括溫度的需求、酸堿度的需求和營養(yǎng)的需求)不可能一致，難于實(shí)現(xiàn)高效的表達(dá)酶。后者是應(yīng)用含木質(zhì)素酶的白腐真菌進(jìn)行預(yù)處理。這種方法的優(yōu)勢在于，白腐真菌有完整的木質(zhì)素酶系，但是白腐真菌生長緩慢，需較長的預(yù)處理過程。木質(zhì)素酶系由木質(zhì)素過氧化物酶，猛過氧化物酶和漆酶組成。木質(zhì)素酶系具有分解木質(zhì)素的功能。纖維素酶系由葡聚糖內(nèi)切酶，葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶組成。纖維素在纖維素酶系的協(xié)同作用下水解成葡萄糖。近些年來，人們十分關(guān)注酶對于沼氣發(fā)酵的作用。即在沼氣生產(chǎn)的過程中(包括預(yù)處理和發(fā)酵過程)加入相關(guān)的酶。加酶的方法能夠較好地提高沼氣的產(chǎn)量，但是價格昂貴?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)營養(yǎng)要求低，繁殖迅速，是對環(huán)境無害的微生物，能分泌表達(dá)蛋白，并且兼性厭氧，對溫度和酸堿環(huán)境的耐受范圍較廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決當(dāng)前的植物原料發(fā)酵沼氣的木質(zhì)素和纖維素不能有效地被水解的問題，根據(jù)木質(zhì)素酶系具有水解木質(zhì)素的作用，纖維素酶系具有水解纖維素為葡萄糖的作用，通過分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架，猛過氧化物酶基因表達(dá)框、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架，葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3-葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌 工程菌，而提供一種應(yīng)用枯草芽孢桿菌工程菌進(jìn)行植物原料沼氣發(fā)酵的預(yù)處理以及與天然的沼氣發(fā)酵微生物共同厭氧消化植物生產(chǎn)沼氣的方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種提高植物發(fā)酵沼氣產(chǎn)量的方法，其步驟是I構(gòu)建含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒。I. I應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆白腐真菌(White rot fungi)的木質(zhì)素過氧化物酶基因和猛過氧化物酶基因；應(yīng)用PCR技術(shù)克隆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的漆酶基因；應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆木霉(Trichoderma)的葡聚糖內(nèi)切酶基因、葡聚糖外切酶基因和￠-葡萄糖苷酶基因。I. 2獲得構(gòu)建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒所需的啟動子、信號肽、轉(zhuǎn)錄終止子、抗性基因、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、革蘭氏陽性桿菌復(fù)制起點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因和G418抗性基因。I. 3構(gòu)建如附圖的含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒。(說明.表達(dá)框架的DNA序列組成啟動子-信號肽-基因-轉(zhuǎn)錄終止子)2.構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌。2. I應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法將含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和^-葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子)。2. 2篩選高表達(dá)木質(zhì)素過氧化物酶、猛過氧化物酶、漆酶、葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和3-葡萄糖苷酶的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子作為枯草芽孢桿菌工程菌。
3.將枯草芽孢桿菌工程菌應(yīng)用于植物材料的沼氣生產(chǎn)。3. I將枯草芽孢桿菌工程菌應(yīng)用預(yù)處理植物材料。3. 2將枯草芽孢桿菌工程菌與天然的沼氣發(fā)酵微生物共同厭氧消化植物生產(chǎn)沼氣。本發(fā)明的提高植物發(fā)酵沼氣產(chǎn)量的方法的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于針對植物原料生產(chǎn)沼氣的木質(zhì)素不能有效地被水解，纖維素不能有效地被利用，致使原材料利用率低，沼氣生產(chǎn)效率低，從而制約應(yīng)用植物原料生產(chǎn)沼氣產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題，而構(gòu)建攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草·芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌，賦予其工程菌表達(dá)完整的木質(zhì)素酶系和纖維素酶系的能力，并將這一工程菌應(yīng)用于植物原料發(fā)酵沼氣的預(yù)處理以及與天然的沼氣發(fā)酵微生物共同厭氧消化植物生產(chǎn)沼氣，起到加強(qiáng)植物原料的木質(zhì)素的水解和纖維素的糖化作用，提高原材料利用率，提高沼氣產(chǎn)量的作用。


附圖.含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒。A.巨大枯草芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子；S. a因子信號肽；Gl.白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因；G2.白腐真菌的猛過氧化物酶基因；G3.枯草芽孢桿菌的漆酶基因；G4.木霉的葡聚糖內(nèi)切酶基因；G5.木霉的葡聚糖外切酶基因；G6.木霉的￠-葡萄糖苷酶基因；T.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418抗性基因(應(yīng)用于篩選枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；G+ori.革蘭氏陽性菌復(fù)制起點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面采用非限定性實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例一I. I.構(gòu)建含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒。I. I. I構(gòu)建克隆載體由專業(yè)的DNA序列合成公司合成含革蘭氏陽性菌復(fù)制起點(diǎn)、多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過T4DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為pPB。1.1.2克隆木質(zhì)素過氧化物酶，猛過氧化物酶，漆酶基因，葡聚糖內(nèi)切酶，葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶基因。I. I. 2. I用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因和猛過氧化物酶基因合成如下PCR引物
引物I. 5’ tcgaattcgccacctgttccaacggcaagaccgtcggc3’ [說明弓丨物 5’端的 8 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]引物2. 5’ CAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCGCTG3，[說明5’ 端的 10 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的8個堿基)]引物3. 5’ tt￡aattcgcggtctgccccgacggcacccgcgtcagcc3> [說明引物 5’ 端的8個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]引物4. 5’ CTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACCGGG3’ [說明5’ 端的 10 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的8個堿基)]應(yīng)用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌屬的總RNA，以總RNA為模板，應(yīng)用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物3和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的猛過氧化物酶基因序列I. 1.2.2用PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列合成如下PCR引物引物I. 5’ CGCCTAGGatgacacttgaaaaatttgtggatgctctccc 3’ [說明5’ 端的 8 個堿基是酶護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]引物2. 5 ’ CAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATATCCATCGG 3 ’ [說明5 ’ 端的 10 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的8個堿基)]提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，用引物I和2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌漆酶基因序列。I. I. 2. 3用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增木霉的葡聚糖內(nèi)切酶基因、葡聚糖外切酶基因和@葡萄糖苷酶基因合成如下引物引物a:5' tcgaattcccgaattccagcagactg3;[說明5’ 端的 8 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]引物b:5' ttGCGGCCGCatgcggccgcctactttc3'[說明5’端的 10 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的8個堿基)]引物c:5' gcgaattcccgaattccaagcttgct3;[說明5’ 端的 8 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]引物d 5/ aaGCGGCCGCcagcggccgcttacaggaa3 [說明5’ 端的 10 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的8個堿基)]引物e:5' ccgaattcgcgctacgtagttgtacct 3'[說明 5’端的 8 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]引物f:5' tagcggccgcataagcggccgcctac 3'[說明5’ 端的 10 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的8個堿基)]
應(yīng)用RNA提取試劑盒提取木霉的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA。以上述合成的木霉的cDNA為模板，應(yīng)用引物a和引物b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是木霉的葡聚糖內(nèi)切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA為模板，應(yīng)用引物c和引物d進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是木霉的葡聚糖外切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA為模板，應(yīng)用引物e和引物f進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是木霉的P葡萄糖苷酶基因序列。I. I. 3分別構(gòu)建各種酶基因表達(dá)框架I. I. 3. I用PCR擴(kuò)增巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的三磷酸甘油醒脫氫酶啟動子序列引物I : 5 ’ CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA 3 ’ [說明引物 5 ’ 端的 8 個堿基是酶 切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]引物2 :5’ GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT 3’ [說明引物 5’ 端的 8 個堿基是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(有下劃線的6個堿基)]提取巨大芽孢桿菌的基因組DNA，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是巨大芽孢桿菌三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)出個堿基)，沒有下劃線的是三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列]:CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTA ATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACGGAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTT AGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCTGTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAG TTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGATGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTG TTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAACAAGCGCATGATTCGATTCTC ATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAAAAAATACTT TTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCCI. I. 3. 2由專業(yè)的DNA序列合成公司合成a因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(6個堿基)，沒有下劃線的是a因子信號肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCCI. I. 3. 3由專業(yè)的DNA序列合成公司合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(6個堿基)，沒有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
I. I. 3. 4用重疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(6個堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGT TTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGA AACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGGI. I. 3. 5用重疊PCR法合成如下氨芐青霉素抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(6個堿基)，沒有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列]5 ’ CCGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATA GTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGC AATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGG GCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGC TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGT CACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCC CCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCA GTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTT CTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGC CCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTCC3，I. I. 3. 6表達(dá)框架(啟動子-信號肽-基因-轉(zhuǎn)錄終止子序列)的構(gòu)建過程A.構(gòu)建木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號肽DNA序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動子序列的下游；將白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于a因子信號肽DNA序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含過氧化物酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPB1。B.構(gòu)建猛過氧化物酶基因表達(dá)框架
通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號肽DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動子序列的下游；將白腐真菌的猛過氧化物酶基因序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含猛過氧化物酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPB2。 C.構(gòu)建漆酶基因表達(dá)框架通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號肽DNA序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動子序列的下游；將枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含漆酶基因表達(dá)框架的載體稱為pPB30D.構(gòu)建葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號肽DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動子序列的下游；將木霉的葡聚糖內(nèi)切酶基因序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架的載體稱為pPB4。E.構(gòu)建葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號肽DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動子序列的下游；將木霉的葡聚糖外切酶基因序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架的載體稱為pPB5。F.構(gòu)建0葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號肽DNA序列重組于pPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動子序列的下游；將木霉的P葡萄糖苷酶基因序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PPB載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含P葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的載體稱為pPB6。1.1.4完成表達(dá)載體的構(gòu)建I. I. 4. I將6套表達(dá)框架組裝于同一個克隆載體。通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，切取pPB2，pPB3, pPB4, pPB5和pPB6載體的表達(dá)框架，并將切下的這套表達(dá)框架依次插入于pPBl的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為 pPB123456。
I. I. 4. 2通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用依次將氨芐青霉素抗性基因和G418基因重組于pPB123456載體的多克隆位點(diǎn)。構(gòu)成含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3-葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒(附圖)。將構(gòu)建的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后提取質(zhì)粒DNA。以質(zhì)粒DNA為模板，分別應(yīng)用這六個基因的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測定證明構(gòu)建的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒中含這6個酶基因；進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶酶切構(gòu)建的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒,通過對其質(zhì)粒的分子量分析，證明所構(gòu)建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒是正確的。I. 2構(gòu)建攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌。按照常規(guī)方法制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)，用電轉(zhuǎn)化方法將含木質(zhì)素過氧化物酶基 因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3-葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌感受態(tài)，將經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用的枯草芽孢桿菌細(xì)胞涂布于含G418濃度為700iig/ml的LB瓊脂平板(1%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1%氯化鈉)，37°C培養(yǎng)2天。從G418抗性平板上挑取菌落進(jìn)行增菌。將枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵表達(dá)，根據(jù)SDS-PAGE電泳初步分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標(biāo)蛋白，然后將分離純化的目標(biāo)蛋白用蛋白印跡法進(jìn)行驗(yàn)證(說明.蛋白印跡委托專業(yè)的多肽合成服務(wù)公司人工合成以上六種蛋白序列C端的35個氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應(yīng)用于蛋白印跡)證明以上所述的6種基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)和分泌到胞外。挑選不同的克隆分別用搖瓶發(fā)酵表達(dá)，應(yīng)用常規(guī)方法測定發(fā)酵液的木質(zhì)素過氧化物酶活性、猛過氧化物酶活性、漆酶活性、葡聚糖內(nèi)切酶活性、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶活性，篩選酶活性高的克隆作為攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3-葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌。I. 3應(yīng)用構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌預(yù)處理秸桿。取1000公斤水稻秸桿日曬風(fēng)干，然后粉碎秸桿長度至Icm以下。將粉碎的秸桿用水潤濕I天后，加碳銨。充分?jǐn)嚢杌旌?。將以上混合物以等量分?份，3份為實(shí)驗(yàn)組，3份為對照組1，另3份對照組2。實(shí)驗(yàn)組的每份材料中分別接種用LB培養(yǎng)培養(yǎng)0D_為I. 8的攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌的菌液(菌液接種量為1/30體積，即30份體積的秸桿-水-碳銨混合物加一份體積的菌液)；對照組I的每份材料中分別加入1/30體積的用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)的OD6tltl為I. 8的白腐真菌菌液；對照組2的每份材料中分別加入復(fù)合菌劑(說明市場上銷售的復(fù)合菌劑，復(fù)合菌劑的加入量按照復(fù)合菌劑商品說明書添加)。用塑料薄膜覆蓋，于室溫堆慪5天。分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組、對照組I和對照組2的總固體含量變化。實(shí)驗(yàn)組的平均總固體含量比對照組I的平均總固體含量和對照組2的平均總固體分別少9. 62%和9. 95%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異性分析證明，實(shí)驗(yàn)組的平均總固體含量變化與對照組I的平均總固體含量變化和對照組2的平均總固體含量變化存在顯著性差異(P < O. 05)。I. 4應(yīng)用攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和β -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌與沼氣發(fā)酵微生物共同厭氧消化秸桿生產(chǎn)沼氣。在應(yīng)用常規(guī)的復(fù)合菌劑的方法預(yù)處理的秸桿混合物，按照常規(guī)方法接種沼氣分成6份，三份為對照組，三份為實(shí)驗(yàn)組。具體的配置按表1，分別置于相同規(guī)格的沼氣發(fā)酵池中發(fā)酵15天。測量及記錄實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)驗(yàn)組2和對照組的產(chǎn)氣量至第15天，對照組平均產(chǎn)氣 量為290萬升，實(shí)驗(yàn)組平均產(chǎn)氣量為2305萬升。實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)氣量明顯多于對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明兩組產(chǎn)氣量的差異性呈顯著性差異(P < O. 01)。表I.每份發(fā)酵成分的配制
權(quán)利要求
1.一種提高植物發(fā)酵沼氣產(chǎn)量的方法，其特征在于應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因、白腐真菌的猛過氧化物酶基因，枯草芽孢桿菌的漆酶基因，木霉的葡聚糖內(nèi)切酶基因、木霉的葡聚糖外切酶基因和木霉的0葡萄糖苷酶基因；構(gòu)建含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架，猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架，葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒(含有以上所述的6種酶基因表達(dá)框架、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、革蘭氏陽性菌復(fù)制起點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因和G418抗性基因)；將以上構(gòu)建的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，篩選高表達(dá)木質(zhì)素過氧化物酶、猛過氧化物酶、漆酶、葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子作為攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的畢赤酵母工程菌；將以上所述的攜帶木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌 穿梭質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌應(yīng)用于植物生產(chǎn)沼氣的預(yù)處理以及與天然的沼氣發(fā)酵微生物共同厭氧消化植物生產(chǎn)沼氣。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的ー種提高植物發(fā)酵沼氣產(chǎn)量的方法，其特征在于，將權(quán)利I所述的攜帯木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、猛過氧化物酶基因表達(dá)框架、漆酶基因表達(dá)框架、葡聚糖內(nèi)切酶基因表達(dá)框架、葡聚糖外切酶基因表達(dá)框架和3葡萄糖苷酶基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的畢赤酵母工程菌制備成菌劑產(chǎn)品而應(yīng)用于植物發(fā)酵沼氣。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物發(fā)酵沼氣產(chǎn)量的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。首先克隆白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因和猛過氧化物酶基因，枯草芽孢桿菌的漆酶基因和木霉的葡聚糖內(nèi)切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β葡萄糖苷酶基因；構(gòu)建含以上六種基因表達(dá)框架的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒，將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌獲得工程菌；將枯草芽孢桿菌工程菌應(yīng)用于植物原料發(fā)酵沼氣的預(yù)處理過程以及與天然的沼氣發(fā)酵微生物聯(lián)合應(yīng)用于發(fā)酵植物原料生產(chǎn)沼氣過程，起到顯著提高植物原料的利用率和增加沼氣產(chǎn)量的作用。本發(fā)明解決了植物發(fā)酵沼氣中遺留的木質(zhì)素和纖維素不能有效地被水解利用的問題，有利于利用植物發(fā)酵沼氣的產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
文檔編號C12P5/02GK102719483SQ20121014194
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者尹慧祥, 屠發(fā)志, 張澤華, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 易國輝, 楊穗珊, 符仙, 羅進(jìn)賢 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所