專利名稱：：組合物及甲硫氨酸的生產(chǎn)方法
技術領域：
：本發(fā)明公開了組合物，以及用如微生物、酶和化學物質生產(chǎn)甲硫氨酸及相關產(chǎn)物的方法。
背景技術：
：甲硫氨酸是動物食譜中的必需氨基酸。長期以來，甲硫氨酸的制備是采用丙烯醛、甲硫醇和氰化物作為起始物質，通過各種多步化學反應合成的。有兩種產(chǎn)物形式D，L甲硫氨酸及其羥基類似物。與其它氨基酸不同，D-甲硫氨酸在體內轉化為必需的L-異構體。據(jù)報導，由于家禽需求量的增加和近來作為豬飼料添加劑，飼料級甲硫氨酸的市場在不斷擴大。甲硫氨酸的主要生產(chǎn)商(DegussaAG,Adisseo和Novus)滿足市場需求的能力取決于原料供應。中間產(chǎn)物丙烯醛和甲硫醇必須轉化為3-甲基硫丙醛(3-methylthiopropionaldehyde,MMP)并通過氫氰酸進一步轉化成甲硫氨酸。所有這三家生產(chǎn)商都計劃增加甲硫氨酸的生產(chǎn)設備并與原料生產(chǎn)相結合(Chem.MarketingReporterApril7，2003)。對大量生物體的甲硫氨酸的生物合成途徑(天冬氨酸家族成員)的研究顯示出相似和差異。最初確定的反應步驟為高絲氨酸在高絲氨酸?；D移酶(homoserineacyItransferase)的催化作用下發(fā)生酰化反應，除了發(fā)生轉移的?；兴煌?，它普遍存在于所有生物體中。metA催化作用的產(chǎn)物為乙酰高絲氨酸或琥珀酰高絲氨酸。乙酰高絲氨酸隨后通過轉硫途徑或定向巰基化途徑轉化為高半胱氨酸。兩種途徑都被報導存在和作用于酵母、真菌、綠色植物和棒狀桿菌屬(Corynebacteriumglutamicum)的細菌中。大腸桿菌(E.coli)僅采用轉硫途徑。轉硫途徑以胱硫醚作為中間產(chǎn)物并由半胱氨酸作為硫供體。定向巰基化途徑包括將硫化物直接整合到?；呓z氨酸。該途徑中的最后一步為高半胱氨酸在高半胱氨酸轉甲基酶(homocysteinemethyltransferase,由metE或metH基因編碼)的催化作用下轉化為甲硫氨酸。其它用于動物飼料的重要的氨基酸，如賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸通過發(fā)酵制備。因此，這些氨基酸可由葡萄糖和其它再生資源作為起始物質生成。遺憾的是通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)甲硫氨酸并不成功，至今仍采用甲硫氨酸的化學合成。這其中部分原因是由于缺少有效構建的生產(chǎn)甲硫氨酸的生物合成途徑及生產(chǎn)甲硫氨酸的合適生產(chǎn)宿主。下面公開了改良的甲硫氨酸生物合成途徑及其生產(chǎn)宿主。
發(fā)明內容概述通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)甲硫氨酸及相關產(chǎn)物如S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAMe)的過程在此描述?；蚬こ袒暮兄亟MDNA分子并生產(chǎn)甲硫氨酸的微生物也描述于此。本發(fā)明描述了含有具有定向巰基化活性的外源核酸序列編碼的肽(EC2.5.I.49，EC4.2.99.-)，并含有具有轉硫活性的內源核酸序列編碼的肽(EC2.5.I.48和4.4.I.8)的微生物。該微生物能產(chǎn)生甲硫氨酸及相關產(chǎn)物。在一些例子中，該微生物能產(chǎn)生至少O.1，I，2，5，10，50，75，90或100g/L胞外濃度的甲硫氨酸或SAMe。在一些例子中，存在不止一種甲硫氨酸的生物合成途徑，較之在缺少外源核酸序列(其編碼的肽具有定向巰基化活性)的條件下，允許生物體產(chǎn)生更多的甲硫氨酸。在其它的例子中，在生物體中活躍著兩種以上的甲硫氨酸生物合成途徑。在這些例子中，一個或多個外源核酸序列編碼的肽具有定向巰基化活性。其中的一種肽能夠以O-琥珀酰高絲氨酸作為底物，另一種肽能夠以O-乙酰高絲氨酸作為底物。在一些例子中，構建的產(chǎn)甲硫氨酸及相關產(chǎn)物，如SAMe的微生物，所產(chǎn)生的至少10%的甲硫氨酸來自于轉硫生物合成途徑。在另一些例子中，它們產(chǎn)生的至少20，30，40或50%的產(chǎn)物來自于轉硫生物合成途徑。在一些例子中，構建的產(chǎn)甲硫氨酸及相關產(chǎn)物，如SAMe的微生物，由定向巰基化生物合成途徑活性，產(chǎn)生至少10%的甲硫氨酸。在另一些例子中，它們由定向巰基化生物合成途徑，產(chǎn)生至少20，30，40或50%的產(chǎn)物。在一些例子中，構建產(chǎn)甲硫氨酸及相關產(chǎn)物的微生物，以減毒由基因如metD，metK,metj,thrB,serA編碼的肽或其制品的活性。在另一些例子中，微生物還被構建成過表達一個或多個基因，如metA,metB,metC,metE,metY,metZ,metX,metH,cysPWUA,cysD,cysN,cysC,cysH,cysl,cysj,cysG,csyK和cysM。本發(fā)明還提供生產(chǎn)甲硫氨酸和SAMe的方法。這些方法包括培養(yǎng)構建的生產(chǎn)甲硫氨酸及相關產(chǎn)物的微生物并分離產(chǎn)物。在一些例子中，微生物可以是大腸桿菌(E.coli)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)或棒狀桿菌屬(Corynebacteriumglutamicum.)。在此還描述了新的核酸序列及相應的氨基酸序列(SEQIDN0S:I和2)。這些核酸序列和片段以及這些核酸序列的可用于在重組微生物中產(chǎn)生肽。這些肽用于產(chǎn)生甲硫氨酸和SAMe。這些肽及其變化形式和其片段還用于產(chǎn)生專門的結合劑，如抗體。省略中間產(chǎn)物磷酸腺苷酰硫酸(phosphoadenylylsulfate,PAPS)改善硫的同化過程的方法也描述于此。該方法可用于任何產(chǎn)甲硫氨酸的微生物。該方法是通過在微生物中引入重組的核酸序列，其允許一個或多個腺苷酰硫酸還原酶(adenylylsulfatereductases)(ECI.8.99.2或I.8.4.9)的過量表達。過量表達可以通過引入改變的重組核酸序列，或通過引入新的控制因子，如啟動子或增強子，其增強了內源腺苷酰硫酸還原酶的表達或增強了編碼腺苷酰硫酸還原酶的重組核酸序列的表達。通過下面的詳細描述和具體實施例，本發(fā)明及其它方面是顯而易見的。圖I表明各種微生物產(chǎn)甲硫氨酸的三種途徑。所有的途徑都部分依賴于采用天冬氨酸作為生產(chǎn)甲硫氨酸的起始物質。天冬氨酸經(jīng)過多步反應轉化為高絲氨酸，高絲氨酸通過MetA或MetX轉化為O-乙酰高絲氨酸或0_琥珀酰高絲氨酸。一些微生物，如大腸桿菌和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)利用MetA多肽產(chǎn)生0_琥拍酰高絲氨酸,而其它微生物,如棒狀桿菌屬和鉤端螺旋體屬(Corynebacterium和Leptospirasp.)利用MetX產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸。O-琥珀酰高絲氨酸和O-乙酰高絲氨酸隨后通過巰基化途徑完全轉化為高半胱氨酸，或者通過轉硫途徑轉化為高半胱氨酸(兩個反應均在此處做詳細描述)。與轉硫途徑有關的酶以**表不，與疏基化途徑有關的酶以*表不。圖2表示甲硫氨酸在TF4076BJF中的累積量，僅通過轉硫途徑表達(TF4076BJF)，僅通過巰基化途徑表達(TF4076BJF-A)，或由兩種途徑同時表達(TF4076BJFmetYX(Lm)。圖3示意性表示用于識別反饋抑制抵抗劑metA基因突變體的篩選方法(每個例子中的產(chǎn)品表達以陰影橢圓標出)。圖4表示甲硫氨酸的表達受到反饋抑制抵抗劑metA基因的抑制隨時間變化的曲線。圖5表示大腸桿菌中甲硫氨酸的轉運模型。圖6表明天然的硫同化途徑及新的備選的硫同化途徑。序列表序列表中所示的核酸及氨基酸序列采用標準字體縮寫，3個字符編碼用于氨基酸。僅顯示出每個核酸序列的一條鏈，其互補鏈可以參考已知鏈得出。SEQIDNOSil-IO為來自于E.coli的各種突變基因metA的核酸序列和相應的氨基酸序列。SEQIDN0S:11-34為實施例中所用的各種引物序列。發(fā)明詳述縮寫和術語下面術語和方法的解釋較好地描述了本發(fā)明并指導本領域的技術人員進行實施。除文中另外明確指定以外，在此所用的“包含，包括”表示“包括”，單數(shù)形式的“一”包括復數(shù)形式，例如，參見“包含一細胞”表明包括一個或多個這樣的細胞，文中提及“包含高半胱氨酸合酶”表明包括一個或多個高半胱氨酸合酶，并等同于本領域技術人員的公知技術等等。除文中另外明確指定以外，術語“或”表示可選擇所述備選要素中的單一要素，或兩個或多個要素的結合。例如，“高半胱氨酸合酶活性或胱硫醚Y-合酶活性”表示高半胱氨酸合酶活性，胱硫醚Y-合酶活性，或高半胱氨酸合酶活性與胱硫醚Y-合酶活性的結合。有另外說明的除外，在本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本領域已知的常規(guī)技術相同。盡管與本發(fā)明描述的相似或等同的方法和材料可用于實施或檢驗本發(fā)明，合適的方法和材料描述如下。所述的材料、方法和實施例僅用于解釋說明，并不能限制本發(fā)明的范圍。通過如下詳細的描述及權利要求中的描述，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點是顯而易見的。登錄號(AccessionNumbers):本發(fā)明中的登錄號來自于NCBI數(shù)據(jù)庫(NationalCenterforBiotechnologyInformation),其由美國國立衛(wèi)生研究院(theNationalInstituteofHealth,U.S.A.)維護。數(shù)據(jù)庫提供登錄號的日期為2007年2月20日。EC號(EnzymeClassificationnumbers,酶分類號)本發(fā)明中的EC號來自于KEGG配合基數(shù)據(jù)庫，由基因和基因組京都百科全書(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)維護，部分由東京大學主辦。數(shù)據(jù)庫提供EC號的日期為2007年2月20日。減毒(Attenuate):減輕某物的影響、活性或強度。例如，減毒特定酶對反饋抑制或由化合物(該化合物不是產(chǎn)物或反應物)導致的抑制的敏感度(非特定途徑反饋，non-pathwayspecificfeedback),使得該酶活性不受化合物存在的影響。例如，metA基因及其相應的氨基酸序列(如以序列SEQIDN0S:2所示為例)顯示出幾個突變，減毒了其反饋抑制的敏感度。在實施例3.B中詳細描述了MetA敏感度的減毒。另一個例子，酶的活性降低可認為是減毒。cDNA(互補DNA):—條無間隔序列、非編碼區(qū)(內含子)和調控序列，決定轉錄的DNA。cDNA可以從細胞中提取的信使RNA通過反轉錄生成。缺失，去除(Deletion):從核酸分子中去除一個或多個核苷酸，或從蛋白分子中去除一個或多個氨基酸，將去除后的兩端連接?？蓹z測，可見(Detectable):可檢測到的或確定的存在。例如，如果由產(chǎn)物或反應物產(chǎn)生的信號足以檢測到，由反應物生成的產(chǎn)物，如O-琥珀酰高絲氨酸或高半胱氨酸的產(chǎn)生，是可以檢測到的。定向疏基化活性(Directsulfhydrylationactivity):OSHS或OAHS與S2_直接反應生成高半胱氨酸的能力。具有該活性的肽包括諸如高半胱氨酸合酶(EC4.2.99.-,EC2.5.I.49)，其由基因metZ和metY編碼。DNA:脫氧核糖核酸。DNA為長鏈聚合物，其包括大部分活有機體的遺傳物質(一些病毒的基因含有核糖核酸，RNA)。DNA聚合物的重復單位為四個不同的核苷酸，其中每個核苷酸為四個堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之一與脫氧核糖結合并帶有一個磷酸基團。在DNA分子中由三個核苷酸組成密碼子，為氨基酸編碼。術語密碼子還用于由DNA序列轉錄得到的mRNA中的三個核苷酸相應的(和互補的)序列。內源(Endogenous):在此用于表示核酸分子以及特定細胞或微生物,說明細胞中的核酸序列或肽序列沒有利用重組構建技術，也沒有利用重組構建技術植入細胞。如細胞最初從自然界中分離出來時其中的基因。如果通過重組技術，如啟動子或增強子引發(fā)轉錄或翻譯，調控序列發(fā)生改變，仍認為基因是內源的。外源(Exogenous):在此用于表示核酸分子以及特定細胞,是指任一核酸分子不是來自于自然界發(fā)現(xiàn)的特定細胞中。因此，非天然產(chǎn)生的核酸分子一旦導入細胞內，將被認為對細胞來說是外源的。天然產(chǎn)生的核酸分子對于特定細胞來說也可以成為外源的。例如，從細胞X中分離出的完整編碼序列，一旦將該編碼序列導入細胞Y中，則對于細胞Y來說，該編碼序列是外源的，即使X和Y是同一類型的細胞。表達(Expression):基因編碼的信息轉化為細胞的結構和功能的過程，如蛋白質、轉運RNA或核糖體RNA。表達的基因包括轉錄成mRNA，然后翻譯成蛋白質，以及那些轉錄成RNA，但不翻譯成蛋白質(例如，轉運RNA和核糖體RNAs)的基因。功能缺失(FunctionalDeletion):基因序列的突變、部分或全部缺失、插入或其它變化，其減少或抑制基因產(chǎn)物的產(chǎn)生或使基因產(chǎn)物喪失功能。例如，E.coli中基因metj的功能缺失，降低了對甲硫氨酸生物合成途徑的抑制。在另一個例子中，E.coli中基因thrB的功能缺失，降低了蘇氨酸生物合成途徑中對高絲氨酸的利用。在一些例子中，功能缺失表不敲除突變。分離(Isolated)分離的”生物成分(如核酸分子、蛋白質或細胞)表示從天然存在的成分中與其它生物成分完全分離或純化出來，如其它的染色體以及染色體體外DNA、RNA和蛋白質?！胺蛛x”出的核酸分子和蛋白質包括通過標準純化方法而純化出來的核酸分子和蛋白質。該術語還包括通過在宿主細胞中重組表達以及通過化學合成方法所產(chǎn)生的核酸分子和蛋白質。在一個例子中，分離表示天然產(chǎn)生的核酸分子不直接與序列的兩端鄰接，來自于生物體天然產(chǎn)生的基因組其核酸分子是直接鄰接的(一端與5’端相連，另一端與3’端相連)。核酸分子(Nucleicacidmolecule):包括RNA和DNA分子,并不限于cDNA、基因組DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，如那些通過化學合成的或重組產(chǎn)生的核酸分子。該核酸分子可以為雙鏈或單鏈。單鏈的核酸分子可以是有義鏈或反義鏈。此外，核酸分子可以是環(huán)狀的或線性的。可操作地連接(Operablylinked):當?shù)谝粋€核酸序列與第二個核酸序列具有功能上的關系，可將第一個核酸序列可操作地連接到第二個核酸序列。例如，如果啟動子影響到編碼序列的轉錄或表達，將該啟動子與該編碼序列可操作地連接。一般情況下，可操作地連接的DNA序列是鄰接的，其對于在同一閱讀框中連接兩個蛋白編碼區(qū)是必須的。各自基因的構象串聯(lián)轉錄為單一的信使RNA，稱為操縱子。這樣將基因的位置鄰近，例如在質粒載體中，通過單個啟動子的轉錄調控，形成了一個合成的操縱子。開放閱讀框ORF(openreadingframe):一系列的三個核苷酸(密碼子)編碼肽、多肽或氨基酸，無任何終止密碼子。這些序列通?？煞g成肽。純化(Purified):術語純化并非指絕對純化；它表示相對的概念。因此，例如純化肽的制備，如琥珀酰輔酶A高絲氨酸酰基轉移酶或高半胱氨酸合酶的制備，所得到的肽濃度要比細胞中肽濃度大。例如，純化的肽從其可能結合的細胞成分中完全分離出來(核酸、脂類、碳水化合物以及其它肽)。在另一個例子中，純化的肽的制備是從污染物，如那些可能存在于所述肽的化學合成的污染物中完全游離出來。在一個例子中，當樣品中肽的重量百分比至少占大約50%時，例如至少占大約60%，70%,80%,85%，90%,92%，95%，98%，99%或更多時，肽是純化的?？捎糜诩兓牡姆椒ǖ睦?，包括但不限于Sambrook等公開的方法(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989,Ch.17)。蛋白純度可以通過,例如將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著在染色的聚丙烯酰胺凝膠上呈現(xiàn)出單一的肽的條帶來測定；通過高壓液相色譜測定；通過測序或其它常規(guī)方法測定。重組(Recombinant):重組的核酸分子或蛋白指天然不存在的序列，其序列是通過將兩個單獨的序列片段人工地結合。該人工結合是可以實現(xiàn)的，例如通過化學合成或通過人工操作將分離的核酸分子或蛋白片段結合，如遺傳工程技術。重組還用于描述經(jīng)過人工操作的核酸分子，但含有與生物體中發(fā)現(xiàn)的相同的調控序列和編碼區(qū)。序列同一性/相似性(Sequenceidentity/similarity):兩個或多個核酸序列的同一'I"生/相似性，或兩個或多個氨基酸序列的同一'I"生/相似性，可表不為序列同一'I"生或相似性。序列同一性可以通過相同序列的百分數(shù)來測定；高百分數(shù)表示高序列同一性。序列相似性可以通過相似序列的百分數(shù)來測定(考慮到保守氨基酸的替換)；高百分數(shù)表示高序列相似性。采用標準方法進行比對，同源(Homologs)或直系同源(orthologs)的核酸或氨基酸序列具有相對高的序列同一性/相似性。比較序列間差異的比對方法是本領域公知的。各種程序和比對運算法則描述于此Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman&ffunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988;Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988;Higgins&Sharp,CABIOS5:151-3，1989;Corpet等，Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988;Huang等ComputerAppls.intheBiosciences8，155-65,1992;andPearson等，Meth.Mol.Bio.24:307-31，1994.Altschul等，J.Mol·Biol.215:403-10，1990，提供了詳細的序列比對方法和同源性預測。NCBIBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可以通過幾種資源獲得，包括美國國立信息中心(NCBI，NationalLibraryofMedicine,Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894)及因特網(wǎng)，根據(jù)比對序列的不同，采用序列分析程序blastp,blastn,blastx,tblastn和tblastx。其它信息可參見NCBI網(wǎng)站。BLASTN用于比較核酸序列，BLASTP用于比較氨基酸序列。比較兩種核酸序列，選項可設置成_i設置成包含要進行比對的第一條核酸序列的文件(如C:\seql.txt)；-j設置成包含要進行比對的第二條核酸序列的文件(如C:\seq2.txt);_p設置成blastn;_o設置成任何想要的文件名(如C:\output.txt)；-q設置成-I；-r設置成2;其它選項為默認設置。例如，下面的命令可用于生成含有兩個序列比對結果的輸出文件C:\B12seq-ic:\seql.txt_jc:\seq2.txt-pblastn—oc:\output.txt-q-l_r2。比較兩個氨基酸序列，B12seq的選項可設置成_i設置成包含要進行比對的第一條氨基酸序列的文件(如C:\seql.txt);_j設置成包含要進行比對的第二條氨基酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p設置成blastp;_o設置成任何想要的文件名(如C:\output.txt);其它選項為默認設置。例如，下面的命令可用于生成含有兩個氨基酸序列比對結果的輸出文件C:\B12seq-ic:\seql.txt_jc:\seq2.txt-pblastp-οc:\output.txt。如果兩個比對的序列具有同源性，指定的輸出文件將列出所比對序列的同源區(qū)域。如果兩個比對的序列不具有同源性，指定的輸出文件將不顯示比對的序列。一旦進行比對，匹配的數(shù)量由存在于兩個序列中的相同核苷酸或氨基酸的數(shù)量來決定。序列同一性的百分數(shù)由區(qū)分匹配的數(shù)量決定，或者通過設定比對序列的長度進行區(qū)分，或者通過連接長度(如從比對序列中設定100個連續(xù)的核苷酸或氨基酸殘基)進行區(qū)分，將得到的結果值乘以100。例如，當與具有1554個核苷酸的測試序列進行比對，核酸序列具有1166個匹配的核苷酸，即75.0%的序列同一性(1166+1554X100=75.0)。序列同一性百分數(shù)的值采用四舍五入。例如，75.11,75.12,75.13和75.14四舍五入為75.1，而75.15，75.16，75.17，75.18和75.19四舍五入為75.2。長度值總是保持為整數(shù)。比較大于30個氨基酸的序列，采用Blast2序列功能，通過BL0SUM62矩陣設置系統(tǒng)默認參數(shù)(開放間隔值11，每個殘基間隔值I)。采用NCBIBasicBlast2.0，間隔的blastp來自如nr或swissprot數(shù)據(jù)庫，同源性通常是比對的全長氨基酸序列中，有70%的序列相同。通過blastn程序搜索后的結果經(jīng)DUST過濾(HancockandArmstrong,1994,Comput.Appl.Biosci.10:67-70)。其它程序使用SEG。此外，可進行人工比對。采用該方法進行評估，蛋白的相似性越高，序列同一性百分數(shù)值越大，如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%或至少99%的與主序列(即有登錄號的序列或其它的序列)相同的序列，同時具有主序列的活性。在一些例子中，主序列比天然序列具有更高的活性，而在另一些例子中，主序列活性較低。進行短肽序列比對(小于約30個氨基酸)，采用Blast2序列功能完成比對，通過PAM30矩陣設置系統(tǒng)默認參數(shù)(開放間隔值9，延伸空位罰分為I)。采用該方法進行評估，蛋白與參考序列的同源性越高，序列同一性百分數(shù)值越大，如至少60%，70%,75%，80%,85%，90%，95%，98%，99%的序列同一性。對非全長的序列進行比對時，10-20個氨基酸的序列同源性為至少75%的序列同一性,序列同一性取決于和參考序列的同一性，為至少85%,90%,95%或98%。評價短序列同一性的方法參見NCBI網(wǎng)站。由于遺傳密碼的退化機制，不具有高度同一性的核酸序列編碼相同的或相似的(保守的)氨基酸序列。利用這一退化機制，使得核酸序列發(fā)生變化產(chǎn)生出大量的核酸分子，所有的這些核酸分子編碼相同的蛋白。這類同源的核酸序列為，例如，具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%的與主序列(即有登錄號的序列或其它的序列)相同的序列。本領域的技術人員應當以這些相同序列的范圍值僅作為指導；落在此范圍外的，其序列可能具有同源性。轉化細胞(Transformedcell):利用諸如生物技術導入核酸分子的細胞,如琥拍酰輔酶A高絲氨酸?；D移酶或高半胱氨酸合酶的核酸分子。轉化指所有的可以將核酸分子導入細胞中的技術，包括但不限于病毒載體的轉染，接合，質粒轉化，以及通過電穿孔，脂質體轉化和基因槍的方法將裸DNA導入。轉硫活性(Transsulfurationactivity):通過中間產(chǎn)物胱硫醚產(chǎn)生甲硫氨酸或SAMe的活性。具有這種活性的肽包括胱硫醚Y合酶(EC2.5.I.48)和胱硫醚β裂解酶(EC4.4.I.8)，這些肽分別由基因metB和metC編碼。任何結合了胱硫醚Y合酶(EC2.5.I.48)和胱硫醚β裂解酶(EC4.4.1.8)的肽，能夠使微生物具有轉硫活性。允許產(chǎn)物生產(chǎn)的條件(Underconditionsthatpermitproductproduction)任何使微生物能夠產(chǎn)生所需產(chǎn)物，如甲硫氨酸或SAMe產(chǎn)物的發(fā)酵條件。這些條件通常包括溫度、通氣和培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是肉湯培養(yǎng)基或凝膠培養(yǎng)基。一般地，培養(yǎng)基包括碳源，如葡萄糖、果糖、纖維素或其它的能夠被微生物直接利用的物質，或用于培養(yǎng)基中促進碳源利用的酶。為確定培養(yǎng)條件是否可以生成產(chǎn)物，將微生物培養(yǎng)24、36或48小時后取樣。例如，為檢測甲硫氨酸或SAMe的存在，采用了實施例中提供的檢驗方法。載體(Vector):用以將核酸分子導入到細胞中，由此形成轉化細胞。載體含有能夠允許其在細胞中復制的核酸序列，如復制起點。載體還含有一個或多個選擇性標記基因以及本領域已知的其它遺傳要素。發(fā)明詳述I.甲硫氨酸生產(chǎn)途徑如圖I所示，可采用多種生物合成途徑來制備甲硫氨酸或其中間產(chǎn)物，如天冬氨酰磷酸(aspartylphosphate)、天冬氨酸半醒、高絲氨酸、O-琥拍酰高絲氨酸(OSHS)、O-乙酰高絲氨酸(OAHS)、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸，以及S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。為了達到本發(fā)明的目的，根據(jù)其內容，中間產(chǎn)物可被認為是反應物或產(chǎn)物。例如，當討論利用天冬氨酸激酶將天冬氨酸轉化為天冬氨酰磷酸時，天冬氨酸為反應物，而天冬氨酰磷酸為產(chǎn)物。同理，當說明書描述采用天冬氨酸半醛脫氫酶將天冬氨酰磷酸轉化為天冬氨酸半醛時，天冬氨酰磷酸為反應物，天冬氨酸半醛為產(chǎn)物。本領域的普通技術人員可以理解圖I所示的多種生物合成途徑，因為在提供的每種酶族中都有多種酶能夠用于將反應物轉化為產(chǎn)物，從而構成途徑。此外，這些反應可在體內或體外，或通過體內反應和體外反應的結合進行，諸如體外反應，包括非酶化學反應。在途徑中，也可通過包括將中間產(chǎn)物作為發(fā)酵進料，為宿主微生物提供中間產(chǎn)物。這樣，如果生物合成途徑制備的特定中間產(chǎn)物的量少于所需量，就可以將該中間產(chǎn)物添加到進料中。在連續(xù)發(fā)酵設備和間歇發(fā)酵設備中，這種方式都可以實現(xiàn)。本領域的普通技術人員可以認識到生產(chǎn)宿主可利用除葡萄糖以外的碳源。備選的碳源包括諸如蔗糖、果糖、纖維素、半纖維素、淀粉或甘油。當使用備選的碳源時，需要包括在發(fā)酵介質中轉化碳源的酶。A.葡萄糖轉化為天冬氨酸微生物通常以葡萄糖制備天冬氨酸，本領域的普通技術人員可以理解，有很多提高生產(chǎn)菌株中天冬氨酸濃度的方法。例如，提高丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表達，改變乙醒酸支路(glyoxylateshunt)或排除消耗丙酮酸生成其它產(chǎn)物,如乙酸鹽或乙醇。此外，可將天冬氨酸包括在發(fā)酵進料中，在甲硫氨酸的生物合成途徑中用作反應物，由微生物吸收。天冬氨酸也可在賴氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺酸生物合成途徑中作為中間產(chǎn)物。因此，有必要減毒或去除(敲除)這些途徑，從而使更多的天冬氨酸被用于甲硫氨酸生產(chǎn)途徑中。B.天冬氨酸轉化為天冬氨酰磷酸生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)天冬氨酰磷酸或過度生產(chǎn)天冬氨酰磷酸。如可采用W004069996A2公開的反饋抑制天冬氨酸激酶替代內源性天冬氨酸激酶或與內源性天冬氨酸激酶共存。本發(fā)明中采用的天冬氨酸激酶包括EC(EnzymeClassificationnumbers酶分類號)2.7.2.4的肽，以及其它能夠將天冬氨酸催化為天冬氨酰磷酸的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些天冬氨酸激酶肽也可催化其它反應，例如一些天冬氨酸激酶肽還可接受除天冬氨酸以外的其它底物。因此也包括這種非特異天冬氨酸激酶肽。天冬氨酸激酶序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NZ_AAVY01000022、NC_006958和NZ_AAffffO1000055公開了天冬氨酸激酶核酸序列；GenBank登錄號NP_418448、NP_599504和ZP_01638096公開了天冬氨酸激酶肽序列。確定特定肽的天冬氨酸激酶活性特征的分析法是本領域公知的。如，由Cohen,GN(MethodsinEnzymology,113:596:600,1985)描述的分析法可用于確定特異肽的活性特征。C.天冬氨酰磷酸轉化為天冬氨酸半醛生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)天冬氨酸半醛，或過度生產(chǎn)天冬氨酸半醛。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的天冬氨酸半醛脫氫酶。本發(fā)明中采用的天冬氨酸半醛脫氫酶包括天冬氨酸半醛脫氫酶多肽(EC1.2.I.11)，以及其它能夠將天冬氨酰磷酸催化為天冬氨酸半醛的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些天冬氨酸半醛脫氫酶肽也可催化其它反應。例如一些天冬氨酸半醛脫氫酶肽還可接受除天冬氨酰磷酸以外的其它底物，因此也包括這種非特異天冬氨酸半醛脫氫酶肽。天冬氨酸半醛脫氫酶序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NC_006958、NZ_AAVY01000015和NZ_AAWW01000010公開了天冬氨酸半醛脫氫酶的核酸序列；GenBank登錄號NP_417891、NP_599505和ZP_0164))72公開了天冬氨酸半醛脫氫酶肽序列。確定特定肽的天冬氨酸半醛脫氫酶活性特征的分析法是本領域公知的。如，由Cohen，GN(MethodsinEnzymology,113:600-602,1985)描述的分析法可用于確定特異肽的活性特征。D.天冬氨酸半醛轉化為高絲氨酸生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)高絲氨酸，或過度生產(chǎn)高絲氨酸。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的天冬氨酸半醛脫氫酶。本發(fā)明中采用的高絲氨酸脫氫酶包括高絲氨酸脫氫酶肽(EC1.I.I.3)，以及其它能夠將天冬氨酸半醛催化為高絲氨酸的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些高絲氨酸脫氫酶多肽也可催化其它反應，如一些高絲氨酸脫氫酶肽還可接受除天冬氨酸半醛以外的其它底物。因此也包括這種非特異高絲氨酸脫氫酶肽。高絲氨酸脫氫酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NC_006958、NZ_AAVY01000013和NZ_AAWW01000033公開了高絲氨酸脫氫酶核酸序列；GenBank登錄號NP_414543、ZP_01639819和NP_600409公開了高絲氨酸脫氫酶肽序列。確定特定肽的高絲氨酸脫氫酶活性特征的分析法是本領域公知的。如，由Patte.等(Biochem.Biophys.Acta128:426-439,1966)描述的分析法可用于確定特異肽的活性特征。E.高絲氨酸轉化為O-琥珀酰高絲氨酸(OSHS)生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸(OSHS)，或過度生產(chǎn)0SHS。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的高絲氨酸O-琥拍酰轉移酶(homoserine0-succinyItransferase)肽或采用高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶肽的反饋抑制不敏感形式。本發(fā)明中采用的琥珀酰輔酶A高絲氨酸酰基轉移酶包括高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶肽(EC2.3.I.46)，以及其它能夠將高絲氨酸催化為OSHS的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶肽也可催化其它反應，如一些琥珀酰輔酶A-高絲氨酸?；D移酶肽還可接受除高絲氨酸以外的其它底物。因此也包括這種非特異琥珀酰輔酶A-高絲氨酸?；D移酶肽。高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NZ_AAWW01000055公開了高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶核酸序列；GenBank登錄號AAC76983公開了高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶肽序列。確定琥珀酰輔酶A-高絲氨酸?；D移酶的活性特征的分析法是本領域公知的。如，由Lawrence(J.Bacteriol.,109:8-11,1972)描述的分析法可用于確定特異肽的活性特征。基因編碼的琥珀酰輔酶A-高絲氨酸?；D移酶肽在本發(fā)明中是指metA。E.高絲氨酸轉化為O-乙酰高絲氨酸(OAHS)生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸(OAHS)，或過度生產(chǎn)0AHS。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的高絲氨酸O-乙酰轉移酶肽(EC2.3.1.31)。本發(fā)明中采用的高絲氨酸O-乙酰轉移酶包括高絲氨酸O-乙酰轉移酶肽(EC2.3.I.31)，以及其它能夠催化為OAHS的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些高絲氨酸O-乙酰轉移酶肽也可催化其它反應，如一些高絲氨酸O-乙酰轉移酶肽還可接受除高絲氨酸以外的其它底物。因此也包括這種非特異高絲氨酸O-乙酰轉移酶肽。高絲氨酸O-乙酰轉移肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號Y10744區(qū)域2822..3961、NZ_AAAH02000004區(qū)域:166057.·167193，以及NZ_AAAY02000081區(qū)域:補體(11535.·12605)公開了高絲氨酸O-乙酰轉移酶核酸序列；GenBank登錄號CAA71733、ZP_00766367和ZP_00107218公開了高絲氨酸O-乙酰轉移酶肽序列。確定特定肽的高絲氨酸脫氫酶活性特征的分析法是本領域公知的。如，由Lawrence(J.Bacteriol.,109:8-11,1972)描述的分析法可用于確定特異肽的活性特征?；蚓幋a的高絲氨酸O-乙酰轉移酶肽在本發(fā)明中是指metX。G.疏基化通過定向巰基化途徑，以高半胱氨酸合酶(homocysteinesynthaseenzyme)完成高半胱氨酸的生產(chǎn)，其中一些酶釆用OSHS為底物，一些酶釆用OAHS為底物。此外，有些酶釆用OSHS或OAHS為底物。I.O-琥珀酰高絲氨酸(OSHS)轉化為高半胱氨酸生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)高半胱氨酸，或過度生產(chǎn)高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的高半胱氨酸合酶肽(EC4.2.99.-)。本發(fā)明中采用的高半胱氨酸合酶包括高半胱氨酸合酶肽(EC4.2.99.-)，以及其它能夠將O-琥珀酰高絲氨酸(OSHS)催化為高半胱氨酸的肽。OSHS通過與硫化物反應轉化為高半胱氨酸在本發(fā)明中是指定向巰基化。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些高半胱氨酸合酶肽也可催化其它反應，如一些高半胱氨酸合酶肽還可接受除OSHS以外的其它底物。因此也包括這種非特異高半胱氨酸合酶肽。高半胱氨酸合酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號AE004091公開了高半胱氨酸合酶(O-琥珀酰-L-高絲氨酸硫化氫解酶)核酸序列；GenBank登錄號AAG06495公開了高半胱氨酸合酶(O-琥拍酰-L-高絲氨酸硫化氫解酶)氨基酸序列。確定特定肽的高半胱氨酸合酶活性特征的分析法是本領域公知的。如，由Yamagata(MethodsinEnzymology,143:478,1987)描述的分析法,采用適當?shù)牡孜铮捎糜诖_定特異肽的活性特征?；蚓幋a的高半胱氨酸合酶肽在本發(fā)明中是指metZ。2.O-乙酰高絲氨酸(OAHS)轉化為高半胱氨酸生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)高半胱氨酸，或過表達高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的高半胱氨酸合酶肽(EC2.5.I.49)。本發(fā)明中采用的高半胱氨酸合酶包括高半胱氨酸合酶肽(EC2.5.I.49)，以及其它能夠將O-琥珀酰高絲氨酸(OAHS)催化為高半胱氨酸的肽。OAHS通過與硫化物反應轉化為高半胱氨酸在本發(fā)明中是指定向巰基化。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些高半胱氨酸合酶肽也可催化其它反應，如一些高半胱氨酸合酶肽還可接受除OSHS以外的其它底物，如實施例2提及的高半胱氨酸合酶，就可以選擇OSHS或OAHS作為底物，因此也包括這種非特異高半胱氨酸合酶肽。高半胱氨酸合酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號AE004091區(qū)域:5655648.·5656925、Y10744區(qū)域:1485.·2813、NZ_AAAHO2000004區(qū)域164536.·165990以及NZ_AAAY02000081區(qū)域:補體(12750.·14054)公開了高半胱氨酸合酶(O-乙酰-L-高絲氨酸硫化氫解酶)核酸序列；GenBank登錄號AAG08410、CAA71732、ZP_00766366和ZP_00107219公開了高半胱氨酸合酶(O-乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶)氨基酸序列。確定特定肽的高半胱氨酸合酶活性特征的分析法是本領域公知的。如，由Yamagata(MethodsinEnzymology,143:478,1987)描述的分析法,采用適當?shù)牡孜?用于確定特異肽的活性特征?；蚓幋a的高半胱氨酸合酶肽在本發(fā)明中是指metY。H.轉硫作用I.O-琥珀酰高絲氨酸(OSHS)或乙酰高絲氨酸(OAHS)轉化為胱硫醚生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)胱硫醚，或過度生產(chǎn)胱硫醚。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的胱硫醚Y-合酶肽(EC2.5.I.48)。本發(fā)明中采用的胱硫醚Y-合酶包括胱硫醚Y-合酶肽(EC2.5.I.48)，以及其它能夠將OSHS或OAHS催化為胱硫醚的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些胱硫醚Y-合酶肽也可催化其它反應，如一些胱硫醚Y-合酶肽還可接受除OSHS或OAHS以外的其它底物，因此也包括這種非特異胱硫醚Y-合酶肽。胱硫醚Y-合酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NC_006958、NZ_AAWW01000006和NC_004129公開了胱硫醚Y-合酶核酸序列；GenBank登錄號NP_418374、YP_348978和NP_601979公開了胱硫醚Y-合酶肽序列。確定特定肽的胱硫醚Y-合酶活性特征的分析法是本領域公知的。如，MethodsinEnzymology,17:425-433,1971描述的分析法,可用于確定特異肽的活性特征?；蚓幋a的胱硫醚Y-合酶肽在本發(fā)明中是指metB。2.胱硫醚轉化為高半胱氨酸生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)高半胱氨酸，或過度生產(chǎn)高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的胱硫醚β-裂解酶肽(EC4.4.I.8)。本發(fā)明中采用的胱硫醚β-裂解酶包括胱硫醚β-裂解酶肽(EC4.4.I.8)，以及其它能夠將胱硫醚催化為高半胱氨酸的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些胱硫醚裂解酶肽也可催化其它反應，如一些胱硫醚裂解酶肽還可接受除胱硫醚以外的其它底物，因此也包括這種非特異胱硫醚β_裂解酶肽。胱硫醚β_裂解酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NZ_AAffffO1000001、NC_006958和NZ_AAVY01000004公開了胱硫醚β-裂解酶核酸序列；GenBank登錄號NP_746463、YP_226552和NP_417481公開了胱硫醚β-裂解酶肽序列。確定特定肽的胱硫醚β_裂解酶活性特征的分析法是本領域公知的。如,MethodsinEnzymology,143:483-486,1987描述的分析法可用于確定特異肽的活性特征?；蚓幋a的胱硫醚裂解酶肽在本發(fā)明中是指metC。I.高半胱氨酸轉化為甲硫氨酸生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)甲硫氨酸，或過度生產(chǎn)甲硫氨酸。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物，如甲硫氨酸或SAMe產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的高半胱氨酸甲基酶肽(homocysteinemethlyasepeptide)(EC2.I.I.14和2.I.I.13)。本發(fā)明中采用的高半胱氨酸甲基酶包括高半胱氨酸甲基酶肽(EC2.I.I.14和2.I.I.13)，以及其它能夠將高半胱氨酸催化為甲硫氨酸的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些高半胱氨酸甲基酶肽也可催化其它反應，如一些高半胱氨酸甲基酶肽還可接受除高半胱氨酸以外的其它底物。因此也包括這種非特異高半胱氨酸甲基酶肽。高半胱氨酸甲基酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NC_004129、NC_006958和NC_000913公開了高半胱氨酸甲基酶核酸序列；GenBank登錄號AP_004520、YP_225791和CAK16133公開了高半胱氨酸甲基酶肽序列。確定特定肽的高半胱氨酸甲基酶活性特征的分析法是本領域公知的。如,AnalyticalBiochemistry,228,323-329,1995描述的分析法，可用于確定特異肽的活性特征。基因編碼的高半胱氨酸甲基酶肽在本發(fā)明中是指metH或metEοJ.甲硫氨酸轉化為S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)宿主可采用公知的多肽構建，以生產(chǎn)S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)，或過度生產(chǎn)SAMe。在甲硫氨酸生物合成途徑中提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是通過過表達或表達更高活性形式的甲硫氨酸腺苷轉移酶肽(methionineadenosyItransferasepeptides)(EC2.2.I.6)。本領域普通技術人員可以理解，當甲硫氨酸是所需產(chǎn)物時，需要減毒由metK編碼的甲硫氨酸腺苷轉移酶肽(EC2.2.1.6)的活性或表達。本發(fā)明中采用的甲硫氨酸腺苷轉移酶包括甲硫氨酸腺苷轉移酶肽(EC2.2.1.6)，以及其它能夠將甲硫氨酸催化為SAMe的肽。此外，本領域普通技術人員可以理解，一些甲硫氨酸腺苷轉移酶肽也可催化其它反應，如一些甲硫氨酸腺苷轉移酶肽還可接受除甲硫氨酸以外的其它底物。因此也包括這種非特異甲硫氨酸腺苷轉移酶肽。甲硫氨酸腺苷轉移酶肽序列是公眾可獲得的。如GenBank登錄號NC_002516、NC_006958和NC_000913公開了甲硫氨酸腺苷轉移酶核酸序列；GenBank登錄號NP_747070、CAI37180和NP_600817公開了甲硫氨酸腺苷轉移酶肽序列。確定特定肽的甲硫氨酸腺苷轉移酶活性特征的分析法是本領域公知的。如,MethodsinEnzymology,94:219-222,1983描述的分析法,可用于確定特異肽的活性特征?；蚓幋a的甲硫氨酸腺苷轉移酶肽在本發(fā)明中是指metK。II.將生產(chǎn)菌株基因工程化以提高甲硫氨酸的產(chǎn)量天冬氨酸的產(chǎn)量可采用本領域公知的任何方法提高。例如，天冬氨酸的產(chǎn)量可采用幾種不同的方式，通過提高由細胞產(chǎn)出的草酰乙酸的產(chǎn)量來提高天冬氨酸的產(chǎn)量。(Gokarn等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,56:188-95,2001;Sanchez等,MetabolicEng.,8:209-226,2006)。產(chǎn)物的產(chǎn)量也可通過過表達L-甲硫氨酸生物合成途徑中的各種基因來提高。例如，可將諸如metA、metB、metC、metE和metH,以及cysD、cysN、cysC、cysH、cysI、cysJ、cysK和cysM的基因設置在各種啟動子的控制之下，以提高所生產(chǎn)的酶的量。metA基因編碼高絲氨酸琥珀酰轉移酶，該酶是以高絲氨酸進行甲硫氨酸生物合成途徑的第一種酶，是甲硫氨酸生產(chǎn)的調控點。metA蛋白是溫度敏感性蛋白，具有186個氨基酸殘基，計算分子量為35.7kDa。由終產(chǎn)物，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸抑制metA活性是公知的(Lee等，J.Biol.Chem.241:5479-5780，1966)。這兩種產(chǎn)物的反饋抑制具有協(xié)同作用，即低濃度的甲硫氨酸單獨只具有輕微抑制作用，而組合后具有強效抑制作用。因此，生產(chǎn)菌株能夠從反饋抑制抵抗劑metA活性中受益。在甲硫氨酸生產(chǎn)菌株中，另一種能夠減毒或去除的基因是metj。metj編碼的肽調控甲硫氨酸生物合成途徑中幾個基因的表達。metj編碼的蛋白連接在S-腺苷甲硫氨酸上，并阻抑metA、metC和metF基因。由metF基因編碼的蛋白，5，10_亞甲基四氫葉酸還原酶(methyIenetetrahydrofοlatereductase)參與N(5)-亞甲基四氫葉酸的合成，后者為高半胱氨酸生產(chǎn)L-甲硫氨酸的甲基供體(Sheppard等，J.Bacteriol.181:718-25,1999)。US2002/0049305公開了可通過提高棒狀菌(Corynebacteria)中5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)的表達來改進L-甲硫氨酸的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明中所述的工程化的微生物也可經(jīng)工程化以提高metF的產(chǎn)量。metK基因的調控也可提高甲硫氨酸和SAMe的產(chǎn)量，在所有有機體中，S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)是主要的甲基供體,參與多胺生物合成(polyaminebiosynthesis)。SAMe也是甲硫氨酸腺苷轉移酶(methionineadenosyItransferase)(MAT或MetK,EC2.5.I.6)。MetK催化唯一公知的SAMe生物合成途徑。完整的三聚磷酸鹽鏈從ATP斷開，形成锍(suIfonium)化合物。SAMe的形成降低了甲硫氨酸的濃度，減毒了通過MetA反饋抑制的甲硫氨酸生物合成途徑的活性。因此，metK的功能性缺失或減毒可提高甲硫氨酸的生產(chǎn)。本領域的普通技術人員可以理解，任何制備甲硫氨酸的細胞利用硫的效率是非常重要的，尤其是對在硫同化過程中利用磷酸腺苷酰硫酸(phosphoadenylylsulfate(PAPS))作為中間產(chǎn)物的微生物，因為制備PAPS需要消耗I摩爾ATP。硫酸鹽相當不活躍，為了能被細胞利用，必須首先將其轉化為更活躍的形式。在大腸桿菌(E.coli)中，通過胞質輸運系統(tǒng)，其由三個細胞質膜成分和位于胞質中的底物特異性結合蛋白組成，將硫酸鹽吸收進細胞。硫酸鹽滲透酶的三個膜成分由cysT、cysW和cySA(cysA基因座)基因編碼。調控cysA基因座的產(chǎn)物，使其與其他硫-同化途徑一致，作為cys調節(jié)子的一部分。然后通過連接到核苷激活硫酸鹽，以通過與大多數(shù)有機體相似的途徑得到高能核苷磷酰硫酸。如圖6所示，微生物，如大腸桿菌利用將硫酸鹽轉化為腺苷酰硫酸(adenylylsulfate(APS))的途徑，其通過利用硫酰酶肽(sulfateadenylyltransferasepeptide)(EC2.7.7.4，由cysNcysD編碼)。然后APS通過APS激酶(EC2.7.I.25由cysC編碼)轉化為PAPS。此步驟需要一個ATP。PAPS通過PAPS還原酶(ECI.8.4.8，由cysH編碼)轉化為亞硫酸鹽，隨后亞硫酸鹽通過NADPH-亞硫酸鹽還原酶(EC1.8.I.2，由cysIcysJcysG編碼)轉化為硫化物。備選的途徑如圖6右側所示,采用腺苷酰硫酸還原酶(EC1.8.99.2或1.8.4.9)將APS直接轉化為亞硫酸鹽。本領域的普通技術人員可以理解，任何可將APS轉化為亞硫酸鹽的腺苷酰硫酸還原酶都可以使用。例如，源于枯草桿菌(Bacillussubtilis,登錄號CAA04409)或銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,登錄號NP_250447)的腺苷酰硫酸還原酶。編碼核酸序列的腺苷酰硫酸還原酶可被引入任何用于生產(chǎn)甲硫氨酸的微生物中。例如，本發(fā)明中描述的菌株，以及由MetabolicExplorer在W02005/108561和W02006138689中描述的菌株，以及由Kumar和Gomes在(BiotechnologyAdvances23:41-61,2005)描述的菌株都可以受益于本發(fā)明中公開的省略PAPS的途徑，從而在硫酸同化中少需要一個ATP分子。具體實施例方式實施例I.甲硫氨酸生產(chǎn)的多途徑之一，采用外源性表達的核酸序列利用定向巰基化。A.同時具有metABC(轉硫作用)和metAZ(定向巰基化)的微生物的構建如前所述，主要通過轉硫反應產(chǎn)生大腸桿菌中甲硫氨酸的內源性產(chǎn)物。本實施例描述了大腸桿菌的工程化以增加定向巰基化，同時也保留了內源性metAZ途徑。通過克隆O-琥拍酰硫化氫解酶(O-succinylsulfhydrylase)(EC4.2.99.-)(其通過與硫化氫反應可將O-琥珀酰高絲氨酸轉化成高半胱氨酸)增加定向巰基化。這種酶由metZ編碼，并可在一些假單胞菌屬(Pseudomonasspecies)中找到(Vermeij和Kertesz,JBacteriol.181:5833-5837，1999以及Inoue等，J.Bacteriol.179:3956-3962，1997)。更具體地說，來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的metZ被克隆為菌株TF4076BJF的甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型，該菌株由蘇氨酸生產(chǎn)菌株TF4076產(chǎn)生，(下面的實施例3中進一步描述了由thrB和metj的缺失形成的其他修飾，以及在pTrc啟動子的控制下metF的插入)。這些營養(yǎng)缺陷型具有metB基因缺失,或metB和metC基因缺失。來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的metZ增強了metB和metBC缺失突變體在基本培養(yǎng)基中的生長。如表I所示，即使在燒瓶培養(yǎng)中甲硫氨酸生產(chǎn)沒有完全恢復，metZ表達還是誘導了metBC缺失突變體中高達100mg/L的甲硫氨酸生產(chǎn)。這表明metZ負責細胞中高半胱氨酸的生產(chǎn)。由metZ轉化的缺失突變體的甲硫氨酸的低產(chǎn)量可能是由于受到了細胞內成分中硫化物的限制(下面提供了增加硫化物濃度的方法)。由metZ轉化的metBC缺失突變體的生長在2mM硫化鈉的存在下在M9培養(yǎng)基中增強的發(fā)現(xiàn)支持了這種說法。在體外分析中，O-琥珀酰硫化氫解酶具有低硫化物親和力。通過定向進化，有可能發(fā)展成具有更高硫化物親和力和更高活性的改良的O-琥珀酰硫化氫解酶。在甲硫氨酸途徑中，高活性O-琥珀酰硫化氫解酶可以替代metB和metC，或者可以補助該途徑，增加甲硫氨酸的碳通量(carbonflux)。表ITF4076BFJ-BC的生長互補和甲硫氨酸生產(chǎn)n廣葡萄糖用量甲琉敦酸中間產(chǎn)4l(mgi)GA和HS(g/L)TF4076BJF-BCOD--=—1--1~s--__(g/L)OSHmetHSGA空栽體2310Λ3867OJ0:0IpCL-meiR20,938.1OJ0.0OJ—[—0:2—pCL-mefB-metC9.740.0OJ6704362ΛpPm-metZ13.040.00.01013.1[4.3pCL-metBpCL1920中metB與其自己的啟動子pCL-metB-metCpCL1920中metB和metC與它們自己的啟動子pPro-Z:pProLar載體(ClonTech)中來自銅綠假單胞菌的metZB.同時具有metABC(轉硫作用)和metXZ(定向巰基化)的微生物的構建本實施例顯示了在大腸桿菌中，以兩種途徑同時進行甲硫氨酸生產(chǎn)。第一種途徑是內源性metABC途徑，第二種途徑允許通過來自不同有機體的metY和metX的表達進行定向疏基化。如圖I所示,大腸桿菌利用轉硫作用途徑基因metA、metB和metC并通過0SHS,內源性地生產(chǎn)甲硫氨酸。通過采用向大腸桿菌中克隆和表達基因metX和metY的基因工程，向大腸桿菌添加其他途徑，其產(chǎn)生了同時通過轉硫作用和定向巰基化制備甲硫氨酸的宿主有機體。以下描述了從鉤端螺旋體菌(Leptospirameyeri)、抗福射菌(Deinococcusradiodurans)、澄色綠屈接菌(Chloroflexusaurantiacus)、擴展短桿菌(Brevibacteriumlinens)、念珠藻(Nostocpunctiforme)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DNA中克隆用于構建異源性途徑的metX和metY基因，構建了幾種不同的菌株來分析添加這些基因對甲硫氨酸生產(chǎn)的影響。還克隆并檢測了來自谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)和啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的高半胱氨酸合酶。證明了這兩種途徑同時發(fā)生，這種添加改善了甲硫氨酸生產(chǎn)。為了評價鉤端螺旋體菌metX和metY酶是否能輔助大腸桿菌甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的生長，將鉤端螺旋體菌metYX基因菌群從質粒metXY-pCR2.O-TOPO中擴大，并克隆到pPRO-Nde-del載體中。在該質粒中metYX因的轉錄由位于載體上的lac/ara啟動子啟動。評價了包括W3110ΛmetA(停止OSHS的生成)、TF4076BJF(增加高絲氨酸生產(chǎn))、TF4076BJFΔmetA(停止OSHS的生成)和TF4076BJFΔmetAmetB(停止OSHS和來自OAHS或OSHS的胱硫醚的生成)在內的四種大腸桿菌菌株。菌株TF4076BJF是蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型，為生產(chǎn)甲硫氨酸，以增加碳通量到高絲氨酸下調，其中高絲氨酸能夠通過大腸桿菌天然途徑產(chǎn)生甲硫氨酸。菌株能夠分別由克隆載體和含有metYX的質粒轉化，然后將轉化體劃線接種到含有葡萄糖(2g/L)、異亮氨酸(O.15g/L)、蘇氨酸(O.3g/L)、卡那霉素(50mg/L)和IPTG的M9基本平板培養(yǎng)基。來自鉤端螺旋體菌的metYX基因菌群在24小時內補助W3110ΛmetA的生長。僅表達metX的W3110AmetA菌株在M9基本培養(yǎng)基上不能生長。因此，大腸桿菌W3110缺少利用O-乙?；?L-高絲氨酸作為前體生物合成甲硫氨酸的有效酶。如W02006113897中所述，菌株W3110AmetA由對照空白載體pPRO-Nde-del轉化，在48小時之內沒有生長。當由克隆載體或者含有來自鉤端螺旋體菌的metYX的質粒轉化時，菌株TF4076BJF能夠在基本平板培養(yǎng)基上生長。還檢測了可選的metYX基因用于基本培養(yǎng)基的生長互補。在從抗輻射菌、橙色綠屈撓菌、擴展短桿菌、念珠藻中克隆metYX基因時，由于缺少與下游基因metX相鄰的有效的大腸桿菌核糖體結合位點(rbs),metX基因的翻譯與由位于載體上的rbs啟動的metY基因的翻譯一起進行。來自鉤端螺旋體菌、抗輻射菌和橙色綠屈撓菌的metYX基因菌群對于補助甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的生長是最有效的。在甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型中也觀察到了生長互補，其中metY(鉤端螺旋體菌)被鉤端螺旋體菌metYX基因菌群中的metY(銅綠假單胞菌)替代。這些細胞顯示了與表達鉤端螺旋體菌metYX的相同甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型有關的降低的生長率。實施例3中描述了利用搖瓶法測定甲硫氨酸的產(chǎn)量。簡言之，培養(yǎng)物在補充了150mg/L甲硫氨酸(以改善初始生長)的培養(yǎng)基中在30°C下生長50小時，采用HPLC測定甲硫氨酸。表2顯示與那些僅有轉硫作用或者定向巰基化相比，在具有兩種途徑的菌株中甲硫氨酸的產(chǎn)量更高。表2甲硫氨酸產(chǎn)量權利要求1.具有高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶活性的的分離多肽，與具有如基因庫登錄號No.AAC76983所述的氨基酸序列的野生型高絲氨酸0-琥珀酰轉移酶多肽相比，其通過L-甲硫氨酸顯示對反饋抑制的敏感性降低。2.根據(jù)權利要求I所述的分離多肽，其在對應于野生型高絲氨酸0-琥珀酰轉移酶多肽的氨基酸24，29，79，114，140，163，222，275，290，291，295，297，304和305的一個或多個氨基酸位置含有突變。3.根據(jù)權利要求2所述的分離多肽，其在對應于野生型高絲氨酸0-琥珀酰轉移酶多肽的氨基酸163，222和295的一個或多個氨基酸位置含有突變。4.根據(jù)權利要求2所述的分離多肽，其在對應于野生型高絲氨酸0-琥珀酰轉移酶多肽的氨基酸24，275，297和305的一個或多個氨基酸位置含有突變。5.根據(jù)權利要求2所述的分離多肽，其在對應于野生型高絲氨酸0-琥珀酰轉移酶多肽的氨基酸290的氨基酸位置含有突變。6.根據(jù)權利要求2所述的分離多肽，其在對應于野生型高絲氨酸0-琥珀酰轉移酶多肽的氨基酸29，114和140的一個或多個氨基酸位置含有突變。7.根據(jù)權利要求2所述的分離多肽，其在對應于野生型高絲氨酸0-琥珀酰轉移酶多肽的氨基酸79，140，291和304的一個或多個氨基酸位置含有突變。8.根據(jù)權利要求2所述的分離多肽，其中24位的氨基酸蘇氨酸被絲氨酸替換；29位的氨基酸絲氨酸被脯氨酸替換；79位的氨基酸天冬酰胺被絲氨酸替換；114位的氨基酸谷氨酸被甘氨酸替換；140位的氨基酸苯丙氨酸被絲氨酸或異亮氨酸替換；163位的氨基酸賴氨酸被谷氨酰胺替換；222位的氨基酸苯丙氨酸被亮氨酸替換；275位的氨基酸丙氨酸被谷氨酸替換；290位的氨基酸天冬酰胺被組氨酸替換；291位的氨基酸酪氨酸被天冬酰胺替換；295位的氨基酸谷氨酰胺被精氨酸替換；297位的氨基酸蘇氨酸被丙氨酸替換；和304位的氨基酸甲硫氨酸被亮氨酸替換；以及305位的氨基酸天冬酰胺被酪氨酸替換。9.根據(jù)權利要求3所述的分離多肽，其中163位的氨基酸賴氨酸被谷氨酰胺替換；222位的氨基酸苯丙氨酸被亮氨酸替換；以及295位的氨基酸谷氨酰胺被精氨酸替換。10.根據(jù)權利要求4所述的分離多肽，其中24位的氨基酸蘇氨酸被絲氨酸替換；275位的氨基酸丙氨酸被谷氨酸替換；297位的氨基酸蘇氨酸被丙氨酸替換；以及305位的氨基酸天冬酰胺被酪氨酸替換。11.根據(jù)權利要求5所述的分離多肽，其中290位的氨基酸天冬酰胺被組氨酸替換。12.根據(jù)權利要求6所述的分離多肽，其中29位的氨基酸絲氨酸被脯氨酸替換；114位的氨基酸谷氨酸被甘氨酸替換；以及140位的氨基酸苯丙氨酸被絲氨酸或異亮氨酸替換。13.根據(jù)權利要求I所述的分離多肽，其中79位的氨基酸天冬酰胺被絲氨酸替換；140位的氨基酸苯丙氨酸被絲氨酸或異亮氨酸替換；291位的氨基酸酪氨酸被天冬酰胺替換；以及304位的氨基酸甲硫氨酸被亮氨酸替換。14.根據(jù)權利要求I所述的分離多肽，其包含選自SEQIDNO:2，4，6，8和10的氨基酸序列。15.編碼權利要求I所述的分離多肽的分離核苷酸。16.根據(jù)權利要求15所述的分離核苷酸，其含有選自SEQIDN0:l，3，5，7和9的核苷酸序列。17.含有權利要求15所述的分離核苷酸的質粒。18.用權利要求17所述質粒轉化的微生物菌株。19.制備L-甲硫氨酸的方法，其包括在允許L-甲硫氨酸產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)根據(jù)權利要求18所述的微生物；以及分離產(chǎn)生L-甲硫氨酸。全文摘要本發(fā)明公開了一種以內源基因的轉硫途徑，同時以外源基因的定向巰基化途徑生產(chǎn)甲硫氨酸和相關產(chǎn)物的微生物；還公開了這些新型基因可用于甲硫氨酸和SAMe的生產(chǎn)。文檔編號C12N1/21GK102703398SQ20121014454公開日2012年10月3日申請日期2007年4月11日優(yōu)先權日2007年4月11日發(fā)明者嚴惠媛,布萊恩·布魯澤,張眞淑,牛偉,申容旭,費爾南多·A·桑切斯-列拉,趙光命,趙英郁,金素影,霍利·J·杰森,默文·德蘇澤申請人:Cj第一制糖株式會社