專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因玉米檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法，具體涉及轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因市場的不斷擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因生物和產(chǎn)品的環(huán)境安全和食用安全性問題引起了全球范圍內(nèi)的爭論和關(guān)注，那么轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)尤其重要，世界各國也紛紛出臺了很多的政策法規(guī)，2002年，我國農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》，要求對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測，并要求檢測結(jié)果為陽性者需要標(biāo)識。而世界上的其他國家，例如歐盟、日本、澳洲、韓國也紛紛出臺相關(guān)政策，要求對超過一定含量的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識?；诤怂岬腜CR檢測技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)。根據(jù)不同的外源DNA片段，PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構(gòu)建特異性PCR檢測、品系特異性PCR檢測。構(gòu)建特異性是通過檢測外源插入載體中兩個元件的連接區(qū)的DNA序列實(shí)現(xiàn)的。這種方法具有相對較高的特異性，在轉(zhuǎn)基因檢測中使用較多。為了使得檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性得到保障，在檢測過程中需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前大量使用的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)是由未加工的原材料制備而成的——基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然而，由于基質(zhì)效應(yīng)和加工過程中完整DNA分子的缺失等原因使得其作為定量標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用時具有很大局限性。同時，其制備復(fù)雜，價格昂貴，且不利于長期儲存。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在GMO鑒定檢測中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物。質(zhì)粒分子的優(yōu)點(diǎn)主要是可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，DNA易于擴(kuò)增，所以可提供無限穩(wěn)定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并且純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高。轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176,商品名稱為NaturGard KnockOut玉米,是經(jīng)過特異性基因修飾而具有抗歐洲玉米螟(ECB ;0strinia nubilalis)抗性的玉米品系。歐洲玉米螟是一種對玉米危害嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲，能殺死鱗翅目昆蟲，對家畜和人類不敏感。BT176玉米品系可以生產(chǎn)一種剪切殺蟲蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌亞種kurstaki菌株HD-I的CrylAb ；也能表達(dá)土壤吸水鏈霉菌的bar基因，編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)酶。目前，IS021570、歐盟參考物質(zhì)及測量研究所對于轉(zhuǎn)基因玉米BT176的檢測均為構(gòu)建特異性檢測，因此，開發(fā)一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法，本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可用作轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性檢測時的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子是將玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列、轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性序列依次構(gòu)建到質(zhì)粒載體中而得；所述玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列如SEQ ID No. I所示，所述轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子中，所述質(zhì)粒載體為PEASY-T3載體。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種上述轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，該制備方法為^fSEQ ID No. I所示核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示核苷酸序列經(jīng)重疊PCR法連接起來，并將連接產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，以獲得上述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。上述制備方法中，所述SEQ ID No. I所示核苷酸序列由SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品而得。上述制備方法中，所述SEQ ID No. 2所示核苷酸序列由SEQ ID No. 5和SEQ IDNo. 6所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品而得。上述制備方法中，所述質(zhì)粒載體為pEASY-T3載體。
上述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，具體步驟如下(I)由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品，得SEQ ID No. I所示核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品，得SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示核苷酸序列為模板進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的連接產(chǎn)物；(4)將上述連接產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體上得到權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。上述步驟(3)中，所述重疊PCR的引物對序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 6所
/Jn o上述步驟(I)和步驟(2)還包括對所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定的步驟，其具體步驟如下將所得擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，獲得含有該擴(kuò)增產(chǎn)物的中間質(zhì)粒分子；將上述中間質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株、測序鑒定；對測序正確的中間質(zhì)粒分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明依據(jù)IS021570(FoodstufTs-Detection of genetically modifiedorganisms and derived products-Quantitative nucleic acid based methods)中的轉(zhuǎn)基因玉米BT176定量檢測方法來設(shè)計檢測片段組合，內(nèi)源基因檢測片段選擇zSSIIb基因，外源基因檢測片段選擇轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性序列，利用重疊PCR的方法將二者連接起來，再將連接產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體中而獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以代替轉(zhuǎn)基因玉米BT176的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于構(gòu)建特異性的PCR檢測，很好的解決了該品系檢測過程中陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的問題。本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子不僅具有轉(zhuǎn)基因品系的特異性，還具有檢測方法的特異性，即僅對其適用的檢測方法即構(gòu)建特異性檢測適用，用其它的檢測方法對本發(fā)明質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增不會產(chǎn)生非特異性條帶。本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測時靈敏度較高，其檢測下限的絕對值可以達(dá)到12. 5拷貝。本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有一定的均一性。
本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子低溫下穩(wěn)定性較好，質(zhì)粒分子在_20°C下儲存28天后仍具有較好的穩(wěn)定性。


圖I為BT176質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的瓊脂糖電泳圖。泳道1:5^1質(zhì)粒樣品；泳道2 3u I質(zhì)粒樣品；泳道3 :1 ill質(zhì)粒樣品；泳道11 :DNA20001adder。圖2為BT176質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的適用性驗(yàn)證。I和2為BT176構(gòu)建特異性序列的Realtime PCR結(jié)果，其中I為以本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為模板的擴(kuò)增結(jié)果，模板濃度為0. Olng/ill ;2為BT176基因組為模板的擴(kuò)增結(jié)果，模板終濃度為IOng/yl。3和4為內(nèi)源zSSIIb基因的Realtime PCR結(jié)果，其中3為以本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為模板的擴(kuò)增結(jié)果，模板濃度為0. Olng/u I ;4為以BT176基因組為模板的擴(kuò)增結(jié)果，模板終濃度為IOng/yl。圖3為BT176質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子相對于轉(zhuǎn)基因玉米GA21的特異性驗(yàn)證。使用轉(zhuǎn)基因 玉米GA21的引物探針進(jìn)行驗(yàn)證①為以BT176標(biāo)準(zhǔn)分子為模板擴(kuò)增為結(jié)果，模板濃度為0. Olng/u I ;②以GA21基因組為模板擴(kuò)增結(jié)果，模板終濃度為IOng/yl。圖4為BT176質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子相對于轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的特異性驗(yàn)證。使用轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的引物探針進(jìn)行驗(yàn)證，①為以BT176標(biāo)準(zhǔn)分子為模板擴(kuò)增為結(jié)果，模板濃度為0. 01ng/ul ;②以M0N810基因組為模板擴(kuò)增結(jié)果，模板終濃度為IOng/yl。圖5為BT176質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子相對于轉(zhuǎn)基因玉米BTlI的特異性驗(yàn)證。使用轉(zhuǎn)基因玉米BTll的引物探針進(jìn)行驗(yàn)證①以BT176標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子為模板，模板濃度為O.Olng/yl ;②以BTll基因組為模板，模板終濃度為IOng/ii I。圖6為以BT176質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)品建立的BT176構(gòu)建特異性定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為BT176質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子短期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。以下實(shí)施例所用轉(zhuǎn)基因玉米BT176、GA21、M0N810、BTll基因組模板，均為購自歐盟IRMM的標(biāo)準(zhǔn)品5% level基因組(即含有5%陽性種子的轉(zhuǎn)基因粉末)。實(shí)施例I本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備一、實(shí)驗(yàn)試劑轉(zhuǎn)基因植物及深加工產(chǎn)品提取試劑盒，由?？瞪萍加邢薰咎峁籶EASY_T3克隆試劑盒，購自全式金生物技術(shù)有限公司；iTaqDNA聚合酶，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；DNA ladder、膠回收試劑盒，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；Taqman基因表達(dá)預(yù)混液，購自ABI公司；高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；高純度質(zhì)粒大提試劑盒，購自美國omega生物技術(shù)公司；Picogreen DNA定量試劑盒，購自Life technology。二、主要儀器設(shè)備Bio-Rad my cycler梯度PCR儀、Gel型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、紫外分光光度計，其他儀器包括恒溫水浴鍋、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、微量移液器等。三、實(shí)驗(yàn)方法和過程I、引物設(shè)計在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb ;依據(jù)IS021570中關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性檢測方法選擇構(gòu)建特異性檢測片段，NCBI上查找相關(guān)序列信息，DNAMAN查找檢測片段位置。根據(jù)獲得的zSSIIb基因以及BT176構(gòu)建特異性序列信息，利用0LIG06. 0設(shè)計引物，一對引物用于擴(kuò)增玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb，其序列分別如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示；另一對引物用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性序列片段，其序列分別如SEQ IDNo. 5 和 SEQ ID No. 6 所示。2、玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性序列的擴(kuò)增 根據(jù)上述引物對，以轉(zhuǎn)基因玉米BT176基因組DNA為模板，對玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件分別見表I、表2)，所得玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb片段大小約400bp，BT176構(gòu)建特異性序列片段IOObp0表I.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和BT176構(gòu)建特異性序列的PCR反應(yīng)體系
成分_儲存濃度終濃度_
IOx Taq buffer -Ix
dNTP__IOmM__0.2mM_
上游引物5|iM0.3|iM^ ,,,
下游引物__5^M__0.3|iM_
Taq DNA 聚合酶 5U/jil__2.5Units_
DNA 模板__-_ 100-200ng
ddH20補(bǔ)足至 25jil表2.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和BT176構(gòu)建特異性序列的PCR擴(kuò)增條件
溫度___循環(huán)數(shù)
95 °C 5min I 95 °C__30s_56°C__30s_ 35
72 °C__30s__
72 °CIOminI
4 °CI minI3、構(gòu)建中間質(zhì)粒分子
使用PCR膠回收試劑盒回收上述PCR得到的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和BT176構(gòu)建特異性序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，并將上述兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別構(gòu)建到pEASY-T3載體上，以獲得含有zSSIIb基因或BT176構(gòu)建特異性序列的中間質(zhì)粒分子；將上述中間質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)菌株，利用菌落PCR對重組菌株進(jìn)行鑒定，然后將陽性克隆的菌液送去測序，對比與目的擴(kuò)增片段序列一致，保存菌種，提取質(zhì)粒。對測序鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和BT176構(gòu)建特異性序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。4、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和BT176構(gòu)建特異性序列的連接以上述PCR得到的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和BT176構(gòu)建特異性序列為模板，以zSSIIb基因的上游引物(SEQ ID No. 3)和構(gòu)建特異性序列的下游引物(SEQ ID No. 6)作為重疊PCR的弓I物對，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)兩個片段的重組拼接。重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系見表3。表3、重疊PCR的反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于，將玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列、轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性序列依次構(gòu)建到質(zhì)粒載體中而得；所述玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列如SEQ ID No. I所示，所述轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性序列如SEQ ID No. 2所示。
2.如權(quán)利要求I所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于，所述質(zhì)粒載體為PEASY-T3載體。
3.如權(quán)利要求I所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，其特征在于，將SEQID No. I所示核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示核苷酸序列經(jīng)重疊PCR法連接起來，并將連接產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，獲得權(quán)利要求I所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述SEQID No. I所示核苷酸序列由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品而 得。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述SEQID No. 2所示核苷酸序列由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品而得。
6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述質(zhì)粒載體為PEASY-T3載體。
7.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其具體步驟如下 (1)由SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品，得SEQ ID No. I所示核苷酸序列的擴(kuò)蹭產(chǎn)物； (2)由SEQID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品，得SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的擴(kuò)蹭產(chǎn)物； (3)以SEQID No. I和SEQ ID No. 2所示核苷酸序列為模板進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的連接產(chǎn)物； (4)將上述連接產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體上得到權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述重疊PCR的引物對序列如SEQIDNo. 3 和 SEQ ID No. 6 所示。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)和步驟(2)還包括對所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定的步驟，其具體步驟如下將所得擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，獲得含有該擴(kuò)增產(chǎn)物的中間質(zhì)粒分子；將上述中間質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株、測序鑒定；對測序正確的中間質(zhì)粒分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法，所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子包含玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性序列。通過設(shè)計特異性PCR引物，擴(kuò)增zSSIIb基因和BT176玉米的構(gòu)建特異性序列；通過重疊PCR的方法將上述兩個特異性擴(kuò)增片段構(gòu)建到pEASY-T3載體上獲得人工重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子適用于轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性檢測，靈敏度較高，均一性較好，低溫下具有較好的穩(wěn)定性。
文檔編號C12N15/66GK102676674SQ20121014424
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者于常海, 劉樂庭, 楊濱 申請人:北京大學(xué), ?？瞪锟萍?北京)有限公司