專利名稱：一種腫瘤抗原特異性t細胞的獲取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及特異性T細胞的產生和擴增方法，特別涉及腫瘤抗原特異性T細胞的生產和擴增方法。
背景技術：
體外生成和擴增具有辨認各種抗原能力的T細胞已成功地用于治療惡性腫瘤和病毒感染性疾病。這種特異性過繼免疫治療策略的誘人之處在于它能誘導只針對疾病細胞的特異性免疫效應，而不傷及正常細胞，無副作用。因此，常規(guī)、可重復的體外擴增抗原特異性T細胞的方法是實現腫瘤過繼免疫治療的關鍵。如今，體外培養(yǎng)產生有腫瘤治療效果的抗原特異性T細胞技術還遠未成熟，需要進一步完善，在提高其抗腫瘤功能的同時簡化抗原特異性T細胞的產出程序，使其得到廣泛應用。目前擴增T細胞的方法主要依靠人類白細胞相容抗原(MHC)配對的抗原提呈細胞 (APC)和外源性生長因子，如白介素2 (IL-2)聯合⑶3抗體用于刺激T細胞分裂，擴增的T細胞主要是CD8陽性T細胞亞群。然而，由于APC存活期相當短，長期培養(yǎng)T細胞時要不斷收集和補充死亡的APC。當疾病影響到免疫系統(tǒng)，如免疫缺陷，病毒感染等，APC的來源更是無法解決。另外，獲得臨床治療量的抗原特異性T細胞往往需要在培養(yǎng)過程中多次活化和擴增，需投入大量人力，既耗時，成本又高，且重復性差，又難標準化。因此，改進抗原特異性T細胞克隆的擴增方法是非常必要的。在改善抗原特異性T細胞的抗腫瘤功能的同時簡化抗原特異性T細胞的產出程序無論是提高臨床治療的效果還是細胞產出的標準化都具有重要的意義。

發(fā)明內容
為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種能產生大量反應性極高的抗原特異性T細胞的方法，獲得的T細胞無論是細胞表面受體表達還是細胞因子的分泌都是現有其它培養(yǎng)系統(tǒng)無法比擬的。用此方法無需知道特殊抗原(當然已知的抗原也可以應用)，經1-2次擴增就能達到治療量，包含⑶4和⑶8系列的抗原特異性T細胞，而且可以根據需要分選⑶4或⑶8細胞。鑒于此，本發(fā)明提供的技術方案是，提供一種腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，包括產生和擴增方法，所述產生方法是將含有抗原提呈細胞(APC)的第一群細胞與包被有抗原的界面接觸，讓APC攝取包被在界面上的抗原；再將含有T細胞的第二群細胞與攝取了抗原的第一群細胞共培養(yǎng)，產生抗原特異性T細胞。可以采用不同的方法巧妙地把抗原包被、黏附、偶聯或結合到某些物體的表面，例如交叉鏈接，也可以通過共價或非共價，靜電或疏水基團結合的方式，或利用各種黏附方法來完成，包括化學，力學，酶學，靜電等方法，最終目的是讓這些包被有抗原的界面能刺激T細胞。例如，通過抗生物素蛋白或鏈霉親和素使抗體與生物素化的抗原在界面結合；抗體與配體通過特異性結合到界面。另一種辦法是用其它非特異性抗體結合分子，如A蛋白或G蛋白包被的界面結合抗體?；瘜W交叉偶聯法包被抗原可用Pierce, Rockford III或其它方法,抗原也可以共價結合的方式結合到界面。另外一種方法是用甲苯磺?；せ畹幕颦h(huán)氧樹脂結合的DYNABEAD 按廠家的操作步驟與多肽抗原，在磷酸緩沖液的PH 4-9. 5之間，溫度4-37°C之間共培養(yǎng)。進一步地，所述APC直接與抗原特異性T細胞接觸，與抗原特異性T細胞直接接觸的APC是用磁場分離。進一步地，所述擴增方法是將抗原特異性T細胞植入包被有第一試劑的培養(yǎng)界面擴增，再轉入包被有第二試劑的培養(yǎng)界面；所述第一試劑和第二試劑是相同或者不同的抗體或抗體片段；所述界面為磁珠、脂質或細胞?？乖禺愋訲細胞先和包被有第一試劑的界面培養(yǎng)，然后轉入包被有第二試劑的培養(yǎng)界面，目的是讓T細胞表面相應部位與不同試劑結合，促進抗原特異性T細胞的分蘗(擴增)。進一步地，界面的空間與T細胞的比例選擇I :2，1 :2. 5,1 :5，I :25，I :50，I :75， I 100。需要說明的是，上述界面的空間與T細胞的比例是優(yōu)選方案，對于本領域技術人員來說，界面的空間與T細胞的比例介于I :2至I :100均可以選擇的。所述第一試劑是⑶3或⑶2抗體或其片段，所述第二試劑用⑶28抗體或其片段。⑶3抗體與⑶28抗體的比例為I :1至I :100。抗原特異性T細胞可以用針對T細胞活化標記的抗體分離，可供選擇的抗體還包括CD25，CD54，CD69，CD38，CD45R0，CD49d，CD40L，CD137，CD62L 以及 CD134 等抗體。T細胞的擴增時加入促細胞分裂素、白介素15、天然⑶137蛋白、⑶137抗體、NKG2D抗體或/和天然NKG2D蛋白。優(yōu)選地，所述促細胞分裂素選用植物血球凝集素(PHA)，豆蘧酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)和離子素，脂多糖(LPS)，以及超級抗原。所述抗原為抗體/抗原復合物、腫瘤或病毒感染的細胞、固定的腫瘤或病毒感染的細胞、高溫滅活的腫瘤或病毒感染的細胞、腫瘤細胞裂解物、不溶解的細胞碎片、細胞凋亡體、壞死細胞、滅活的腫瘤細胞、放射滅活的異體細胞、天然或合成的碳水化合物、脂蛋白、脂多糖、以及基因改造的細胞。對于蛋白類，糖蛋白類，多肽這些抗原亦可用于本發(fā)明所述的方法?？乖墨@取方法有非轉化細胞用3000-3600rad強度的Y射線照射；淋巴母細胞或腫瘤細胞用6000-10000rad強度的、射線照射；用理化或生物學的方法獲得壞死和凋亡細胞，如用凍-溶的方法獲得壞死細胞，而用紫外線照射的方法獲得凋亡細胞。APC來源于外周血單個核細胞采集，淋巴結，扁桃體，活檢組織，腫瘤組織，脾臟，骨髓，臍血，⑶34+細胞或單核細胞。優(yōu)選地，APC來源于⑶34+細胞?？乖峭ㄟ^抗體/配體的相互作用吸附或者通過化學反應的方法包被到載體的界面上。選擇的抗體與相對應的配體有MARTl抗體/MARTI，WT-I抗體/WT_1，PRl抗體/PRl, PR3抗體/PR3，絡氨酸酶抗體/絡氨酸酶，MAGE-I抗體/MAGE-1，MUC-I抗體/MUC-1，甲胎蛋白抗體/甲胎蛋白，Her2Neu抗體/Her2Neu, HIVgpl20抗體/HIVgpl20,流感HA抗體/流感HA抗原，CMVpp65抗體/CMVpp65，C型肝炎病毒抗體/C型肝炎病毒蛋白，EB病毒EBNA 3B抗體/EB病毒EBNA 3B抗原，以及人免疫球蛋白重鏈和輕鏈抗體/來自骨髓瘤或慢性淋巴細胞性白血病患者的免疫球蛋白。用化學的方法把抗原黏附到界面上，如利用生物素-親和素的作用。
利用上述方法獲得的腫瘤抗原特異性T細胞，與哺乳類癌細胞接觸，能夠有效地抑制腫瘤細胞生長。這些腫瘤細胞有黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏病，白血病，漿細胞瘤，肉瘤，膠質瘤，胸腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，結腸直腸癌，腎細胞癌，胰腺癌，食道癌，腦癌，肺癌，卵巢癌，宮頸癌，多發(fā)性骨髓瘤，肝癌，急性淋巴母細胞性白血病，急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，以及慢性淋巴細胞性白血病。相關術語解釋。術語“生物兼容”指的是對活細胞無明顯毒性作用的特征。術語“刺激”指的是細胞表面的某些部位連接后的第一反應。例如，就受體而言，“刺激”需要細胞表面的受體與相應的信號傳導系統(tǒng)連接來完成。有關T細胞的刺激，這樣的刺激在一種情況下指的是T細胞表面部位的連接誘導信號轉導的發(fā)生，例如TCR/CD3復合物的形成。刺激的發(fā)生可能激活一個細胞上調或下調一個分子的表達或分泌，例如，下調TGF-β。因此，細胞表面某些部位的連接，即使沒有直接的信號轉導發(fā)生，也可能導致細胞結構的重組，提高、調節(jié)或改變后續(xù)的細胞反應。 術語“活化”指的是細胞表面部位充分連接導致明顯的生化或形態(tài)改變的狀態(tài)。T細胞而言，這樣的活化指的是T細胞充分刺激后導致細胞增殖的狀態(tài)。T細胞活化也可能誘導合成細胞因子，產生調節(jié)或溶解細胞效應。對其它細胞而言，這個術語有上調或下調一個特定的理-化作用的意思。術語“靶細胞”在這里指的是受到刺激的細胞。術語“抗體”包括單克隆和多克隆抗體；人源化，鼠源，鼠-人，鼠-靈長類和嵌合抗體；可以是完整的分子或片段(如sCFv，Fv，Fd，Fab，Fab’以及F(ab)’ sub. 2片段)，或是多聚體，聚合物；通過免疫，合成或基因工程的方法獲得。“抗體片段”指的是相應抗體的衍生物，分子小，能結合相應抗原，易于攝取和清除(例如，與半乳糖殘渣結合)。它們包括F(ab)，F(ab)，sub2，scFv，輕鏈易變區(qū)(V. sub. L)，重鏈易變區(qū)(V. sub. H)以及它們的結合。術語“蛋白”指的是蛋白，多肽和肽；可以是完整的氨基酸序列，片段或多聚體或完整分子與片段的混合?？梢允翘烊坏幕蛲ㄟ^合成(化學和/或酶聯)或基因工程獲得。術語“試劑”，“配體”，或“與細胞表面結合的試劑”指的是與限定細胞結合的一種分子。試劑可能可以結合到任何細胞的表面，如一種受體，一種抗原決定族，或靶細胞的其它結合部位。試劑可以是蛋白，肽，抗體和抗體片段，融合蛋白，合成的分子，一種有機分子(如小分子)等。T細胞刺激中用規(guī)范的抗體。術語“與細胞表面結合的試劑”和“細胞表面結合部位”指的是一對抗體與相對應的配體。它們應該是互補的、特異性結合，通常有相當高的親和力(親和力常數，Ka大約是106L/mol 或更高)。術語“抗原提呈細胞(APC)”指的是正常情況下使原始和/或T細胞對抗原作出反應的啟動細胞。在這個意義上，指所有能提呈抗原的細胞。APC除了樹突狀細胞,單核細胞，巨噬細胞和B細胞，還包括人造抗原提呈細胞，APC高表達MHC II型分子，ICAM-I和B7-2分子。術語“共刺激信號”指的是與第一信號，如TCR/CD3結合，相互作用，導致T細胞增
殖的信號。術語“配體抗體/配體”指的是一對互補的，具特異性結合的，通常有相當高的親和力(親和力常數，Ka至少IO6LAiol)的分子。分子間的親和力是相對的，視選用的對子有高有低，例如，生物素/鏈酶親和素，鏈酶親和素的結合率與單體生物素相當，而它的解離率只有單體生物素的1/7。酶/酶抑制劑，半抗原/抗體，植物凝血素/碳水化合物，受體/配體以及生物素/抗生物素蛋白或鏈酶親和素都是配體/抗配體對子。此發(fā)明內，受體以及其它的細胞表位是配體抗體，而與其作用的試劑，如抗體和抗體片段被認為是配體。術語“分離”指的是用任何方法，如過濾，磁場，提純一種細胞成分。術語“靜息”指的是處于無增殖狀態(tài)的細胞。術語“界面”指的是結合了試劑的表面，材料可以是金屬，玻璃，塑料，共聚合體，膠體，脂質，細胞表面以及類似物。這些表面必須是可以維持試劑黏附。此發(fā)明內這種表面的典型例子是一種顆粒。因此，術語“界面”與“顆?！笔强梢曰Q的。術語“免疫反應或反應”指的是免疫細胞(包括但不限于T細胞)的活化,誘導產生特殊的效應細胞。效應細胞的功能包括，但不限于，增殖，分泌細胞因子，分泌抗體，調節(jié)和 /或黏附分子的表達以及溶解細胞的能力。術語“刺激免疫反應”指的是任何能活化、誘導免疫系統(tǒng)的效應細胞功能的刺激。術語“免疫反應異?！敝傅氖敲庖呒毎惓５幕罨?或增殖或缺乏，和/或異常分泌或缺乏細胞因子，和/或免疫系統(tǒng)其它細胞的異常誘導或不足，如調節(jié)，黏附和/或歸源受體的表達，以及誘導細胞溶解。術語“防止”或“抑制”一種癌或癌細胞的發(fā)展指的是預防癌癥的發(fā)生或延緩癌癥復發(fā)。術語“治療”或“減少癌或癌細胞的出現”指的是用腫瘤體積或惡性細胞的數量反應癌生長的方法。腫瘤體積用已知的不同方法測量，例如，用帶表卡尺測定腫塊的兩個長徑,計算腫瘤大小。術語“預防或抑制感染性疾病的發(fā)生”指的是防止感染性疾病的發(fā)生或延緩感染性疾病的發(fā)作，或逆轉感染性疾病的擴散。術語“改善”指的是使好轉。術語“顆?！敝傅氖悄z質顆粒，微球，納米顆粒，微粒等。一般情況，可以用市場提供的微?；蚱渌w粒，提供這些顆粒表面的公司有Miltenyi Biotec, Germany;PharmaciaFine Chemicals, Sweden;Dynal Inc.，Oslo, Norway;Prometic Biosciences;ImmuniconjHuntingdon Valley, Pa. USAjBangs Laboratories，Inc.，Fishers，Ind. USA。 術語“常磁性顆?！敝傅氖悄茉诖艌鰞染奂拇判灶w粒。術語“抗原”指的是任何分子I)能被特異性的單克隆抗體或衍生物辨識，并在其特定分子區(qū)域(抗原結合區(qū))結合；2)結合MHC的相關多肽序列能特異性地與同源T細胞抗原受體結合。術語APC “加載”抗原指的是APC與抗原或抗原肽接觸一段時間，APC攝取，處理抗原并結合MHC分子后提呈抗原給T細胞。一些情況下，抗原，特別是抗原肽，結合MHC分子后直接提呈給T細胞，無需APC的參與。術語“動物”或“哺乳動物”指的是全部的哺乳類，包括人。這個專利申請中，更多的是指人體。術語“接觸”指的是使進入立即或直接的接觸狀態(tài)。
術語“溶解產物”指的是細胞溶解后的上清液和不溶解的細胞碎片。有多種細胞溶解方法和溶解液可供選用(參考Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons, New York. N. Y.)。溶解細胞也可以用凍-溶的方法或其它方法，如超聲降解。術語“凋亡小體”指的是來自凋亡細胞的，有完整包膜的小片段。術語“增殖”指的是新細胞的倍數增長。術語“感染性疾病”指的是由感染性微生物引發(fā)的疾病。感染性微生物包括病毒類有RNA病毒，DNA病毒,人類免疫缺陷病毒(HIV), A, B, C型肝炎病毒,單純皰疫病毒(HSV)，巨細胞病毒(CMV)，埃-巴病毒(EBV)，人類乳頭狀病毒(HPV);寄生蟲包括原生和后生病原體，如瘧原蟲，利什曼蟲，血吸蟲，錐蟲；細菌主要是分支桿菌屬,如結核桿菌,沙門氏菌，鏈球菌，大腸桿菌，葡萄球菌；霉菌包括假絲酵母菌，曲霉菌；以及肺囊蟲和朊病毒(傳 染性瘋牛病的病原體，侵犯牛羊的神經系統(tǒng)，導致海綿狀腦病)。已知4種朊病毒可傳染人I)苦魯??；2)疫攣性假硬化；3) Gerstmann-Straussler-Scheinker 病(GSS) ；4)致命性家族性失眠癥。這里包括全部由朊病毒引起的疾病。


圖I⑶8+T淋巴細胞表達中央記憶性T細胞標記。(A)未培養(yǎng)的⑶4+和⑶8+淋巴細胞的記憶性標記表達；(B)培養(yǎng)后的抗原特異性⑶4+和⑶8+淋巴細胞的記憶性標記表達。圖2腫瘤抗原特異性T細胞對腫瘤細胞的體外殺傷作用。(A)腫瘤細胞CNE，PANC-I和QGY-7701培養(yǎng)24小時后的觀察(上圖)，加入未培養(yǎng)的淋巴細胞24小時后的觀察(下圖)(B)腫瘤細胞CNE，PANC-I和QGY-7701培養(yǎng)24小時后的觀察(上圖)，加入抗原特異性T淋巴細胞24小時后的觀察(下圖)。圖3利用本發(fā)明所述方法獲得的特異性T細胞對非小細胞肺癌病人治療前后的EGFR特異性T細胞的觀察。圖4利用本發(fā)明所述方法獲得的特異性T細胞對非小細胞肺癌病人治療前后的X光胸側位片的觀察。圖5利用本發(fā)明所述方法獲得的特異性T細胞對非小細胞肺癌病人細胞治療后的血漿CEA水平的觀察。
具體實施例方式以下結合附圖進行說明。I、T細胞的來源T細胞來源是多方面的，包括自體或異體的外周血單個核細胞，骨髓，胸腺，活檢組織，腫瘤，淋巴結組織，臨近淋巴組織的黏膜，脾臟或任何其它淋巴組織。T細胞也有來自異種，如小鼠，大鼠，非人類靈長目動物和豬。外周血淋巴細胞最好通過單項采集獲得。單項采集獲得的細胞包含T細胞，單核細胞，粒細胞，B細胞和其它一些有核白細胞、紅細胞和血小板?？梢酝ㄟ^洗滌、分離去除血漿成分，然后置入適當的緩沖液，如磷酸緩沖鹽水(PBS)備用。有時用去除二價離子，如鈣鎂的洗滌液。根據實驗室經驗可以選擇不同的方法分離淋巴細胞，例如用半自動流通離心機，按產家的操作步驟分離(Cobe 2991cell processor,Baxter)。洗漆后的細胞懸浮于生物相容性緩沖液，如去Ca++和Mg++的PBS?；蛘?，去除不需要的成分后把細胞直接懸浮在細胞培養(yǎng)液。另外一種方法是通過紅細胞裂解和PERC0LL 梯度離心從外周血提取T細胞。特殊的T細胞亞群，如⑶28+，⑶4+，⑶8+，⑶45RA+，⑶45R0+的T細胞，可以用不同技術分選，例如，⑶3+，⑶28+的T細胞可以用⑶3/⑶28接合的磁珠(DYNABEADS)做陽性分選。也可以針對細胞表面某些特殊標記，利用聯合抗體陰性分選達到提高某種T細胞亞群數量的目的。最好的方法是利用針對細胞表面標記的混合單克隆抗體，用免疫磁附技術或流式細胞技術陰性分選所需的T細胞，例如，陰性分選⑶4+細胞通常選擇⑶14，⑶20，⑶11b，⑶16，HLA-DR和⑶8混合單克隆抗體。備制T細胞也可以用洗滌后凍存的方法，不需要另外步驟去除單核細胞，因為經凍存后復蘇的細胞基本可以除去粒細胞和部分單核細胞。洗滌去除血漿和血小板后，把細胞懸浮于凍存液。凍存液是用培養(yǎng)液I :1稀釋的含20%DMS0和8%人血清白蛋白(HSA)的PBS, DMSO和HSA的終末溶度分別是10%和4%。細胞以每分鐘下降1° C的凍存速率下降 至-80° C后儲存在液氮罐內的蒸發(fā)相。2、抗原提呈細胞(APC)的來源組織來源的抗原提呈細胞(APC)或APC前體細胞在抗原和/或必須的細胞因子的環(huán)境中能增殖和成熟成為專職抗原提呈細胞(PAPC)。術語“專職抗原提呈細胞”或“抗原提呈細胞”指的是正常情況下使原始和/或記憶性T細胞對抗原作出反應的啟動細胞。pAPC包括，但不限于，樹突狀細胞，單核細胞，巨噬細胞，B細胞以及人造抗原提呈細胞。pAPC高表達MHCII型分子，ICAM-I和B7-2分子。APC前體細胞在體外培養(yǎng)成為成熟的樹突狀細胞(DC)0 APC可以來自很多組織，如脾，胸腺，活檢組織，腫瘤組織，淋巴結，輸入淋巴，骨髓，夕卜周血。外周血和骨髓是首選來源。含有豐富生長因子的胚胎組織和臍帶血都是APC和/或APC前體細胞的來源。優(yōu)秀的前體細胞可能是胚胎干細胞，CD34+細胞，單核細胞祖細胞和B細胞的祖細胞。本發(fā)明優(yōu)選使用APC從單核細胞或CD34+細胞的前體細胞獲得。APC和/或APC前體來源于外周血白細胞采集。單項細胞采集技術是本領域眾所周知的(參考Bishop et al.，Blood, Vol. 83，No. 2，pp. 610-616，1994)例如，用 HaemoneticsModel V50細胞單米機(Haemonetics, Braintree, Mass. USA)。米集的淋巴細胞包含T細胞，單核細胞，粒細胞，B細胞以及其他有核白細胞，紅細胞和血小板。經洗滌去除血漿，把細胞懸浮于適當的緩沖液或培養(yǎng)液備用。洗滌液用沒有二價離子的溶液。洗滌步驟按本領域技術員熟知的方法進行。例如用半自動流通離心機，按廠家的操作步驟分離(Cobe 2991 cellprocessor, Baxter)。洗漆后的細胞可再懸浮于不同的生物相容性緩沖液中，如去Ca++和Mg++的PBS?；蛘?，去除不需要的成分后把細胞直接懸浮在細胞培養(yǎng)液。如果APC來自全血，用常規(guī)的方法提取APC。血液用無抗凝劑的RPMI培養(yǎng)液以體積I :1稀釋，混勻，分裝到50毫升已加了 12. 5ml淋巴細胞分離液(Ficoll)的離心管中。700G，室溫離心20分鐘。提取白膜細胞層加入裝有RPMI1640的離心管中。其它用于細胞培養(yǎng)的溶液也可以用來分離淋巴細胞，如PBS，Hanks緩沖液，或含細胞生長因子的培養(yǎng)液，如 DMEM，MEM，HAMS F-12，X_Vivol5，X_Vivo20。APC 和 / 或 APC 前體細胞還可以用 BeckmanJ6ME離心設備配備J5. O轉子和40ml凈化腔純化。另一種分離APC和/或APC前體細胞的方法是全血或單采的細胞與結合了抗體的順磁磁珠(4xl09磁珠大約可用于5xl08到2Χ1(Γ細胞)在22-37° C條件下孵育大約30分鐘到2小時，然后在磁場中去除與磁珠結合的細胞。整個過程可以按照廠家提供的操作步驟來完成，如DYNAL. RTM. Magnetic Particle Concentrator。提取出來的細胞質量可用這個領域的已知技術鑒定，包括細胞分離前后流式細胞分析技術。組織來源的APC通過細胞原代培養(yǎng)獲得。本發(fā)明對此作出如下改進培養(yǎng)基中通常加入1-2種細胞因子，如人粒細胞-巨噬細胞生長因子和人白介素-4，在組織相容培養(yǎng)皿內培養(yǎng)，如各種培養(yǎng)袋(Lifecell culture bags)，培養(yǎng)瓶，多孔培養(yǎng)板，皮氏培養(yǎng)平皿等。表面用膠原或poly-L-lysine處理，促進細胞貼壁。一些特殊細胞類型需要特異性抗體協助。培養(yǎng)皿也可用化學處理的方法，如離子化。植入細胞密度大約105_7/cm2。優(yōu)選地，原代細胞在標準的細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)直到可以把貼壁和非貼壁細胞分開為止。血液中一些未成熟的APC，特別是未成熟的DC細胞，開始是不貼壁的，單核細胞則 相反，因此，24小時內就能把前體細胞分離。一般認為大多數貼壁細胞是單核細胞和纖維母細胞，通常在培養(yǎng)30分鐘到24小時內貼壁。非貼壁細胞一般在1-16小時就可以從貼壁細胞中分離出來。分離非貼壁細胞時，無論用震蕩還是用移液的方法，注意維持貼壁細胞的貼壁狀態(tài)，盡量不要把太多的貼壁細胞混入非貼壁細胞。通常選用移液的方法。把分離的包含APC前體細胞的貼壁細胞在標準的細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)成未成熟APC，依本發(fā)明，一般需要4小時到7天時間。這里用的術語“未成熟APC”指的是APC向成熟分化的一個中間狀態(tài)，在這個狀態(tài)的APC具有內吞或吞噬抗原，異物，壞死和/或凋亡組織和/或細胞的功能。視前體細胞的來源，未成熟APC可以是CD14+或CD14-細胞。它也可以表達⑶la，⑶40，⑶86，⑶54以及中度水平的MHC II型分子(用流式細胞分析技術與MHCII型分子表達陽性/陰性的細胞對比)。典型的未成熟APC不表達CCR7。其實，T細胞沒有必要從APC中分離出來。例如，包含APC和T細胞的PBMC如描述的那樣與抗原接觸，獲得的抗原特異性T細胞再按本發(fā)明的方法進一步擴增。 這里描述的APC或T細胞并不一定都要來自自體，也可以來自配對或不配對的異體供者，細胞系，或其它體外培養(yǎng)的細胞，或來自異種，如小鼠，大鼠，非人靈長動物和豬的APC和T細胞?；蚺鋵Φ姆椒ㄊ且阎?。3、抗原的來源根據發(fā)明，抗原可以是，但不限于，蛋白，包括糖蛋白，肽(包括相互交叉的組合肽)，超級抗原(如SEA，SEB, TSST-I )，抗原/抗體復合物，腫瘤溶解物，病毒溶解物(如CMV溶解物)，不溶解的細胞碎片，凋亡小體，壞死細胞，活的、固定的、輻射過的、高溫滅活的、或其它方法備制的全細胞，滅活的、來自腫瘤組織或細胞系的腫瘤全細胞，滅活的異體細胞，輻射過的腫瘤細胞和異體細胞，天然或合成的碳水化合物，脂蛋白，脂多糖，RNA或RNA翻譯產物，以及DNA或DNA編碼的多肽。非轉化細胞用3000-3600rad強度的、射線照射。淋巴母細胞或腫瘤細胞用6000-10000rad強度的、射線照射。用理化或生物學的方法獲得壞死和凋亡細胞。如用凍-溶的方法獲得壞死細胞，而用紫外線照射的方法獲得凋亡細胞。(參閱Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, JohnWiley & Sons, New York. N. Y.)。
抗原也包括非轉化的細胞，轉化的細胞，轉染的細胞，或轉導的細胞或細胞系?？梢詰靡阎囊阅孓D錄酶病毒為載體的轉化，轉染或轉導技術使宿主細胞表達重組抗原分子。具體的操作步驟可參考 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York. N. Y.試劑盒供應商:Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.USA.表達牛痘疫苗載體的細胞是其中抗原之一。重組抗原可以包括以下描述的任何數量的抗原。采用的抗原有病毒抗原，如CMV pp65, HIV pgl20之類的抗原。優(yōu)選地，所述抗原為腫瘤特殊抗原，如黑色素瘤Melan-A抗原(也稱T細胞或MART-I識別的黑色素瘤抗原)，黑色素瘤抗原基因1,2，3編碼的抗原(MAGE-1, -2，-3)，黑色 素瘤GP-100抗原，癌胚抗原(CEA)，乳腺癌抗原，Her-2/Neu，血清前列腺特異性抗原(PSA)，維爾姆斯氏瘤抗原(WT-1)，PRl, PR3 (慢性粒細胞性白血病中移植物抗白血病的抗原)，粘蛋白抗原，MUC-I, -2，-3，-4，B型細胞淋巴瘤特異性抗原等。在這個領域的技術人員可以根據需要選擇不同的腫瘤抗原。4、抗原特異性T細胞的活化發(fā)明的其中一個驚人的發(fā)現是抗原特異性T細胞的擴增取決于細胞與磁珠的比例。選擇細胞與磁珠的比例就能調節(jié)記憶性抗原特異性細胞的數量。因此，選擇適當的磁珠與細胞的比例，選擇性地擴增抗原特異性T細胞。如來自單采的PBMC，血液或腫瘤活檢組織的T細胞與上述包被了第一和第二試劑的磁珠接觸后，第一試劑和第二試劑分別與T細胞表面相應部位結合，誘發(fā)抗原特異性T細胞增殖(擴增)?？乖禺愋訲細胞致敏后受到刺激，誘發(fā)增殖。因此，刺激T細胞的信號強弱是關鍵，“弱”信號刺激記憶性抗原特異性T細胞的擴增，而“強”信號則相反。信號強弱取決于與配體結合的CD3/TCR和CD28受體的量。因此，磁珠與細胞的比例越高，刺激T細胞的信號就越強，引起抗原特異性T細胞的過刺激而死亡。降低磁珠與細胞的比例，適當的刺激信號將誘導抗原特異性T細胞的增殖。改進之一上述方法提取的T細胞用負載抗原的APC激活生成抗原特異性T細胞。另一改進APC與足夠量的上述抗原在培養(yǎng)皿內孵育足夠長的時間(一般需要1-4天)，讓APC有足夠的時間結合和/或攝入抗原。但是，不同抗原或來源不同的抗原，所需的時間也不相同。特殊改進孵育時間36，48或72小時。進一步改進抗原孵育時間2. 5,3,
3.5，或4天。一些優(yōu)化抗原孵育時間4天以上，從4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5,8,8. 5,9,9. 5到10天不等。APC攝取抗原的量和必須的孵育時間根據抗原的來源和類型有所不同，可以用本領域常規(guī)的免疫檢測方法檢測。也可以用檢測APC表面MHC抗原復合物的方法檢測。另一改進單采獲得的外周血單個核細胞(PBMC)直接按如上所述的方法與承載抗原的APC共培養(yǎng)，刺激并活化PBMC的里的T細胞，生成抗原特異性T細胞。操作步驟收集一個人的PBMC，加入抗原，如腫瘤抗原，或病毒溶解物等。這時，PBMC里的APC攝取抗原后提呈給PBMC里的T細胞。另一改進用肽-MHC四聚物刺激抗原特異性T細胞(參閱Altmanet al. , Science 1998 Jun. 19;280(5371):1821)。APC可以用基因改良的方法負載抗原，包括用已知的方法轉染RNA或DNA，如電穿孔法(如用 the Gene Pulser II, BioRad, Richmond, Calif. USA),各種陽離子脂質(LIPOFECTAMINE , Life Technology, Carisbad, Calif. USA)或其它技術，如 CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N. Y.里的方法憐酸I丐轉染。例如，500 μ I 含 5-50 μ g RNA 或 DNA 的 Opti-ΜΕΜ 室溫與 10-100 μ g/ml 混合 20-30 分鐘。其它脂質包括LIPOFECTIN ，LIPOFECTAMINE 。產生的核酸-脂質復合物加入1_3χ106(首選2xl06)抗原提呈細胞，液體(如Opti-ΜΕΜ)總體積大約2毫升，37° C孵育2_4小時。APC也可以用下面描述的病毒轉導方法。另一改進把抗原黏附、包被或用其它辦法固定在顆粒的表面負載給APC。市場銷售的各種微球或顆粒都可以用作這樣的抗原載體，如MiItenyi顆粒(MiItenyiBiotec.，Germany) ;Sepharose 微粒(Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) ；DYNABEADS (Dynallnc. , New York,USA)。其中改進應用市場銷售的順磁顆粒或微粒。例如,Dynal AS生產的商標名為Dynabeads 的常用磁珠有M-280，M-450和M-500。一個改進活的、固定的、輻射后的、高溫、或其它方法滅活的整個細胞用抗體/配體特異性結合或其它方法固定在可被攝取的微粒的表面。腫瘤細胞或病毒感染的細胞溶解物，或其它抗原都可以用相似的方法固定在微粒的表面。這些抗原/細胞/溶解物包被或黏附的微粒與動物或人的PBMC 共培養(yǎng)時，其中的APC就能攝取攜帶抗原的微粒，處理其中的抗原并把相關抗原信息提呈給PBMC里的T細胞。巨噬細胞攝取顆粒/微粒，處理相關抗原，并提呈給PBMC里的T細胞。只有抗原特異性的T細胞才會與相應APC相互作用。帶有磁珠的APC可以通過磁場與抗原特異性T細胞分離。一個特殊改進細胞也可以用作抗原載體。在這種情況下，抗原通過與細胞表面特異性受體結合或通過基因改造的方法把抗原吸附在細胞表面。Current Protocol inMolecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N. Y.里的各種基因轉染、轉導、或細胞轉化技術都可以應用，其中的試劑盒也都有商家提供。一種較好的轉染技術是電穿孔技術，可應用于不同的細胞類型，包括哺乳動物細胞，真菌和細菌。通過實驗確定對特定細胞類型的理想電穿孔條件，包括電壓，電阻和脈沖的波長。廠家也會提供這方面的一般準則。不同的細胞類型可選擇不同的轉染技術，如真菌用醋酸鋰的方法。細胞轉染后維持在適當的環(huán)境中促進轉染基因的表達，條件的設定取決于細胞類型和基因表達系統(tǒng)的應用?？乖梢酝ㄟ^抗體/配體特異性結合方法結合到微粒上。適合的抗體/配體對包括，但不限于，MART-I抗體/MART-I，WT-I抗體/WT-I，PRl抗體/PRl，PR3抗體/PR3，絡氨酸酶抗體/絡氨酸，MAGE-I抗體/MAGE-I，MUC-I抗體/MUC-I，甲胎蛋白抗體/甲胎蛋白，Her2Neu 抗體 /Ner2Neu, HIV gpl20 抗體 /HIVgpl20,流感 HA 抗體 / 流感 HA, CMVpp65 抗體/CMVpp65，C型肝炎抗體/C型肝炎蛋白，EB病毒EBNA 3B抗體/EB病毒EBNA3B抗原，以及來自腫瘤病人的人免疫球蛋白重鏈和輕鏈抗體/人免疫球蛋白抗原。也可以通過蛋白/蛋白之間的相互作用，如受體/配體，把抗原結合到微球上。一些改進抗原/蛋白用化學的方法吸附到微球上。只要抗原與微球孵育一定時間，利用抗原/蛋白與微球非共價結合的方式，或通過生物素/親和素或鏈酶親和素的相互作用把抗原結合到微球上。進一步改進利用甲苯磺?；c微球表面裸露的疏水基團的反應，24小時內通過氨基(NH2)和巰基(SH)的共價連接把蛋白吸附在微球上。連接反應可以在中性PH的環(huán)境中完成，然而，37°C堿性環(huán)境能加速共價結合。承載抗原的APC用如上所述的方法刺激從組織分離獲得的T細胞，孵育時間大約從數小時到 0. 5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20 天不等。一個改進T細胞與上述抗原或抗原承載的APC在活體內接觸。為了在活體內激活T細胞，上述抗原或承載抗原的APC可以注射到體內，然后在體內或體外擴增抗原特異性T細胞，體外擴增,如上所述,用CD3/CD28抗體微球。注射的量和次數視疾病的嚴重程度而定，也可以通過臨床試驗確定。如果抗原或承載抗原的APC在疾病發(fā)生前或在疾病開始治療前注射，然后從外周血中分離產生的抗原特異性T細胞，體外擴增備用。一個改進利用磁場把結合了抗原磁珠的APC的抗原特異性T細胞分離出來。分離方法應用標準的 DYNAL Magnetic Particle Concentrator (DYNAL)或 MACS (MiltenyiBiotec, Germany)提供的操作步驟。此時,只有抗原特異性T細胞與APC充分作用，攜帶抗原特異性T細胞的抗原磁珠-APC通過磁場分離出來。然后，可以用各種方法活化/擴增分離出來的抗原特異性T細胞，如XCELLERATE技術。另一個改進抗原特異性T細胞陽性分選。這個步驟可用于分離PBMC里的T細胞或已經與抗原或承載抗原的APC結合的T細胞。Current Protocols in Immunology, JohnWiley & Songs, New York. N. Y.里描述的各種免疫分選的方法都可以應用。用于陽性分選的標記包括，但不限于，CD25, CD54, CD69, CD38, CD45R0, CD49d, CD40L, CD137,⑶62L，以及⑶134。另外，熒光活化細胞分選法可用于分選理想的抗原特異性T細胞， 也可以利用肽-MHC四聚體分選抗原特異性T細胞(參閱Atlman, et al. Science 1998Jun. 19;280(5371) :1821)。進一步改進抗原特異性T細胞的基因改造。基因改造包括用常規(guī)的RNA或DNA轉染技術，例如電穿孔法(the Gene Pulser II,BioRad, Richmond, Calif.)，各種陽離子脂質(LIPOFECTAMINE , Life Technologies, Carlsbad, Calif.),或其他技術，例如 CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.描述的憐酸I丐轉染技術。500毫升含5-50 μ g RNA或DNA的Opti-ΜΕΜ與10-100 μ g溶度的陽離子脂質，如LIPOFECTIN 或LIP0FECTAMINW ，室溫下孵育20-30分鐘。產生的核酸-脂質復合物與
1-3χ106(首選2x106)APC細胞在總體積大約2毫升的0pti_MEM，37° C，孵育2-4小時。APC基因改造也可以用下面描述的病毒轉導法?？乖禺愋訲細胞的基因改造也可以用逆轉錄病毒轉導技術。逆轉錄病毒載體可以是雙向逆轉錄病毒載體，最好有一個長末端重復序列(LTR)，例如來自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)，骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，鼠胚胎干細胞病毒(MESV)，鼠干細胞病毒(MSCV)，形成脾病灶病毒(SFFV)，或腺相關病毒(AAV)。大多數逆轉錄病毒來源于鼠逆轉錄病毒。來源于鳥類和哺乳類細胞的逆轉錄病毒都適用于本發(fā)明。這些逆轉錄病毒最好是雙向性的，能感染包括人在內的多種宿主細胞。一種方法是把逆轉錄病毒gag，pol和/或eny序列換成要表達的基因。逆轉錄病毒系統(tǒng)的選用可參考Miller and Rosman (1989)BioTechniques7:980-990;Miller,A.D. (1990)Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpaet al. (1991) Virology 180: 849-852 ; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:8033-8037;and Boris-Lawrie and Temin(1993)Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109。另一方面，基因改造的抗原特異性T細胞可以用常規(guī)的免疫分選法，選用特異性抗體，受體/配體或針對轉染基因表達的蛋白的抗體分選，方法可參考Current Protocolsin Immunology, Hohn Wiley & Sons, New York. N. Y.一個特殊改進抗原特異性T細胞通過轉基因技術表達自殺基因，如單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) (Bonini, et al. Science, 276(5319) :1719-24)和 / 或其它細胞表面標記，例如，用截斷神經生長因子受體dNGFR跟蹤和/或控制輸入的抗原特異性T細胞，或表達靶向腫瘤組織的蛋白。細胞分離和培養(yǎng)可以用常規(guī)組織細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境和容器，包括各種培養(yǎng)袋(如 Lifecell Culture bags)，培養(yǎng)皿，轉瓶，生物反應器 CellCube 或 CELL-PHARM(⑶-Medical，Inc. of Hialeah, Fla.)，皮氏培養(yǎng)皿以及多孔培養(yǎng)板，或其它容器。改進用生物反應器培養(yǎng)細胞，例如，本專利技術可結合現有的細胞培養(yǎng)設備培養(yǎng)T細胞。用于培養(yǎng)APC和抗原特異性T細胞的培養(yǎng)基有RPMI 1640，DMEM，alpha-MEM, AIM-V, HAMS F-12, X-Vivo 15，或 X-Vivo 20.培養(yǎng)基含有的細胞因子包括IL-12，IFN- Y , IL-4，GM-CSF, IL-10，IL-12，TGF^ 以及 TNF-α 和維生素。除此之外，培養(yǎng)基還包含細胞表面活化劑，如抗體，人血漿蛋白或還原劑(如N-乙酰半胱氨酸，2-巰基乙醇)。本專利應用的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的每一個步驟都保證APC和抗原特異性T細胞的生長。按照本專利培養(yǎng)細胞的方法，應用的細胞生長培養(yǎng)基均加入適當的細胞因子，血清，抗生素，維生素，氨基酸以及其它的添加劑。細胞因子包括，但不限于，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4 (IL-4)或白介素13 (IL-13)。其它可以加入的細胞因子和生長因子還有，但不限于，白介素lalpha (IL-Ia)和白介素Ibeta (IL-Ιβ), IL-2,腫瘤壞死因子alpha (TNF-α)，白介素3 (IL_3)，單核細胞集落刺激因子(M-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，干細胞因子(SCF)，白介素6 (IL-6)，白介素15 (IL-15)，以及Flt3配體。首選含有氨基酸和維生素，無/有適當量的血清/血漿或良定集合的激素，和足以支持抗原特異性 T 細胞擴增的 RPMI1640，AIM-V, DMEM, MEM, alpha-MEM, F-12, X_Vivol5，和 X_Vivo20。其中一種培養(yǎng)基的組成是，I升X_Vivol5 (Bioffhittaker)加50ml熱滅活的人血清,20mlIM Hepes, IOml 200mM L-谷氨酸，加也可以不加100，0001. U. IL-2。有時還需要加脂質和/ 或蛋白，如加入1-5%人AB血清或混合的細胞因子。細胞也會適應其它的生長培養(yǎng)環(huán)境，如胎牛血清(FCS/FBS)，不同濃度的血清或無血清培養(yǎng)液。例如無血清培養(yǎng)基加激素也適合培養(yǎng)APC前體細胞。培養(yǎng)基不一定要加入抗菌素來防止細菌的生長。常用抗菌素是青霉素，鏈霉素和慶大霉素單用或聯用。培養(yǎng)過程中要定時添加新鮮培養(yǎng)液，給細胞提供足夠的營養(yǎng)，包括GM-CSF，IL-4，IL-13，IL-15以及其它細胞因子。5、抗原特異性T細胞的擴增抗原特異性T細胞通過細胞表位的結合來重新刺激抗原特異性T細胞的增殖。一個改進與抗原承載的APC接觸后先用上述的方法分離抗原特異性T細胞。另外一個改進抗原特異性T與抗原承載的APC共培養(yǎng)后，直接在APC存在的情況下擴增，無需分離。一個特殊改進用XCELLERATE 活化和擴增抗原特異性T細胞，而無需加入抗原或攜帶抗原的顆粒。相關技術是，提供活體內已受過刺激或激活的抗原特異性T細胞(記憶性T細胞)活化的第一信號，如CD3抗體，以及共刺激信號，如CD28抗體，把這兩種試劑攜帶在同一界面，如順磁微球。細胞培養(yǎng)過程中調整微球與細胞的比例，低比例有利于抗原特異性T細胞的擴增。微球與細胞的比例，如I :200,1 :150,1 125,1 :100，1 -.75,1 :50，I :25，I 20，I :15，I :10，I :5或I :2. 5都可以用于抗原特異性T細胞的擴增。這個技術的好處在于擴增抗原特異性T細胞時無需抗原的參與?？乖禺愋訲細胞的擴增通常除了刺激信號，同時，細胞表面的一種輔助分子與相對應的配體結合。
一般來說，細胞表位的結合完成再刺激，如通過T細胞受體(TCR) /⑶3復合體或⑶2表面蛋白達到。市場有數種⑶3單克隆抗體供選擇，如BC3(XR-⑶3 ；Fred HutchinsonCancer Research Center, Seattle, Wash.)，美國模式培養(yǎng)庫(ATCC)提供的來自雜交瘤細胞的0KT3，以及單克隆抗體G19-4。通過⑶2表面蛋白刺激需要使用至少2種⑶2抗體，這2種抗體的選擇包括Tll. 3抗體配合Tll. I或者Tll. 2抗體(Meuer et al. Cell36:897-906，1984)，9. 6 抗體配合 9. I 抗體(Yang et al. J. Immunol. 137:1097-1100，1986)可以結合上述相同表位的其它抗體也可以應用。抗原，肽，蛋白，肽-MHC四聚體也可以達到再刺激的目的(參閱 Altman, et al. Science 19960ct. 4; 274 (5284) :94-96),超級抗原，如 葡萄球菌腸毒素A (SEA)，葡萄球菌腸毒素B (SEB)，中毒性休克毒素I (TSST-1 )，內毒素，以及不同的促細胞分裂素，包括但不僅限于植物血球凝集素(PHA)，醋酸佛波豆蘧酯(PMA)以及離子霉素，脂多糖，促T細胞分裂素和IL-2。固定在一個界面上的CD3抗體或CD2抗體，或結合了鈣離子載體的蛋白激酶C激活物(如苔蘚抑素)也可以刺激或再刺激抗原特異性T細胞。T細胞表面的共刺激輔助分子要與相對應的配體作用。例如，適當的培養(yǎng)條件下，CD3和CD28抗體刺激CD4+細胞增殖；CD3 抗體和 CD28 抗體 B-T3，XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)刺激 CD28+ 細胞增殖。(參閱 Berg et al. , Transplant Proc. 30(8) :3975-3977, 1998; Haanen et al. , J. Exp. Med 190(9):1319-1328, 1999;Garland et al. , J. Tmmunol. Meth. 227 (1-2):53-63，1999)。要進一步再刺激抗原特異性T細胞，就要用相對應的配體刺激T細胞表面的共刺激分子，如⑶28。常用的配體有⑶28抗體或能與⑶28交聯的片段，或天然⑶28配體。本專利使用的配體包括單克隆抗體 9. 3 (IgG2a) (Bristol-Myers Squibb, Princeton, N. J.),K0LT-2 (IgGl), 15E8 (IgGl),248. 23. 2 (IgM)，克隆 B-T3 (XR-CD28) (Diaclone,Besancon,France)以及EX5. 3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。天然配體包括B7 蛋白家族，如 B7_1(CD80)和 B7-2 (CD86) (Freedman et al. , J. Tmmunol. 137:3260-3267, 1987;Freeman et al. , J.Tmmunol. 143:2714-2722，1989;Freeman et al. , J. Exp. Med. 174:625-631，1991;Freemanet al. , Science 262:909-911, 1993;Azuma et al. , Nature366:76-79, 1993;Freeman etal, J. Exp. Med. 178:2185—2192，1993)。進一步改進通過刺激T細胞的其它結構蛋白促進T細胞的活化,例如,天然配體ICAM-I與T細胞整合素LFA-I結合；很晚期抗原4 (VLA-4)與另外一個可作為共刺激因子的細胞表面分子VCAM-I結合(CD106)結合增進T細胞的活化。活化的T細胞表面表達的共刺激受體4-1BB (CD137)與NKG2D結合擴展T細胞介導的免疫反應。特別需要提的是，同時刺激兩個以上(任何兩個)這些共刺激因子有助于實現T細胞擴增的預期目標。另外，其它的無論是天然的還是用化學或基因重組技術合成的配體還包括，但不僅限于，其它抗體或片段，肽，多肽，生長因子，細胞因子，趨化因子，糖肽，可溶性受體，糖皮質激素，激素，促細胞分裂劑，如PHA，或其它超級抗原?？梢杂貌煌姆椒ㄌ峁㏕細胞激活的初始信號和共刺激信號。例如，提供信號的每個試劑可以溶解在液體中或鏈接在一個界面上。如果是鏈接在界面上，初始信號和共刺激信號刺激劑就需要以不同的方式(順式和反式)鏈接在同一界面?；蛞粋€試劑溶解在液體中，另一個鏈接在界面。一個改進共刺激信號結合在細胞表面，而初始信號試劑溶于液體中或鏈接在界面。另外改進兩種試劑在液體中，另外改進可溶性試劑溶解在液體中，然后交聯到一個界面，如表達Fe受體的細胞或可與其結合的抗體或其它因子。優(yōu)先改進把兩種試劑固定在微球表面，或是同一微珠(cis)或不同微珠(trans)。例如，提供初始活化信號的試劑用CD3抗體，提供共刺激信號的試劑是CD28抗體；兩種試劑以相同的分子量固定在一個界面，如微球表面。一個改進兩個抗體以I :1的比例結合在微球表面用于擴增和培養(yǎng)⑶4+細胞。本專利的重要發(fā)現之一降低微球上⑶3抗體與⑶28抗體的比例增進T細胞，包括抗原特異性T細胞在內的擴增。結合在微球上的CD3 CD28抗體的最佳的比例是通過一系列不同比例與I :1比較它們的擴增效率后得出來的。特殊改進:與I :1比較，擴增數量增加O. 5至大約3倍，結合微球的CD3:CD28抗體比例從100 :1至I :100之間比較。進一步地微球上的⑶28抗體多于⑶3抗體，即⑶3:⑶28小于I ;進一步地微球上的⑶28抗體與⑶3抗體的比例大于2:1。優(yōu)選地微球上的⑶3抗體與⑶28抗體的比例是I :100 ;更優(yōu)選地微球上⑶3抗體與⑶28抗體的比例分別是I :75，1 50,1 :30，I : 10，I :3以及3 :1。用于刺激T細胞的微球與細胞的比例從I :500至500 :1不等，根據微球大小與靶細胞的關系而定。因為微球小結合的細胞數量就少，微球大結合細胞的數量就多。進一步地微球與細胞的比例從I :100到100 1之間。優(yōu)選地選擇I :9到9 :1之間用于刺激T細胞。如上所述，能刺激T細胞擴增的連接在微球表面的CD3與CD28抗體的比例可以不同，但是，改進后的比例是I :150或更低。優(yōu)先考慮的比例是1 :150,1 :100,1 :75，I :50，I :40，I 30,1 25,1 20,1 :15，I :20，I :15，I :10，I :9，I :8，I :7，I :6，I :5，I :4，I :3，I 2. 5，I :2，I :1，2 :1，3 :1，4 :1，5 :1，6 :1，7 :1，8 :1，9 :1，10 :1，15 :1 和 20 :1。一個改進微球與細胞的比例是I :1或以下。一個特別改進首選I :2. 5或I :5。進一步改進微球與細胞的比例在刺激過程中的不同時間調整，例如，其中一個改進第一天微球與細胞的比例從I :5，I :2.5,1 1至10 :1，接著根據細胞計數每天或每隔一天加入微球，使微球與細胞的終比例從I :1，I :5，I 20,1 25,1 :50或I :100。特殊一個改進第一天刺激的微球與細胞的比例是I :2. 5，I :5或I :1，第三天和第五天調整為I :5。進一步改進第一天微球與細胞的比例是I :2. 5,1 :5，或 I :1，第五、七、九天調整到 I :10，1 :20，I :25，I 50 或 I :100。另一個改進第一天，微球以I :1的比例加入細胞內，第三和第五天以I :5的比例加入。另一個改進第一天微球與細胞的比例是2 :1，第三和第五天調整到I :10。另一個改進每天或隔天加入微球使第一天微球與細胞的比例是I :1，第三和第五天的比例是I :10。專利的一個重大發(fā)現微球與細胞的比例不同導致抗原特異性T細胞的擴增結果也不一樣。特別是，改變微球與細胞的比例可以選擇性擴增或抑制抗原特異性T細胞。一個改進選擇微球與細胞的特殊比例抑制抗原特異性T細胞增殖。另一個改進選擇微球與細胞的特殊比例促進抗原特異性T細胞的擴增。例如，選擇微球與細胞的比例I :100，1 50，I 25,1 :5或I :2. 5用于擴增抗原特異性T細胞。而且，在細胞培養(yǎng)的不同時間(如第五、七、九天)加入很低比例的微球(I :10，1 :25，1 :50，1 :100)可以提高甚至促進記憶性細胞的擴增。微球與細胞開始時的比例是I :5或I :2. 5，第五和第七天把比例調至I :10，1 25直至I :50和I :100似乎保留和加強記憶性細胞的進一步擴增，這種現象在單一刺激的時候是看不到的。因此，這里描述的微球與細胞比例和方法可以用來選擇性地擴增或去除 不同T細胞，應用于不同的免疫治療。注意這里描述的微球與細胞比例適用于攜帶各種比例抗體的微球。例如，⑶3抗體與⑶28抗體以I :5至I :10的比例結合的微球可以用于微球與細胞比例介于I :5至I 10之間，而I :1的⑶3與⑶28比例的微球也可以用于I :5微球與細胞比例。因此，⑶3與⑶28抗體的比例從100 :1至I :100之間的微球適用于任何微球與細胞比例在I :500至500 1之間。T細胞激活12-14天后把它們分離出來，維持它們的激活狀態(tài)。定期(如每天)檢測T細胞的增殖率，例如觀察T細胞的大小或用庫爾特計數器測量T細胞的體積。靜息T細胞平均直徑大約是6. 8 μ M，在刺激因子存在的情況下，第四天平均直徑可以增加至12 μ M以上，大約第六天開始縮小。當T細胞的直徑減小到大約8 μ M時，可以再一次刺激誘導進一步增殖。除此之外，還可以根據T細胞表面的活化分子表達，如⑶154，⑶54，⑶25，⑶137，CD 134等監(jiān)測T細胞的增殖率和確定再刺激的時間。一個改進用包被有⑶3和⑶28抗體的微球(⑶28微球3倍于⑶3微球)充分刺激(大約8-14天)使T細胞回到靜息狀態(tài)(低或無增殖狀態(tài))。去除微球后，洗滌T細胞，然 后回輸入患者體內。這樣的T細胞表現記憶性，能及時對抗原作出反應，處于極佳的可誘導狀態(tài)。無論是體外再刺激還是回輸后體內對抗原的反應，活化的T細胞都穩(wěn)定表達CD154，并增加細胞因子的合成。進一步改進細胞，如T細胞與包被試劑的微球結合，然后分離，接著培養(yǎng)細胞?；蛘吲囵B(yǎng)前，沒有分離試劑包被的微球，而是與細胞一起培養(yǎng)。進一步改進用外力使細胞和微球集中濃縮在一起，促使細胞表位結合，刺激細胞。另一個改進調整刺激劑，如包被在微球上的⑶3/⑶28抗體，與T細胞的培養(yǎng)時間來獲得理想的T細胞表型。調整培養(yǎng)條件可以獲得想要的細胞群，如輔助性T細胞(Th)擴增，通常是指CD4+細胞而不是CD8+細胞(細胞毒或抑制性細胞，Tc), Th細胞擴增能誘發(fā)抗腫瘤、抗病毒、抗細菌的效應器功能。CD4+細胞分泌很重要的免疫調節(jié)因子，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，⑶40L以及IL-2。需要⑶4介導的免疫應答時，應用本專利描述的培養(yǎng)方法，提高CD4與CD8細胞的比例特別有幫助。一方面，提高輸入細胞中分泌GM-CSF或IL-2細胞的量，因為這些因子主要是CD4細胞分泌的。相反，需要提高Y干擾素水平時，就需要增加CD8+細胞的數量，應用這里描述的活化T細胞的方法，先分選CD8+細胞，再刺激或培養(yǎng)擴增。有時根據需要使用！^/!^細胞比例，或它們的上清液。有時還需要用到調節(jié)性T細胞。為了有效分離不同抗原特異性T細胞，細胞表位結合，誘導再次刺激的時間長短可能不同或有波動。例如，細胞的表達取決于擴增時間的長短和/或不同的刺激劑(如抗體或其片段，肽，多肽，MHC/肽多聚體，生長因子，細胞因子，趨化因子，糖肽，可溶性受體，糖皮質激素，激素，促細胞分裂素，如ΡΗΑ，或其它超級抗原)。細胞表面標記的表達隨時間而變，因此，控制培養(yǎng)時間和刺激劑的類型可以獲得特殊的T細胞。根據細胞類型，應用相應的刺激劑和培養(yǎng)時間，從4周到I周不等，或更短的時間。改進刺激和擴增6-2天，甚至更短的時間，如24小時或更短時間，最好4-6小時內完成?？s短刺激T細胞的時間，T細胞的數量可能不會大量增加，但這些健康且穩(wěn)固的抗原特異性T細胞相當于活體T細胞池內的效應細胞能不斷增殖。一個改進細胞混合培養(yǎng)數小時(大約3小時)至大約14天，或21天。另優(yōu)選地細胞與微球混合培養(yǎng)大約8天。更有選地Τ細胞與微球共培養(yǎng)2-3天。細胞可能需要幾次刺激，T細胞的培養(yǎng)時間可長達60天或更長。適當的T細胞培養(yǎng)系統(tǒng)應該是培養(yǎng)基(如基本必須培養(yǎng)基或RPMI 1640，X-vivol5 (BioWhittaker))加上細胞活力和增殖因子，包括血清(胎?；蛉搜?，白介素-2 (IL-2)，胰島素，Y -干擾素(INF- Y )，IL_4，GM-CSF, IL-10，IL-12，TGF-β , TNF-α以及其它需要加入的細胞生長因子。其它細胞生長因子包括，但不限于，表面活性劑，人血漿蛋白和還原劑，如N-乙酰半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養(yǎng)基包括RPMI1640, AIM-V, DMEM, MEM, α -MEM，F-12，X_Vivol5，和 X_Vivo20 加入氨基酸和維生素，無血清或適當量血清或血漿，或固定的幾種激素和/或足以使T細胞生長和擴增的細胞因子?？咕刂挥糜谠囼炛械募毎囵B(yǎng)，用于輸入到體內的細胞培養(yǎng)不用抗菌素。細胞在37°C，100-120%的空氣濕度以及5%C02的條件下培養(yǎng)。一些改進加入一定量的供給細胞加強活化和/或擴增抗原特異性T細胞的效果。供給細胞可以單用自體或異體的輻射后的外周血淋巴細胞或與EBV轉化的B細胞系(自體或異體)同用，永生化或非永生化髓系單核細胞系，如巨噬細胞，樹突狀細胞，紅細胞，B細胞，腫瘤細胞系，如 U937, Jurkat, Daudi, MOLT-4, HUT, CEM, Colo205, HTB-13 和 HTB-70。供給細胞不一定用人源細胞，只要有供給功能的，例如能支持原代T細胞和后來的抗原特異 性T細胞的存活和生長，就可以用。6、有益效果腫瘤抗原特異性T細胞表達中央記憶性T細胞標記CMV溶解物與Dynabead M-450混和，室溫孵育1_2小時后洗滌一次，加入PBMC ;數小時后APC吞噬攜帶CMV抗原的微球；72小時內，CMVpp65特異性⑶8+T細胞表達中央記憶性T細胞標記,如圖I所示。腫瘤抗原特異性T細胞(試驗組)與相應腫瘤細胞共培養(yǎng)時白介素2 (IL-2)和伽瑪干擾素(IFN-Y )分泌明顯增高(與對照組比較)，提示其抗腫瘤活性(表I示)。表I:
權利要求
1.一種腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，包括產生和擴增方法，其特征在于，所述產生方法是將含有抗原提呈細胞(APC)的第一群細胞與包被有抗原的界面接觸，讓APC攝取包被在界面上的抗原；再將含有T細胞的第二群細胞與攝取了抗原的第一群細胞共培養(yǎng)，產生抗原特異性T細胞。
2.根據權利要求I所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在于，所述APC直接與抗原特異性T細胞接觸，與抗原特異性T細胞直接接觸的APC是用磁場分離。
3.根據權利要求I或2所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在于，所述擴增方法是將抗原特異性T細胞植入包被有第一試劑的培養(yǎng)界面擴增，再轉入包被有第二試劑的培養(yǎng)界面；所述第一試劑和第二試劑是相同或者不同的抗體或抗體片段；所述界面為磁珠、脂質或細胞。
4.根據權利要求3所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在干，界面的空間與 T 細胞的比例選擇 I :2，I :2. 5，I :5，I 25,1 :50，I :75，I :100。
5.根據權利要求4所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在于，所述第一試劑是CD3或CD2抗體或其片段，所述第二試劑用CD28抗體或其片段。
6.根據權利要求5所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在干，T細胞的擴增時加入促細胞分裂素、白介素15、天然CD137蛋白、CD137抗體、NKG2D抗體或/和天然NKG2D蛋白。
7.根據權利要求6所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在干，所述促細胞分裂素選用植物血球凝集素(PHA)，豆蓮酸-佛波醇-こ酸酯(PMA)和離子素，脂多糖(LPS),以及超級抗原。
8.根據權利要求I所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在于，所述抗原為抗體/抗原復合物、腫瘤或病毒感染的細胞、固定的腫瘤或病毒感染的細胞、高溫滅活的腫瘤或病毒感染的細胞、腫瘤細胞裂解物、不溶解的細胞碎片、細胞凋亡體、壞死細胞、滅活的腫瘤細胞、放射滅活的異體細胞、天然或合成的碳水化合物、脂蛋白、脂多糖、以及基因改造的細胞。
9.根據權利要求8所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在干，APC來源于外周血單個核細胞采集，淋巴結，扁桃體，活檢組織，腫瘤組織，脾臟，骨髄，臍血，CD34+細胞或單核細胞。
10.根據權利要求I所述的腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，其特征在于，抗原是通過抗體/配體的相互作用吸附或者通過化學反應的方法包被到載體的界面上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腫瘤抗原特異性T細胞的獲取方法，包括產生和擴增方法，所述產生方法是將含有抗原提呈細胞(APC)的第一群細胞與包被有抗原的界面接觸，讓APC攝取包被在界面上的抗原；再將含有T細胞的第二群細胞與攝取了抗原的第一群細胞共培養(yǎng)，產生抗原特異性T細胞。一種能產生大量反應性極高的抗原特異性T細胞的方法，獲得的T細胞無論是細胞表面受體表達還是細胞因子的分泌都是現有其它培養(yǎng)系統(tǒng)無法比擬的。用此方法無需知道特殊抗原(當然已知的抗原也可以應用)，經1-2次擴增就能達到治療量，包含CD4和CD8系列的抗原特異性T細胞，而且可以根據需要分選CD4或CD8細胞。
文檔編號C12N5/0783GK102816734SQ20121014200
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權日2012年5月9日
發(fā)明者阮潤生 申請人:阮潤生