專利名稱：一種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是涉及ー種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法。
背景技術：
蛋白酶作為エ業(yè)化生物酶制劑中應用廣泛、用量最多的ー種酶，其目前市場中用量約占生物酶總量的60%，其中堿性蛋白酶就占25%。蛋白酶除了廣泛應用于洗滌劑行業(yè)夕卜，還廣泛應用于食品加工、化工エ業(yè)、醫(yī)藥和輕エ業(yè)等多個行業(yè)，呈現出巨大的市場應用價值，而且其應用范圍還在不斷擴大，尤其在應用于大豆肽等功能食品添加劑的生產等。我國自20世紀50年代開始篩選產堿性蛋白酶菌種，經過不斷選育，在研究和生產堿性蛋白酶的活力水平上有較大的進步，已經應用于生產的主要有地衣芽孢桿菌2709和 C1213、短小芽孢桿菌209和嗜堿性短小芽孢桿菌ガ^^等。但是，當前我國國內堿性蛋白酶的產生菌株單一，酶產量和酶學性質都不能滿足現代エ業(yè)發(fā)展的需求，導致國產堿性蛋白酶市場份額銳減。我國大多采用進ロ的堿性蛋白酶制劑，并且大規(guī)模エ業(yè)生產中用的堿性蛋白酶還是主要依賴國外進ロ。大豆肽是大豆蛋白的酶解產物,主要是大豆蛋白水解后的多種肽混合物。大豆肽除了具有易消化吸收等特性外，還具有獨特的生理功能，對機體具有多種調節(jié)功能，在促進脂肪代謝、降低血清膽固醇、降血壓以及增強肌肉運動能力等方面具有顯著作用?？梢宰鳛楣δ芤蜃樱砑釉诙喾N食品中。因其功能性強、應用廣泛，大豆肽成為近年來研究的熱點。酶法生產大豆肽具有其他方法所不具有的優(yōu)勢,如營養(yǎng)價值高、功能性強、酶解條件溫和、反應時間短、效率高，產物雜質少、無有毒物質產生、無污染等反應條件溫和，不產生消旋作用，也不破壞氨基酸；產品純度高，產物易分離，成本低廉等。因而，酶法是當前大豆肽生產的首選方法。目前，雖然傳統蛋白酶生產技術相對成熟，但在大豆肽專用堿性蛋白酶的研究和生產方面進展緩慢，且其關鍵技術被幾家國際酶制劑公司所壟斷。近年來國內大豆肽的需求快速增長，但我國與大豆肽應用相關的蛋白酶研究和生產因投入不足，因而存在單位酶活低、水解產物不理想等問題。而國外公司的相關蛋白酶產品售價一直較高，從而導致酶使用成本増加，成為當前限制我國大豆肽產業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，研發(fā)大豆肽專用堿性蛋白酶的發(fā)酵技術顯得十分重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供ー種生產堿性蛋白酶的方法，這種堿性蛋白酶適合于生產大豆肽。本發(fā)明采用如下技術方案ー種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法，其生產關鍵技術如下；
選用高地芽孢桿菌為堿性蛋白酶發(fā)酵菌種，采用培養(yǎng)基配方為每升液體培養(yǎng)基含有豆柏40-80克，蔗糖30-70克，吐溫-80 O. 3-0. 7克，葡萄糖20克，氯化鈣O. 7克，硫酸鎂O. 4克，氯化鉀O. 3克。發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度為37° C，初始pH值為ρΗΙΟ.Ο，攪拌速度300 rpm，充氣速度lvvm，發(fā)酵時間3天。發(fā)酵液再經過壓濾機過濾、超濾濃縮、添加穩(wěn)定劑和防腐剤，包裝后即為商品堿性蛋白酶。本發(fā)明所述的發(fā)酵菌種為高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis PY41)。本發(fā)明所述的豆柏為大豆油エ業(yè)生產副產品。
本發(fā)明添加的穩(wěn)定劑和防腐劑都是食品法規(guī)允許的添加剤。另外，攪拌速度的單位rpm即為姆分鐘轉數,充氣速度單位vvm即為姆分鐘單位體積發(fā)酵液充入相同體積的無菌空氣，這都是發(fā)酵行業(yè)常見表示方式。本發(fā)明與已有技術相比具有以下顯著特點和積極效果本發(fā)明通過微生物液體發(fā)酵技術生產堿性蛋白酶，發(fā)酵エ藝簡單，發(fā)酵原料主要利用豆柏等便宜原料，生產成本較低。發(fā)酵后處理工藝也比較簡單，生產技術簡化，有利于發(fā)酵エ廠技術人員和工人掌握。本發(fā)明所采用菌種高地芽孢桿菌生長快，發(fā)酵速度快，生產過程不易染菌，發(fā)酵技術成熟，適合エ業(yè)化生產。本發(fā)明生產的堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白得到的大豆肽產品具有如下特性通過聞效液相色譜法分析，大丑肽分子量分布為分子量麗< 1000 Da的短肽占80. 7%,MW ^ 2000 Da的肽占91%。產品符合國家標準(GB/T22492-2008)中的大豆肽ー級標準。大豆肽分子量分析參照QB/T22492-2008方法，結果見附圖I。


附圖為大豆肽樣品的HPLC圖譜
注色譜柱為TSKgelG2000SWXL[300 mmX7.8 mm(內徑)，日本東洋曹達凝膠柱，分離分子量范圍是5000-105 Da;流動相こ腈+水+三氟こ酸=45+55+0. I ;紫外檢測器的波長設為220 nm ;泵流速設為I mL/ min ;柱溫設為室溫；進樣體積為20 μし
具體實施例方式實施例I
ー種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法，具體為
選用高地芽孢桿菌為堿性蛋白酶發(fā)酵菌種，采用培養(yǎng)基配方為每升液體培養(yǎng)基含有豆柏50克，蔗糖50克，吐溫-80 O. 5克，葡萄糖20克，氯化鈣O. 7克，硫酸鎂O. 4克，氯化鉀O. 3克。發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度為37° C，初始pH值為ρΗΙΟ.Ο，攪拌速度300 rpm，充氣速度lvvm，發(fā)酵時間3天。發(fā)酵液再經過壓濾機過濾、超濾濃縮、添加穩(wěn)定劑和防腐剤，包裝后即為商品堿性蛋白酶。實施例2
ー種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法，具體為
選用高地芽孢桿菌為堿性蛋白酶發(fā)酵菌種，采用培養(yǎng)基配方為每升液體培養(yǎng)基含有豆柏60克，蔗糖70克，吐溫-80 O. 7克，葡萄糖20克，氯化鈣O. 7克，硫酸鎂O. 4克，氯化鉀O. 3克。發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度為37° C，初始pH值為ρΗΙΟ.Ο，攪拌速度300 rpm，充氣速度lvvm，發(fā)酵時間3天。發(fā)酵液再經過壓濾機過濾、超濾濃縮、添加穩(wěn)定劑和防腐剤，包裝后即為商品堿性蛋白酶。
實施例3
ー種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法，具體為
選用高地芽孢桿菌為堿性蛋白酶發(fā)酵菌種，采用培養(yǎng)基配方為每升液體培養(yǎng)基含有豆柏70克，蔗糖30克，吐溫-80 O. 4克，葡萄糖20克，氯化鈣O. 7克，硫酸鎂O. 4克，氯化鉀O. 3克。發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度為37° C，初始pH值為ρΗΙΟ.Ο，攪拌速度300 rpm，充氣速度lvvm，發(fā)酵時間3天。發(fā)酵液再經過壓濾機過濾、超濾濃縮、添加穩(wěn)定劑和防腐剤， 包裝后即為商品堿性蛋白酶。
權利要求
1.一種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法，其特征在于以高地芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，采用如下關鍵技術和工藝參數(1)每升液體培養(yǎng)基含有豆柏40-80克，蔗糖30-70克，吐溫-800. 3 -0. 7克；(2)每升液體培養(yǎng)基同時含有葡萄糖20克，氯化鈣0.7克，硫酸鎂0. 4克，氯化鉀0.3 克； (3)發(fā)酵條件為溫度為37°C，初始pH值為pHlO.O，攪拌轉速300 rpm，充氣速度為I vvm,發(fā)酵時間3天； (4)發(fā)酵液再經過壓濾機過濾、超濾濃縮、添加穩(wěn)定劑和防腐劑，包裝后即為商品堿性蛋白酶。
2.根據權利要求I所述的一種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法，其特征在于得到的堿性蛋白酶適合于生產具有抗氧化等功能性的大豆肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種利用高地芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的方法。利用一株高地芽孢桿菌為堿性蛋白酶發(fā)酵菌種，采用培養(yǎng)基配方為每升液體培養(yǎng)基含有豆粕40-80克，蔗糖30-70克，吐溫-80 0.3-0.7克，葡萄糖20克，氯化鈣0.7克，硫酸鎂0.4克，氯化鉀0.3克。同時培養(yǎng)溫度為37°C，初始pH值為pH10.0，攪拌速度300rpm，充氣速度1vvm，發(fā)酵時間3天。發(fā)酵液再經過壓濾機過濾、超濾濃縮、添加穩(wěn)定劑和防腐劑，包裝即成。采用高地芽孢桿菌為堿性蛋白酶發(fā)酵菌種；培養(yǎng)基配方中堿處理大豆粉、蔗糖和吐溫80的添加對發(fā)酵液中堿性蛋白酶酶活的提高起到關鍵作用；大豆肽具有便于人體消化吸收、抗氧化、抗菌等功能特性，本發(fā)明生產的堿性蛋白酶適合應用于大豆肽生產。
文檔編號C12R1/07GK102676482SQ20121014448
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權日2012年5月11日
發(fā)明者丁長河, 李盤欣, 陳復生 申請人:河南省南街村(集團)有限公司