專利名稱：用于調(diào)控作物株高的基因、多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域；本發(fā)明涉及到調(diào)控作物株高的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，對(duì)于農(nóng)作物高產(chǎn)育種的選育主要集中在株型和穗部性狀的改良。由于品種的改良，目前已經(jīng)培育出多種高產(chǎn)農(nóng)作物品種。然而，當(dāng)前的許多高產(chǎn)作物如水稻高產(chǎn)栽培品種尤其超級(jí)雜交稻存在一定的株高過高問題，導(dǎo)致容易倒伏、產(chǎn)量潛力受到限制的問題。這在很大程度上影響了作物產(chǎn)量的進(jìn)一步提高和高產(chǎn)品種的推廣。因此，本領(lǐng)域有必要研究可調(diào)節(jié)農(nóng)作物株高的方法，從而進(jìn)一步改良農(nóng)作物的性狀，矮化作物更適合于抵抗對(duì)外部環(huán)境的不利影響，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，通過研究調(diào)控農(nóng)作物株高的和機(jī)制方法，提供一種控制植物株高基因Tal，為改良農(nóng)作物株高和生育期性狀，提高農(nóng)
作物的產(chǎn)量建立了基礎(chǔ)。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明解決方案的具體內(nèi)容如下一種用于調(diào)控作物株高的基因，該基因的序列是SEQ ID NO: 1—6中的任意一種。一種分離的作物株高調(diào)節(jié)多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO: 7 — 9所示氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO: 7 — 9所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調(diào)節(jié)作物株高功能的由(a)衍生的多肽。一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組編碼如上所述多肽的多核苷酸(a);或與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。一種載體，它含有上面所述的多核苷酸。一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有以上所述的載體。一種多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)以上所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出作物株高調(diào)節(jié)多肽。包含所述多肽或其編碼基因的激動(dòng)劑或拮抗劑，可用于調(diào)節(jié)作物的株高、生育期或產(chǎn)量；或制備調(diào)節(jié)作物的株高、生育期或產(chǎn)量的物質(zhì)，或通過調(diào)節(jié)作物中基因的表達(dá)或活性，以實(shí)現(xiàn)對(duì)作物株高的調(diào)節(jié)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明分離的6個(gè)基因包含若干個(gè)堿基的差別，基于這些序列，我們構(gòu)建了 6個(gè)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)入到水稻植株里。通過定量PCR方法，我們檢測(cè)到了這些基因在所有轉(zhuǎn)基因植株里的表達(dá)，表達(dá)的結(jié)果證實(shí)了這些基因在轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)水平是明顯增加(相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账?。我們的發(fā)明中，Tal基因在水稻內(nèi)的過表達(dá)很可能改變了一些發(fā)育代謝關(guān)鍵代謝途徑酶的復(fù)雜催化反應(yīng)，形成了在我們的轉(zhuǎn)基因水稻植株中出現(xiàn)的各種不同的植株表型變化。本發(fā)明取得的Tal基因?qū)樗?、小麥等作物生長發(fā)育過程中該基因所扮演的角色提供一個(gè)更加深入的理解，以便可以更好的在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面提供指導(dǎo)，改良農(nóng)作物性狀，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。


圖I為Tal-I基因在3個(gè)月大野生型水稻(日本晴)和轉(zhuǎn)基因水稻植株中過表達(dá)引起的表型改變對(duì)比圖；圖2為Tal-2基因在3個(gè)月大野生型水稻(日本晴)和轉(zhuǎn)基因水稻植株中過表達(dá)引起的表型改變對(duì)比圖；
圖3為Tal-3基因在3個(gè)月大野生型水稻(日本晴)和轉(zhuǎn)基因水稻植株中過表達(dá)引起的表型改變對(duì)比圖；圖4為Tal-4基因在3個(gè)月大野生型水稻(日本晴)和轉(zhuǎn)基因水稻植株中過表達(dá)引起的表型改變對(duì)比圖；圖5為Tal-5基因在3個(gè)月大野生型水稻(日本晴)和轉(zhuǎn)基因水稻植株中過表達(dá)引起的表型改變對(duì)比圖；圖6為Tal-6基因在3個(gè)月大野生型水稻(日本晴)和轉(zhuǎn)基因水稻植株中過表達(dá)引起的表型改變對(duì)比圖；圖7為Tal-I基因在轉(zhuǎn)基因和野生型水稻中表達(dá)水平差別的定量PCR分析結(jié)果；圖8為Tal-2基因在轉(zhuǎn)基因和野生型水稻中表達(dá)水平差別的定量PCR分析結(jié)果；圖9為Tal-3基因在轉(zhuǎn)基因和野生型水稻中表達(dá)水平差別的定量PCR分析結(jié)果；圖10為Tal-4基因在轉(zhuǎn)基因和野生型水稻中表達(dá)水平差別的定量PCR分析結(jié)果；圖11為Tal-5基因在轉(zhuǎn)基因和野生型水稻中表達(dá)水平差別的定量PCR分析結(jié)果；圖12為Tal-6基因在轉(zhuǎn)基因和野生型水稻中表達(dá)水平差別的定量PCR分析結(jié)果；圖13為轉(zhuǎn)Tal基因水稻株高統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包含了從小麥中克隆Tal基因，并在水稻表達(dá)并表現(xiàn)出具有的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步的研究該基因在禾本科植物生長發(fā)育過程中所扮演的角色提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)。本發(fā)明所進(jìn)行的研究能夠幫助我們更好的理解該基因并進(jìn)一步的應(yīng)用于控制作物高度及控制產(chǎn)量等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。材料和方法I .植物材料本發(fā)明選取小麥品種中國春對(duì)Tal基因片段進(jìn)行分離，采用水稻品種日本晴作為轉(zhuǎn)基因模型。所有水稻植株的種植和生長階段都在實(shí)驗(yàn)大田中完成，用于進(jìn)行基因表達(dá)分析的田間植株樣品都在液氮中直接收集和凍干以便進(jìn)行下階段的分子生物學(xué)驗(yàn)證。2 Tal編碼基因的鑒定和分離
我們采用Trizol 試劑(Invitrogen, http://www. invitrogen. com/)對(duì)小麥植株的總RNA進(jìn)行了提取,之后利用反轉(zhuǎn)錄酶(SuperScript III First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR,，Invitrogen)構(gòu)建了我們所需要的cDNA文庫。通過數(shù)據(jù)庫資源等，找到和鑒定了一個(gè)可能具有編碼Tal基因的全長cDNA序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物(Tal sense primer 5’- GAGAGCATCTCCCCTGTTCC-3’ ; Tal anti-sense primer 5’ -TGGTTCACACTAACTAACTATTCATCA-3’ )并在小麥當(dāng)中擴(kuò)增出了實(shí)驗(yàn)所需的基因片段。針對(duì)該基因片段，我們通過克隆和 測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了基因序列的可靠性。PCR程序初始變性(I個(gè)周期，94°C，3分鐘)，變性(35個(gè)循環(huán)，94°C，I分鐘)，引物退火(35個(gè)循環(huán)，58°C，30秒)，引物延伸(35個(gè)循環(huán)，72°C，90秒)，最后延伸(I個(gè)周期，72°C，10分鐘)，4°C保存。3 Tal過表達(dá)載體的構(gòu)造根據(jù)擴(kuò)增基因片段的測(cè)序結(jié)果以及在此基礎(chǔ)上對(duì)序列進(jìn)行的聯(lián)配分析，我們利用包含有酶切位點(diǎn)(KpnI 和 SacI)的特異引物(sense 5，- GGTACCCTCTGCTTCTTTAG-3，;anti-sense 5’ - GAGCTCACACGCACACGCAC-3’ )對(duì)選取的 6 個(gè) Tal 同源基因進(jìn)行了 PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后被連接到pGEM _T Easy載體(Promega公司，http: //www. promega.com/)進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序驗(yàn)證。由于特異引物當(dāng)中所包含的酶切位點(diǎn)，使得PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物可以被KpnI和SacI酶切。酶切后PCR產(chǎn)物即被用來裝載到擁有玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子的過表達(dá)載體PUN1301，并連同該載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中，之后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入水稻日本晴植株當(dāng)中。4 .定量PCR分析檢測(cè)6個(gè)轉(zhuǎn)基因系列的水稻總RNA經(jīng)Trizol提取和RNase-freeDNA酶I (Promega公司)純化后，分別構(gòu)建了各自的cDNA文庫。構(gòu)建好的cDNA文庫作為模板，進(jìn)過下一步的PCR擴(kuò)增。通過Taq聚合酶(Takara公司)，我們對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生對(duì)照水稻植株的分別進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。為了檢測(cè)編碼基因在轉(zhuǎn)基因水稻和野生對(duì)照植株中的表達(dá)水平的差異，我們選取了 ubiquitin (Ubi-I)作為對(duì)照引物(5' -TAAGCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3')和 Ubianti-sense (5' -CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3')，來擴(kuò)增和標(biāo)定編碼基因的表達(dá)，之后再通過基于編碼基因的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別檢測(cè)和分析6個(gè)Tal基因在轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照間的表達(dá)水平上的差異。PCR程序初始變性(I個(gè)周期，94°C，3分鐘)，變性(35個(gè)循環(huán)，94°C，30秒)，引物退火(35個(gè)循環(huán)，58°C，30秒)，引物延伸(28個(gè)循環(huán)，72°C，90秒)，最后延伸(I個(gè)周期，72°C，10分鐘)，4 °C保存。對(duì)于特殊引物，PCR循環(huán)數(shù)增加到35個(gè)。5 .序列信息分析通過對(duì)6個(gè)編碼基因的DNA測(cè)序結(jié)果(命名為Tal_l 6，序列信息見SEQ IDNO. 1-6)，我們分析了 6個(gè)Tal基因編碼的蛋白序列。序列分析結(jié)果表明，這6個(gè)Tal基因共編碼了 4種蛋白(序列信息見SEQ ID NO. 7-10 ；Tal-l, Tal-2和Tal-6編碼同一種蛋白序列SEQ ID NO. 7，Tal-4編碼一種蛋白序列SEQ ID NO. 8，Tal-5編碼一種蛋白序列SEQ IDNO. 9，Tal-3 編碼一種蛋白序列 SEQ ID NO. 10)。實(shí)施例ITal在小麥中的鑒定和分離
基于一個(gè)候選基因序列，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)在中國春小麥品種中隨機(jī)選擇了 8個(gè)克隆并進(jìn)行了測(cè)序。6個(gè)克隆中的每一個(gè)克隆序列的長度都至少有1530bp，并且它們之間都至少包含一個(gè)堿基的差別和一個(gè)完整的ORF (見序列信息SEQ ID NO. 1-6)。這6個(gè)基因被進(jìn)一步的轉(zhuǎn)入到日本晴水稻品種中來驗(yàn)證其具體的功能。實(shí)施例2Tal在轉(zhuǎn)基因水稻中的過量表達(dá)為了驗(yàn)證Tal基因?qū)χ仓晟L的影響，我們構(gòu)建了一個(gè)包含玉米u(yù)biquitin啟動(dòng) 子過表達(dá)載體PUN1301并且將這6個(gè)編碼基因轉(zhuǎn)入到水稻中?；诓煌腡al基因編碼序列，總共構(gòu)建了 6個(gè)過表達(dá)載體并標(biāo)記為Tal-f 6。在載體成功轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)基因水稻植株中，我們可以發(fā)現(xiàn)，Tal-1，Tal-2, Tal_4，Tal_5和Tal_6基因過量表達(dá)植株系列都表現(xiàn)出了顯著地矮化表型，但Tal-3過表達(dá)系則未表現(xiàn)出與野生型相比明顯的表型改變。(見圖1-6)。在這些表現(xiàn)出非正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻中，Tal-2系列轉(zhuǎn)基因水稻的矮小化表型與其它植株相比表現(xiàn)的更加明顯，這一系列的植株基本上都很難達(dá)到抽穗期。而在其它的轉(zhuǎn)基因水稻植株當(dāng)中不同階段的表型，從與野生型只有略微差別到嚴(yán)重矮化且沒有明顯的節(jié)間都能在同一轉(zhuǎn)基因系列中觀察到(見圖1-6)。這一結(jié)果從我們對(duì)這些植株的高度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中也能反應(yīng)出來(見圖13)。例如，在Tal-2系列植株中，高度最高的植株也只有約20厘米而該系列的平均高度僅為12厘米。這一系列與同時(shí)期非轉(zhuǎn)基因水稻(高度約為80厘米)相比，具有非常顯著的矮小化的表現(xiàn)。除了 Tal-3系列，其它系列的轉(zhuǎn)基因水稻的表型都發(fā)生了明顯的矮小變化，并且平均高度都在30厘米以下。在Tal-3轉(zhuǎn)基因株中，我們觀察不到與正常非轉(zhuǎn)基因水稻明顯的表型差別，對(duì)高度進(jìn)行的測(cè)量和分析結(jié)果也看不出明顯的區(qū)別。就我們得到的這些小麥中Tal酶在水稻中產(chǎn)生了一些明顯表型變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為我們發(fā)現(xiàn)的這些基因在小麥和水稻等作物生理代謝途徑當(dāng)中是發(fā)揮重要功能的。對(duì)這些基因功能的深入研究將使幫助我們更好的認(rèn)識(shí)小麥等作物相關(guān)代謝途徑并進(jìn)一步在生產(chǎn)當(dāng)中對(duì)小麥等的植株性狀加以控制以獲得更高的單位產(chǎn)量。實(shí)施例3Tal基因轉(zhuǎn)錄分析我們對(duì)Tall-I 6系列基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)進(jìn)行了全面的鑒定，當(dāng)中包含了表現(xiàn)出明顯矮小化表型的植株和這些與野生型無明顯差別的轉(zhuǎn)基因植株。我們采用定量PCR技術(shù)對(duì)這些植株進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明這些編碼基因在轉(zhuǎn)基因水稻植株中與我們的野生型對(duì)照相比獲得了明顯的表達(dá)上調(diào)，當(dāng)中包括了 Tal-3系列和為了確保Tal基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性而設(shè)置的重復(fù)轉(zhuǎn)錄組(見圖1-12)。在幾個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻系列的表型比較結(jié)果當(dāng)中，Tal-3系列并沒有獲得明顯的矮小化趨勢(shì)，但定量PCR鑒定的結(jié)果表明，Tal基因在我們?cè)O(shè)置的三個(gè)Tal-3植株重復(fù)對(duì)照中的表達(dá)都是上調(diào)的，得到這一結(jié)果的原因可能是由于Tal-3基因在轉(zhuǎn)基因水稻當(dāng)中處于非活躍狀態(tài)(見圖1-12)。在其它轉(zhuǎn)基因水稻系列的定量PCR檢測(cè)結(jié)果中，所有檢測(cè)樣本的Tal編碼基因都是極大上調(diào)的，這一基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果證明了小麥Tal編碼基因?qū)е铝酥旮弑硇偷某霈F(xiàn)并進(jìn)一步驗(yàn)證了這一基因的表達(dá)可以改變水稻的生理過程以及植物生長發(fā)育。
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)控作物株高的基因，其特征在于，該基因的序列是SEQ ID NO: I 一 6中的任意一種。
2.一種用于調(diào)控作物株高的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸序列是 (a)SEQ ID NO: 7 — 9中的任意一種；或 (b)將SEQID NO: 7-9中的任意一種經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，包含一核苷酸序列，該核苷酸序列是 (a)編碼權(quán)利要求2所述多肽的多核苷酸；或 (b)與編碼權(quán)利要求2所述多肽的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQID NO: 7-9所示氨基酸序列的多肽。
5.—種載體,其特征在于,該載體包含權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包括步驟 (a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞； (b)從培養(yǎng)物中分離出作物株高調(diào)節(jié)多肽。
8.權(quán)利要求2所述的多肽的用途，其特征在于，是用于調(diào)節(jié)作物的株高、生育期或產(chǎn)量；或制備調(diào)節(jié)作物的株高、生育期或產(chǎn)量的物質(zhì)。
9.一種調(diào)節(jié)作物株高、生育期或產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括通過調(diào)節(jié)作物中基因的表達(dá)或活性，以實(shí)現(xiàn)對(duì)作物株高的調(diào)節(jié)。
10.一種包含權(quán)利要求2所述的多肽或其編碼基因的激動(dòng)劑或拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域，旨在提供一種用于調(diào)控作物株高的基因、多肽及其應(yīng)用。該基因的序列是SEQ ID NO: 1－6中的任意一種。本發(fā)明所提供的基因能夠明顯調(diào)節(jié)作物株高，從而可以更好地控制水稻等作物株高，保障產(chǎn)量，達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的目的。本發(fā)明的基因是對(duì)作物改良和育種工作中有重要應(yīng)用價(jià)值的基因。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102703468SQ20121014288
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者唐設(shè), 李群, 樊龍江, 趙文芳, 陳歡 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 浙江大學(xué)