專利名稱：一種生產(chǎn)重組混合l-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建微生物工程菌生產(chǎn)重組蛋白。具體是應(yīng)用微生物工程菌生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。
背景技術(shù)：
L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase EC 5. 3. I. 4)是由微生物產(chǎn)生的、具有變構(gòu)作用的酶。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶能催化L-阿拉伯糖為L-核酮糖；由于L-阿拉伯糖和D-半乳糖結(jié)構(gòu)的相似性，故L-阿拉伯糖異構(gòu)酶也能催化D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖。D-塔格糖是甜味劑，具有低能量，降低血糖和抗齲齒等功能。雖然多種微生物具有產(chǎn)生L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的功能，但是，當(dāng)前的塔格糖產(chǎn)品仍然是主要來源于化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成D-塔格糖的工序復(fù)雜，生產(chǎn)價(jià)格高，并且產(chǎn)生大量中間產(chǎn)品污染環(huán)境。應(yīng)用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶將廉價(jià)的D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖，操作簡(jiǎn)單，如果有合適的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶那么這一生產(chǎn)方式獲得的D-塔格糖將是價(jià)格便宜。異構(gòu)D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖的理想反應(yīng)條件是pH5. 0-6. 0，> 60°C，并且，反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)速度就越快。前者有利于減少中間副產(chǎn)品的生成，后者有利于D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖。雖然多種微生物具有產(chǎn)生L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的功能，但是，至今目前尚未發(fā)現(xiàn)符合最適PH5. 0-6. O并且最適溫度> 60°C的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，從而影響了用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶生產(chǎn)D-塔格糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。畢赤酵母(P.pastoris,)是最近迅速發(fā)展的一種真核表達(dá)宿主,營養(yǎng)要求不高，適合于大規(guī)模生產(chǎn)方式，由于畢赤酵母分泌自身的蛋白很少，有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。

發(fā)明內(nèi)容
雖然來源于新阿波羅棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶最適pH 7,最適合溫度80°C,但是在80°C和pH6的條件下其L-阿拉伯糖異構(gòu)酶仍然具有89%的它在最適溫度和最適pH條件的酶活性；雖然來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶最適pH 7. 5,最適溫度80°C,但是,在80°C和PH6的條件下其L-阿拉伯糖異構(gòu)酶仍然具有63%的它在最適溫度和最適pH條件的酶活性；雖然來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶最適pH 5. 8,最適合溫度55°C，但是在80°C和pH6的條件下其L-阿拉伯糖異構(gòu)酶仍然具有32%的它在最適溫度和最適PH條件下的酶活性。從上述可見，在符合工業(yè)用途的80°C和pH6的條件下，這三種不同來源的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶都是具有酶活性的，只是酶活性低于最適的溫度和最適PH條件的酶活性。但是，在80°C和pH6的條件下上述這三種酶的活力之和顯著高于其中的任何單種酶在它的最適溫度和最適PH條件下的酶活性。若能增加酶的產(chǎn)量將能彌補(bǔ)它由于偏離最適合反應(yīng)條件所造成的酶活性的損耗。本發(fā)明的目的是為了解決含單種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的菌株生產(chǎn)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶不能滿足當(dāng)前用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶異構(gòu)D-半乳糖生產(chǎn)D-塔格糖的需求的問題，構(gòu)建含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、新阿波、羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，生產(chǎn)重組混合嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，通過增加酶的產(chǎn)量來彌補(bǔ)它們由于偏離最適合反應(yīng)條件所造成的酶活性的損耗。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是I.克隆酶基因應(yīng)用PCR技術(shù)，從嗜熱脂肪芽孢桿菌基因組中克隆L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，從新阿波羅棲熱袍菌基因組中克隆L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，從大腸桿菌基因組中克隆L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因。2.獲得構(gòu)建表達(dá)載體所需的啟動(dòng)子，重組序列，信號(hào)肽，轉(zhuǎn)錄終止子序列和抗性基因。 3.構(gòu)建如附圖的畢赤酵母表達(dá)載體。4.將以上構(gòu)建的含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母。篩選高表達(dá)新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組子作為含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌。5.發(fā)酵含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。本發(fā)明構(gòu)建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的優(yōu)勢(shì)在于I.含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的產(chǎn)量明顯高于用含單種以上所述的酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的產(chǎn)量。2.由于畢赤酵母工程菌表達(dá)的新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在pH6. 0和80°C (符合異構(gòu)D-半乳糖為D-塔格糖的生產(chǎn)條件要求)都具有異構(gòu)D-半乳糖為D-塔格糖的酶活性，這種混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶能夠混合應(yīng)用于異構(gòu)D-半乳糖為D-塔格糖。


附圖.含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體p.畢赤酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. α因子信號(hào)肽；Genel.新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因；Gene 2.嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因；Gene3.大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子序列；G418.抗性基因(應(yīng)用于篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；p. pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。
具體實(shí)施例方式下面用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I :I. I構(gòu)建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢·桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體I. I. I構(gòu)建克隆載體由專業(yè)的DNA序列合成公司合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pPL。1.1.2獲取基因①PCR擴(kuò)增新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因引物I:5’ ccGAATTCatgatcgatctcaaacagtat3 [說明5’ 的 8 個(gè)喊基是酶切保護(hù)喊基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:5，AAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG tctttttaaaagtccccagtagagttcgttcc3’提取新阿波羅棲熱袍菌的基因組DNA，以新阿波羅棲熱袍菌的基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴(kuò)增出符合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因大小的擴(kuò)增帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明其PCR擴(kuò)增帶是新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因。②PCR擴(kuò)增嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因。引物I :5’ gctacgtaatgctgtcattacgtccttatgaattttgg3> [說明5’ 的 8 個(gè)喊基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:5，CAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG ccgcccccgccagaatacttcattccatc3，[說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]提取嗜熱脂肪芽孢桿菌的基因組DNA，以嗜熱脂肪芽孢桿菌的基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴(kuò)增出符合嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因大小的擴(kuò)增帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明其PCR擴(kuò)增帶是嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因。③PCR擴(kuò)增大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因序列。引物I :gcGAATTCatgacgatttttgataattatg3’ [說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:5，CAGCGGCCGCCTA ,ATGATGATGATGATGATG gcgacgaaatccgtaatacacttcgtt3，[說 明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]提取大腸桿菌基因組DNA，大腸桿菌基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴(kuò)增出符合大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因大小的擴(kuò)增帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因序列。I. I. 3分別構(gòu)建新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架(表達(dá)框架的DNA序列組成啟動(dòng)子-a因子信號(hào)肽-基因-轉(zhuǎn)錄終止子)。①用PCR擴(kuò)增畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列。提取畢赤酵母的基因組DNA，應(yīng)用以基因組DNA為模板，應(yīng)用如下引物(5’CCTACGTAGGATCCTITITTGTAGAAATGTC3’，5’GGGCATGCTGTGTITTGATAGITGTTCAA 3’ ；)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列[如下序列的5’端和3’端的有下劃線的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCG TTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGT CTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCC CTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAA AAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAA AGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAAT TGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC[說明畢赤酵母基因組DNA提取方法將畢赤酵母細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]②由專業(yè)的DNA序列合成公司合成a因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是a因子信號(hào)肽序列]:
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由專業(yè)的DNA序列合成公司合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAA GAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAG GATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGG TAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTG AGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤從畢赤酵母基因組中PCR擴(kuò)增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5，CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，說明引物的5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位(有下劃線的6個(gè)堿基)。提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。⑥表達(dá)框架構(gòu)建過程A.含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號(hào)肽DNA序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因序列重組于PPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于a因子信號(hào)肽DNA序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子DNA序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的載體稱為pPLl。B.含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號(hào)肽DNA序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因序列重組于PPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含嗜熱脂肪芽孢桿菌的 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的載體稱為pPL2。C.含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)；將a因子信號(hào)肽DNA序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pPL載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPL3。⑦完成表達(dá)載體的構(gòu)建A.將三套表達(dá)框架組裝于同一個(gè)克隆載體。通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，分別切取pPL2載體和pPL3載體表達(dá)框架，并將切下的這兩套表達(dá)框架依次插入于pPLl的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為PPL123.B.通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用依次將畢赤酵母的rDNA (DNA重組序列)和G418基因重組于pPL123載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)成含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體(附圖)。I. 2構(gòu)建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌用電轉(zhuǎn)化方法將含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將經(jīng)過電轉(zhuǎn)化的GS115細(xì)胞涂布G418抗性平板。以重組子(在G418抗性平板上生長的克隆)基因組DNA為模板，分別用新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因特異引物、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因特異引物和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因特異引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增出符合目標(biāo)分子量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定而驗(yàn)證獲得了正確的重組子。將含以上含三種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母重組子接種于YPD[2%蛋白胨，1% yeastextract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)兩天，將發(fā)酵液離心，收獲上清。應(yīng)用發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，其結(jié)果表明出現(xiàn)新的符合這三個(gè)基因編碼的酶蛋白分子量的蛋白條帶。用His6融合蛋白純化試劑盒純化目標(biāo)蛋白，用His標(biāo)簽單克隆抗體對(duì)純化的兩種目標(biāo)蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這三種目標(biāo)蛋白都能與His標(biāo)簽單克隆抗體結(jié)合，證明新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因都能在畢赤酵母中表達(dá)和分泌到胞外。篩選高表達(dá)以上所述的三種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組子作為含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌。I. 3生產(chǎn)重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶
分別將含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，只含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、只含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、只含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌和不含L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母分別接種于YPD培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)兩天。分別收集其發(fā)酵液上清于PH6和80°C與D-半乳糖反應(yīng)，然后測(cè)定D-塔格糖含量，根據(jù)D-塔格糖產(chǎn)量換算為L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性并將結(jié)果記錄于表I。表I結(jié)果表明含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性明顯高于含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性，也高于含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性和含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性，并且，前者的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性約是后三者的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性之和；表I結(jié)果還表明，在pH6和80°C條件下，混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性明顯高于其中任何一種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在其最適的pH和溫度下的酶活性。表I.發(fā)酵液的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法。其特征在于應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，構(gòu)建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體；將上述構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母從而獲得畢赤酵母重組子；篩選高表達(dá)重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的畢赤酵母重組子作為含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌；用含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法制備重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于將按照權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法生產(chǎn)的重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，應(yīng)用于制備D-塔格糖產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。首先分別克隆嗜熱脂肪芽孢桿菌、新阿波羅棲熱袍菌和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因；構(gòu)建含這三種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體，并將其載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得工程菌；發(fā)酵畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。這種重組混合酶不僅酶活性明顯高于用畢赤酵母表達(dá)其中的單種酶，而且在pH6.0和80℃(符合異構(gòu)D-半乳糖為D-塔格糖的生產(chǎn)條件要求)具有高的異構(gòu)D-半乳糖為D-塔格糖的酶活性。本發(fā)明有利于解決因尚無符合最適pH5.0-6.0并且最適溫度＞60℃的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株而制約酶法生產(chǎn)D-塔格糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題，促進(jìn)酶法生產(chǎn)D-塔格糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N15/61GK102719463SQ201210141968
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者尹慧祥, 崔艷艷, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 陳麗萍 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所