專利名稱：柑橘潰瘍病的pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種柑橘潰瘍病的檢測方法，尤指一種檢測柑橘潰瘍病(Xanthomonasaxonopodis pv. citri)的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法。
背景技術(shù)：
柑橘潰瘍病(CirtusBacterial Canker Disease, CBCD)是一種在部分柑橘栽培地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生的由地毪草黃單胞柑橘致病變種[Xanthomonas axonopodi spv. citrri (Hasse)Dye]所引起的檢疫性細(xì)菌病害。在自然條件下，該病菌可隨風(fēng)雨傳播、擴(kuò)散，主要侵染途徑為氣孔、皮孔或傷口，可侵染植物的葉片、葉莖、枝條以及果實(shí)，導(dǎo)致植物體的衰弱和枯死，嚴(yán)重的情況下能造成植株大量落葉、落果，甚至全株死亡；染病果實(shí)即使未脫落，也會在其表皮形成開裂、結(jié)疤狀潰瘍斑，大大降低果實(shí)的外觀、品相，對其銷售和出口造成不良影響。且該病菌傳播能力強(qiáng)，一旦在新區(qū)發(fā)生，則需要大量的人力物力進(jìn)行防治，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病菌已經(jīng)被列為我國進(jìn)境和國內(nèi)檢疫性有害生物。美國、巴西、阿根廷、土耳其、伊朗、西班牙、意大利等全球30多個(gè)許多國家和地區(qū)，都將其列為檢疫性有害生物，對柑橘潰瘍病菌實(shí)施檢疫，并禁止其出口和輸入。商業(yè)化生產(chǎn)中，柑橘潰瘍病近距離和中距離傳播的主要途徑是風(fēng)雨、蟲害產(chǎn)生的傷口和植株之間的相互摩擦。此外，在果園管理維護(hù)中的嫁接、修剪、噴灌等人為活動(dòng)也有利于柑橘潰瘍病在植株間的傳播。其遠(yuǎn)距離傳播則主要通過種苗、接穗、砧木的運(yùn)輸交易來實(shí)現(xiàn)，含細(xì)菌的包裝物、集裝箱、園藝工具也有一定的傳播可能。因此，建立快速、高效的柑橘潰瘍病菌檢測技術(shù)，是防治柑橘潰瘍病的重要基礎(chǔ)。目前，通過PCR技術(shù)檢測柑橘潰瘍病，主要是利用王中康等人根據(jù)柑橘潰瘍病菌全基因組中獨(dú)有的保守蛋白基因序列而篩選到特異引物(YF5 :5，-TTC GGC GTC AAC AAC CTG-3，JYR5 :5，-AAC TCC AGC ACA TACGGG TC-3’)。王中康等人建立的柑橘潰瘍病菌檢測方法雖然具有較高的靈敏度，但有時(shí)會擴(kuò)增到3條大小不同的片段，影響了該引物的適用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能準(zhǔn)確鑒定柑橘潰瘍病的PCR檢測方法。該方法所使用的一對引物是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列,本檢測方法所使用的這對引物有別于其它檢測技術(shù)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，該方法是以柑橘潰瘍病菌的特異性引物對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定。該特異性引物為正向引物(XCGlF):5，-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3’ (如 SEQID No 1 所示)，反向引物(XCG2R):5，-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3’ (如 SEQID No 2 所示)。
上述特異性引物的設(shè)計(jì)是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因(gyrasesubunit B)的核苷酸序列，PCR產(chǎn)物大小為750bp。對本發(fā)明方法詳細(xì)敘述如下一、引物設(shè)計(jì)本發(fā)明人利用原核生物進(jìn)化過程中核酸序列的保守性，從NCBI搜索并下載柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri strain ICMP 10022)的促旋酶 B 亞單位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列(序列號為EU499045),運(yùn)用Premier軟件得到一些候選引物，最后通過篩選，設(shè)計(jì)出一對引物 引物I(XCGlF) :5，-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3，引物2 (XCG2R) 5，-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3，。將引物I和引物2分別經(jīng)BLAST檢索，見下表I及表2，結(jié)果表明，與引物I和引物2的序列100%覆蓋且100%相同的全部是柑橘潰瘍病菌的核苷酸序列。表I柑橘潰瘍病菌引物I (XCGlF)的BLAST結(jié)果
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權(quán)利要求
1.一種柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，其特征在于該方法是以柑橘潰瘍病菌特異性引物對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定；該特異性引物為 正向引物5’ - CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT -3’ 反向引物5’ - GGTTGACCGTGGTTTCCCATA -3’。
2.如權(quán)利要求I所述的柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，其特征在于所述特異性引物的設(shè)計(jì)是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因的核苷酸序列，PCR產(chǎn)物大小為750bp。
全文摘要
一種柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，是以柑橘潰瘍病菌特異性引物對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定；該特異性引物是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因(gyrase subunit B )的核苷酸序列設(shè)計(jì)的。本檢測方法所使用的這對引物有別于其它檢測方法，可以用于快速檢測出柑橘潰瘍病。
文檔編號C12R1/64GK102634603SQ20121014336
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者戴良英, 易圖永, 楊泓威, 肖啟明 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)