專利名稱：一種畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種適用于畜禽各類動物的畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法。
背景技術：
肝臟是機體發(fā)揮代謝功能，去氧化，儲存肝糖，合成分泌性蛋白質和生物轉化等多種生物學功能的重要器官，也是藥物發(fā)揮毒性作用的主要場所。因此，許多的離體研究都選用畜禽原代肝細胞為生物材料，如肝細胞生理功能調節(jié)、代謝性疾病，藥理學、病理學和毒理學機制，病毒感染細胞模型的建立，以及理化和毒物因素的影響等領域。可見，原代肝細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定是完成以上體外研究的首要環(huán)節(jié)，而肝細胞在體外能否無血清培養(yǎng)成功，其分離與培養(yǎng)方法至關重要。近年來，國內(nèi)外許多學者在原代肝細胞分離和培養(yǎng)技術上做了大量的探索，在肝細胞分離、培養(yǎng)技術的實際應用方面取得了不少成果。早期主要采用非酶法分離肝細胞，包括機械分離法及螯合法。機械分離法是利用機械剪切、增壓過篩及強力吹打等物理手段來分離肝細胞的方法，對肝細胞損傷大，細胞活率低。螯合法是用可結合Ca2+、Mg2+的螯合劑OBEDTA)去除Ca2+依賴性黏附因子，使細胞間橋粒斷裂而分離肝細胞，但螯合劑單獨使用效果不好，常需與酶法結合使用。后期逐漸改為酶消化法分離肝細胞，包括膠原酶消化法與胰蛋白酶消化法等。酶消化法是利用酶來破壞肝細胞之間的橋連，使肝細胞分離的一種方法。酶消化法的通常做法是，將組織剪碎后加入適量濃度的消化酶，放入37°C水浴搖床消化適當時間。但是，對于肝臟來說，采用組織塊消化法通常分離得到的細胞活性較低，而且肝組織塊內(nèi)大量紅細胞很難去除。進行酶消化法時，對酶的濃度及其作用時間要求十分嚴格，尤其是胰蛋白酶為一種強蛋白質消化酶，對肝細胞膜損傷嚴重，易造成肝細胞死亡。1972年，Seglen首次采用原位兩步膠原酶灌流法分離大鼠肝細胞成功取得高活率，因為采用膠原酶消化法分離原代肝細胞，對肝細胞損傷較小，且肝細胞膜在消化過程中所受到損害可在培養(yǎng)后得到修復。此后，眾多研究者對該方法進行了一定改進，并用于不同物種肝細胞的分離。如Fraslin等改良原位兩步灌流法用于成年雞肝細胞的分離；Douaire等以Williams’ medium E作為基礎培養(yǎng)液建立成年雞肝細胞無血清培養(yǎng)體系；中國專利申請(200410084625. 7)報道了一種生物人工肝用豬和人肝細胞的制備方法；中國專利申請(200610050853. I)用Dispase-膠原酶灌流法獲高活率的新鮮原代豬肝細胞等。但以上分離方法均一定的局限性，主要表現(xiàn)為一方面是原代肝細胞得率與純度不高，活力不強，過程較繁瑣；另一方面為有血清培養(yǎng)體系，無法為部分肝功能研究提供生物學材料。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術的上述缺點，本發(fā)明提供一種能有效提高分離到的原代畜禽肝細胞數(shù)量、活率和純度，所獲得的原代肝細胞損傷少、易貼壁和活性好的畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方法是一種畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法，將螯合法與原位兩步灌流法進行整合，預先脫去畜禽肝臟組織內(nèi)Ca2+與Mg2+，使之盡量多地釋放出原代肝細胞，通過調整培養(yǎng)液的添加物配方，完善其無血清培養(yǎng)體系，并就所獲原代肝細胞進行糖原鑒定。它的操作步驟是
一、畜禽原代肝細胞的分離
〔I)畜禽手術前禁食，自由飲水過夜，頸部注射1400IU/kg劑量肝素鈉抗凝，腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉動物；
S將麻醉后的畜禽仰臥位保定在小動物手術臺上，該手術臺放在大瓷盤上，用75%酒精擦拭全身，轉入超凈工作臺內(nèi)；
:f.無菌條件下打開腹腔，輕輕把腸道拉向軀體右側，暴露腸系膜靜脈，結扎下腔靜脈兩端，并在其中匯入肝門靜脈方向插管，然后松開流向肝臟的一端；
S進行灌流分離，首先進行消化前灌流，又分為兩部分第一部分以50ml/min的
速率灌注37°C預熱的灌流液I ,該灌流液I中含有IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl、3mMNa2HPO4. 12H20和5mM EDTA，待肝臟稍鼓脹時剪開上腔靜脈，持續(xù)20min，然后以同樣速率灌注37°C預熱的灌流液II，該灌流液II中含IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl和3mMNa2HPO4. 12H20，持續(xù) 5min ；
S:待流出的液體變清后，進行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37°C預熱的
灌流液 III,該灌流液 III 中含有 IOmM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4. 12H20、5mM
EDTA、5.4mM CaCljP0.4g/L IV型膠原酶，并用止血鉗適當夾住已剪開的后腔靜脈，使灌流
液緩慢流出，15min后肝臟逐漸被消化；
S觸動肝臟表面呈現(xiàn)組織比較松軟后，開始將其摘取并放入一無菌平皿中，加入
50ml預冷的威廉斯(氏)介質E ( Williams’ medium E)基礎培養(yǎng)液,剔除血管、脂肪和結締組織，剪去肝臟周邊消化不完全的部分；
2:用鑷子撕掉肝臟包膜，剪碎肝組織，大口徑吸管輕輕吹打，隨后分別過100目
(150 um),200目(75iim)及400目(30 y m)細胞篩，所得肝細胞懸液用威廉斯(氏)介質E ( Williams’ medium E)基礎培養(yǎng)液清洗2次,再在4°C 500rpm離心5min ;用貼壁培養(yǎng)液，該貼壁培養(yǎng)液中含有體積百分比為10%的新生牛血清、10_6 M人
胰島素、10_6 M地塞米松、10吒/ml人轉鐵蛋白、10 l^g/ml Vit C、雙抗(100U/ml青霉素及l(fā)OOPg/ml鏈霉素，Gibco公司)的基礎培養(yǎng)液)重懸、臺盼藍拒染法檢測細胞活率、血細胞計數(shù)板計數(shù)；
二、畜禽肝原代細胞的培養(yǎng)
細胞計數(shù)后，用貼壁培養(yǎng)液將細胞懸液稀釋為2 5X105 cel 1/ml，在直徑為60ml的 培養(yǎng)瓶中接種15ml，接種密度為IXlO5 cell /cm2，在37°C、5% CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，4h細胞貼壁后，用生長培養(yǎng)液全量換液，該生長培養(yǎng)液中含體積百分比為10%的新生牛血清及雙抗的基礎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h，此后，用無血清培養(yǎng)液、lOPg/ml維生素C、0.15% BSA和雙抗的Williams’ medium E基礎培養(yǎng)液)全量換液，該無血清培養(yǎng)液中含5 X ICT7 M 地塞米松、I X SITE (這是(insulin, transferrin, selenium, ethanolamine)的縮寫，也可寫成ITES, Sigma-Aldrich公司，含10Mg/ml牛胰島素、5. 5Mg/ml人轉鐵蛋白、2. 9X IO-8M亞硒酸鈉、2l^g/ml乙醇胺)，以后每24h更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)及生長情況；
三、畜禽原代肝細胞的糖原鑒定
取上述無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h (接種后第3 d)的肝細胞進行糖原染色鑒定，具體操作步驟如下
吸去培養(yǎng)液，加入Carnoy’s液室溫固定細胞15 min后棄液,加入95%酒精,5 min ；
S棄液，加入70%酒精15 min后棄液，加入質量百分比為0. 8%的過碘酸酒精溶液氧化，10 min ；
(5.蒸懼水洗2 min后,加入Schiff，s酒精混合液,10 min ；
+3)棄液后，加入0. 5%偏亞硫酸鈉溶液,2 min后蒸懼水再洗2 min ；
S加入Ehrlich’ S蘇木精復染細胞核，20 min ；
以0. 5%鹽酸酒精分色，自來水藍化10 min ；
:S 95%酒精及100%酒精分別脫水2 min ；
:f; 二甲苯透明，樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明將螯合法與原位兩步灌流法進行整合，即在消化前灌流時，灌注含5mM EDTA的無Ca2+、Mg2+ HEPES緩沖液，方法改進后獲得的肝細胞分散程度及純度均為更高，且細胞活率可達90%以上。其機理是灌流液中含有的EDTA可螯合血液及肝細胞間液中的Ca2+、Mg2+，一方面起抗凝作用，更好地將紅細胞沖洗出來，另一方面可去除肝細胞間的Ca2+依賴性黏附因子，促進肝細胞的分離。本發(fā)明包括了畜禽原代肝細胞的IV型膠原酶原位灌流消化法分離、原代肝細胞無血清培養(yǎng)與肝細胞糖原鑒定等三個方面，本發(fā)明能有效提高分離到的原代畜禽肝細胞數(shù)量、活率和純度，并可適用于畜禽各類動物，所獲得的原代肝細胞損傷少，易貼壁，活性好，能廣泛應用于畜禽肝細胞的生理功能調節(jié)、代謝性疾病，藥理和毒理學機制，建立病毒感染細胞模型，以及理化和毒物因素影響等領域的研究。


圖I是本發(fā)明的工藝流程方框圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。參見圖1，一種畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法，其操作步驟是一、畜禽原代肝細胞的分離
$畜禽手術前禁食，自由飲水過夜，頸部注射1400IU/kg劑量肝素鈉抗凝，腹腔注射
戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉動物；
f::將麻醉后的畜禽仰臥位保定在小動物手術臺上，該手術臺放在大瓷盤上，用75%酒
精擦拭全身，轉入超凈工作臺內(nèi)；
S無菌條件下打開腹腔，輕輕把腸道拉向軀體右側，暴露腸系膜靜脈，結扎下腔靜脈
兩端，并在其中匯入肝門靜脈方向插管，該管是輸液管鈍性去針頭部分，然后松開流向肝臟的一端;
I;進行灌流分離，首先進行消化前灌流，又分為兩部分第一部分以50ml/min的
速率灌注37°C預熱的灌流液I，該灌流液I中含有IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl、3mMNa2HPO4. 12H20和5mM EDTA，待肝臟稍鼓脹時剪開上腔靜脈，持續(xù)20min，然后以同樣速率灌注37°C預熱的灌流液II ,該灌流液II中含IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl和3mMNa2HPO4. 12H20，持續(xù) 5min ；
S待流出的液體變清后，進行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37°C預熱的
灌流液 III,該灌流液 III 中含有 IOmM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4. 12H20、5mMEDTA、5. 4mM CaClJPO. 4g/L IV型膠原酶，并用止血鉗適當夾住已剪開的后腔靜脈，使灌流
液緩慢流出，15min后肝臟逐漸被消化；f觸動肝臟表面呈現(xiàn)組織比較松軟后，開始將其摘取并放入一無菌平皿中，加入
50ml預冷的威廉斯(氏)介質E ( Williams’ medium E)基礎培養(yǎng)液,剔除血管、脂肪和結締組織，剪去肝臟周邊消化不完全的部分；
2)用鑷子撕掉肝臟包膜，剪碎肝組織，大口徑吸管輕輕吹打，隨后分別過loo目
(150 μ m),200目(75 μ m)及400目(30 μ m)細胞篩，所得肝細胞懸液用威廉斯(氏)介質E ( Williams’ medium E)基礎培養(yǎng)液清洗2次,再在4°C 500rpm離心5min ;
I)用貼壁培養(yǎng)液，該貼壁培養(yǎng)液中含有體積百分比為10%的新生牛血清、10_6 M人
胰島素、10_6 M地塞米松、10 Pg/ml人轉鐵蛋白、10 μδ/πι1 Vit C、雙抗(100U/ml青霉素及100μδ/πι1鏈霉素，Gibco公司)的基礎培養(yǎng)液)重懸、臺盼藍拒染法檢測細胞活率、血細胞計數(shù)板計數(shù)；
二、畜禽肝原代細胞的培養(yǎng)
細胞計數(shù)后，用貼壁培養(yǎng)液將細胞懸液稀釋為2 5Χ105 cel Ι/ml，在直徑為60ml的培養(yǎng)瓶中接種15ml，接種密度為IXlO5 cell /cm2，在37°C、5% CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，4h細胞貼壁后，用生長培養(yǎng)液全量換液，該生長培養(yǎng)液中含體積百分比為10%的新生牛血清及雙抗的基礎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h，此后，用無血清培養(yǎng)液、lOPg/ml維生素C、0. 15%BSA和雙抗的Williams’ medium E基礎培養(yǎng)液)全量換液，該無血清培養(yǎng)液中含5X 10_7M地塞米松、I X SITE (Sigma-Aldrich公司，含10Pg/ml牛胰島素、5. 5Pg/ml人轉鐵蛋白、2. 9X IO-8M亞硒酸鈉、2Pg/ml乙醇胺)，以后每24h更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)及生長情況；
三、畜禽原代肝細胞的糖原鑒定
取上述無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h (接種后第3 d)的肝細胞進行糖原染色鑒定，具體操作步驟如下
(J)吸去培養(yǎng)液，加入Carnoy’s液室溫固定細胞15 min后棄液,加入95%酒精,5 min ； 'f:棄液，加入70%酒精15 min后棄液，加入0. 8%過碘酸酒精溶液氧化，10 min ；
S:蒸懼水洗2 min后,加入Schiff’ s酒精混合液,10 min ；
$棄液后，加入0. 5%偏亞硫酸鈉溶液，2 min后蒸餾水再洗2 min ；
卷加入Ehrlich，s蘇木精復染細胞核，2O min ；:f.以0· 5%鹽酸酒精分色，自來水藍化10 min ；
:2: 95%酒精及100%酒精分別脫水2 min ；
f:. 二甲苯透明，樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。本發(fā)明的優(yōu)點在于將螯合法與原位兩步灌流法進行整合改進，預先脫去肝臟組織內(nèi)Ca2+與Mg2+，使之盡量多地釋放出原代肝細胞 ；并改進了無血清培養(yǎng)體系，拓展了所獲原代肝細胞的科學用途；此外，該發(fā)明與以往方法相比縮短了操作時間，有效地提高了原代畜禽肝細胞的數(shù)量、活率和純度，且損傷少，易貼壁，細胞特性完好，分離效果良好。本發(fā)明所用試劑均在安全劑量范圍之內(nèi)，且經(jīng)無菌處理，不會造成肝細胞分離過程中的污染問題，給后續(xù)研究引入外源性的有害物質。本發(fā)明工藝流程相對簡單，器械設備易得，可操作性強，便于實現(xiàn)科學實驗。實施例I
I、仔豬肝細胞的分離與純化
φ選取7日齡健康長白仔豬I頭，術前自由飲水并禁食過夜，腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)進行麻醉；
if采用75%酒精浸泡后的紗布擦拭仔豬全身，將麻醉仔豬仰臥位保定在小動物手術
臺上(手術臺放在大瓷盤上)，轉入超凈工作臺內(nèi)；
:t:無菌條件下打開腹腔，輕輕把腸道拉向軀體右側，暴露腸系膜靜脈，適度結扎下腔
靜脈兩端，并在其中匯入肝門靜脈方向插管(輸液管鈍性去針頭部分)，然后將插管與靜脈綁緊形成通路；
S進行灌流分離第一步為消化前灌流，分為兩部分第一部分以1400IU/kg劑
量肝素鈉吸入50ml注射器，并混入灌流液I (含IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl、3mMNa2HPO4. 12H20和5mM EDTA)注入肝臟組織進行血液抗凝，然后第二部分以37°C預熱的灌流液I按50ml/min的速率灌注，待肝臟稍為鼓脹時剪開下腔靜脈胸段，持續(xù)大約15min(以
流出物無或少紅細胞為宜)，接著以同樣速率灌注37°C預熱的灌流液II (含IOmM HEPES,
137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4. 12H20)，持續(xù)5min (以肝臟變成黃白，且組織較為松散為宜)；
S:待流出的液體變清后，進行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37°C預熱的灌流液III (含 IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4. 12H20、5mM EDTA、5. 4mM
CaClJPO. 4g/L IV型膠原酶)，并用止血鉗適當夾住已剪開的下腔靜脈胸段，使灌流液經(jīng)肝
臟組織循環(huán)后緩慢流出，15min后肝臟逐漸被消化；
輕微觸動肝臟被膜，表現(xiàn)比較松軟后，開始摘取肝臟，去除膽囊，放入一無菌平皿
中，加入50ml預冷的基礎培養(yǎng)液，剔除血管、脂肪和結締組織，剪去肝臟周邊消化不完全的部分；
3用鑷子撕掉肝臟包膜，剪碎肝組織，大口徑吸管輕輕吹打，隨后分別過loo目
(150 μ m) ,200目(75 μ m)及400目(30 μ m)細胞篩，所得肝細胞懸液用基礎培養(yǎng)液清洗2次(40C 500rpm離心5min)，臺盼藍拒染法檢測細胞活率為96%，細胞總數(shù)(3. 2± I. 8) X 101° ；
:t用貼壁培養(yǎng)液含10%新生牛血清、I X SITE (Sigma-Aldrich公司，含lOPg/ml牛
胰島素、5. 5μδ/πι1人轉鐵蛋白、2. 9Χ 10_8Μ亞硒酸鈉、2Pg/ml乙醇胺)、10_6 M人胰島素、10_6M地塞米松、10 Pg/ml人轉鐵蛋白、10 μδ/πι1維生素C、雙抗(100IU/ml青霉素及100IU/ml鏈霉素，Gibco公司)的基礎培養(yǎng)液重懸，稀釋到實驗所需細胞濃度接種。2、仔豬肝細胞的原代培養(yǎng)
細胞計數(shù)后，用貼壁培養(yǎng)液將細胞懸液稀釋為3X IO5個/ml，在6孔板中接種2ml ；96孔板中接種100μ1，置于37°C、5%C02與飽和濕度的條件下的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4h細胞貼壁后，用生長培養(yǎng)液(含5%新生牛血清及100IU/ml雙抗的基礎培養(yǎng)液)全量換液，盡量去除死細胞與組織碎片，繼續(xù)培養(yǎng)20h。此后，用無血清培養(yǎng)液(含5X 10_7M地塞米松、I X SITE (Sigma-Aldrich 公司，含 10Kg/ml 牛膜島素、5. 5M-g/ml 人轉鐵蛋白、2. 9 X 10 8M亞硒酸納、2M<g/ml 乙醇胺)、lOMg/ml 維生素 C、0. 15%BSA 和 100IU/ml 雙抗的 Williams’ mediumE基礎培養(yǎng)液)全量換液，以后每24h更換培養(yǎng)液，定時進行倒置顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)及生長情況，并拍照記錄。3、仔豬原代肝細胞的糖原鑒定
取上述無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h (接種后第3 d)的肝細胞進行糖原染色鑒定。具體操作步驟如下2)吸去培養(yǎng)液，加入Carnoy’s液室溫固定細胞15 min后棄液,加入95%酒精,5 min ；棄液，加入70%酒精15 min后棄液，加入0. 8%過碘酸酒精溶液氧化，10 min ；
Si蒸懼水洗2 min后,加入Schiff’ s酒精混合液,10 min ；
$棄液后，加入0. 5%偏亞硫酸鈉溶液，2 min后蒸餾水再洗2 min ；S加入Ehrlich’ S蘇木精復染細胞核，20 min ； 以O. 5%鹽酸酒精分色，自來水藍化10 min ；
:S 95%酒精及100%酒精分別脫水2 min ；
二甲苯透明，樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。 實施例2
I、雞原代肝細胞的分離與純化
￠:選取健康青年嶺南黃雞I羽，術前禁食3h，翅靜脈注射1750IU/kg劑量肝素鈉抗
凝，腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)進行麻醉動物；
:f:將麻醉雞只仰臥位保定在小動物手術臺上(手術臺放在大瓷盤上)，75%酒精擦拭
雞只全身，轉入超凈工作臺內(nèi)，無菌條件下打開腹腔，輕輕把腸道拉向軀體左側，暴露腸系膜靜脈，在其中一條直接匯入肝門靜脈的腸系膜后靜脈中插管(5號頭皮針去掉針頭)，結扎另一條流向肝臟的靜脈；
S:第一步為消化前灌流，分為兩部分第一部分以50ml/min的速率灌注37°C預熱的
灌流液I (含 IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4. 12H20 和 5mM EDTA)，待肝臟稍
鼓脹時剪開后腔靜脈，持續(xù)9min，第二部分以同樣速率灌注37°C預熱的灌流液II (含IOmMHEPESU37mM NaCl、3mM KCl 和 3mM Na2HPO4. 12H20)，持續(xù) 3min ;待流出的液體變清后，進行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37°C預熱的灌流液III (含IOmM HEPESU37mM
NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4. 12H20、5mM EDTA,5. 4mM CaCl2 和(λ 4g/L IV 型膠原酶)，并用止
血鉗適當夾住已剪開的后腔靜脈，使灌流液緩慢流出，用37°C溫熱的無菌紗布覆蓋肝臟，并輕輕揉動肝臟以利于消化，15min后肝臟逐漸消化，壓下凹陷不易恢復；
$摘取肝臟，放入一無菌平皿中，加入50ml預冷的含O. 2%BSA的基礎培養(yǎng)液，剔除血
管、脂肪和結締組織，剪去肝臟周邊消化不完全的部分，用鑷子撕掉肝臟包膜，剪碎肝組織，大口徑吸管輕輕吹打，隨后分別過100目(150μπι)、200目(75 μ m)及500目(30 μ m)細胞篩；
將所得肝細胞懸液用基礎培養(yǎng)液清洗2次(4°C 500rpm離心2min)，用貼壁培養(yǎng)液(含10%新生牛血清、10_6 M人胰島素、10_6 M地塞米松、10 Pg/ml人轉鐵蛋白、10 μδ/πι1Vit C、雙抗(100U/ml青霉素及l(fā)OOPg/ml鏈霉素，Gibco公司)的基礎培養(yǎng)液)重懸，臺盼藍拒染法檢測細胞活率為94%，細胞總數(shù)(4. 3±0. 7) X IO802、雞原代肝細胞的培養(yǎng)
細胞計數(shù)后，用貼壁培養(yǎng)液將細胞懸液稀釋為5X IO5個/ml，在直徑為60mm的平皿中接種4ml (接種密度為I X IO5個/cm2)，在37°C、5%C02和飽和濕度的條件下培養(yǎng)。4h細胞貼壁后，用生長培養(yǎng)液(含7%新生牛血清及雙抗的基礎培養(yǎng)液)全量換液，繼續(xù)培養(yǎng)20h。此后，用無血清培養(yǎng)液(含5X10—7 M地塞米松、I X SITE (Sigma-Aldrich公司，含lOPg/ml牛胰島素、5. 5Pg/ml人轉鐵蛋白、2. 9X 10_8M亞硒酸鈉、2Pg/ml乙醇胺)、10Pg/ml維生素C、 O.15%BSA和雙抗的基礎培養(yǎng)液)全量換液，以后每24h更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)及生長情況。3、雞原代肝細胞培養(yǎng)后糖原染色鑒定
S取無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h (接種后4 d)的肝細胞樣品，吸去平皿內(nèi)的培養(yǎng)液,加入Carnoy ’ s液室溫下固定細胞15min ；
②棄液，加入95%酒精5min，70%酒精15min回水；
:f.棄液，加入O. 8%過碘酸酒精溶液氧化lOmin，蒸餾水速洗；
$:加入 Schiff’ s 酒精混合液(量取 2. 9ml Schiff’ s 試劑、O. 125ml IN HCl 和 7ml100%酒精混合，用前現(xiàn)配)作用IOmin進行糖原染色；
棄液，加入O. 5%偏亞硫酸鈉溶液去色2min，用自來水和蒸餾水先后速洗；
f加入Ehrlich’ s蘇木精復染細胞核20min，以O. 5%鹽酸酒精分色，自來水藍化IOmin ；
2.95%酒精及100%酒精分別脫水lmin，二甲苯透明，樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。
權利要求
1.一種畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法，其特征在于將螯合法與原位兩步灌流法進行整合，預先脫去畜禽肝臟組織內(nèi)Ca2+與Mg2+，使之盡量多地釋放出原代肝細胞，通過調整培養(yǎng)液的添加物配方，完善其無血清培養(yǎng)體系，并就所獲原代肝細胞進行糖原鑒定。
2.如權利要求I所述畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法，其特征在于操作步驟是 一、畜禽原代肝細胞的分離 X畜禽手術前禁食，自由飲水過夜，頸部注射1400IU/kg劑量肝素鈉抗凝，腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉動物； I:將麻醉后的畜禽仰臥位保定在小動物手術臺上，該手術臺放在大瓷盤上，用75%酒精擦拭全身，轉入超凈工作臺內(nèi)； S無菌條件下打開腹腔，輕輕把腸道拉向軀體右側，暴露腸系膜靜脈，結扎下腔靜脈兩端，并在其中匯入肝門靜脈方向插管，然后松開流向肝臟的一端； X進行灌流分離，首先進行消化前灌流，又分為兩部分第一部分以50ml/min的速率灌注37°C預熱的灌流液I ,該灌流液I中含有IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl、3mMNa2HPO4. 12H20和5mM EDTA，待肝臟稍鼓脹時剪開上腔靜脈，持續(xù)20min，然后以同樣速率灌注37°C預熱的灌流液II ,該灌流液II中含IOmM HEPESU37mM NaCl、3mM KCl和3mMNa2HPO4. 12H20，持續(xù) 5min ； S待流出的液體變清后，進行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37°C預熱的灌流液 III,該灌流液 IIl 中含有 IOmM HEPES U 37mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4. 12H20、5mMEDTA,5. 4mM CaCl2和0. 4g/L IY型膠原酶，并用止血鉗適當夾住已剪開的后腔靜脈，使灌流液緩慢流出，15min后肝臟逐漸被消化； S:觸動肝臟表面呈現(xiàn)組織比較松軟后，開始將其摘取并放入一無菌平皿中，加入50ml預冷的威廉斯(氏)介質E ( Williams’ medium E)基礎培養(yǎng)液,剔除血管、脂肪和結締組織，剪去肝臟周邊消化不完全的部分； .2用鑷子撕掉肝臟包膜，剪碎肝組織，大口徑吸管輕輕吹打，隨后分別過100目(150 um),200目(75iim)及400目(30 y m)細胞篩，所得肝細胞懸液用威廉斯(氏)介質E ( Williams’ medium E)基礎培養(yǎng)液清洗2次,再在4°C 500rpm離心5min ; S'用貼壁培養(yǎng)液，該貼壁培養(yǎng)液中含有體積百分比為10%的新生牛血清、1(T6 M人胰島素、10_6 M地塞米松、10吒/ml人轉鐵蛋白、10吒/ml Vit C、雙抗(100U/ml青霉素及l(fā)OOPg/ml鏈霉素，Gibco公司)的基礎培養(yǎng)液)重懸、臺盼藍拒染法檢測細胞活率、血細胞計數(shù)板計數(shù)； 二、畜禽肝原代細胞的培養(yǎng) 細胞計數(shù)后，用貼壁培養(yǎng)液將細胞懸液稀釋為2 5X105 cel 1/ml，在直徑為60ml的培養(yǎng)瓶中接種15ml，接種密度為IXlO5 cell /cm2，在37°C、5% CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，4h細胞貼壁后，用生長培養(yǎng)液全量換液，該生長培養(yǎng)液中含體積百分比為10%的新生牛血清及雙抗的基礎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h，此后，用無血清培養(yǎng)液、lOPg/ml維生素C、0.15% BSA和雙抗的Williams’ medium E基礎培養(yǎng)液)全量換液，該無血清培養(yǎng)液中含5 X ICT7 M 地塞米松、I X SITE (這是(insulin, transferrin, selenium, ethanolamine)的縮寫，也可寫成ITES, Sigma-Aldrich公司，含10Mg/ml牛胰島素、5. 5Mg/ml人轉鐵蛋白、2.9X IO-8M亞硒酸鈉、2l^g/ml乙醇胺)，以后每24h更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)及生長情況； 三、畜禽原代肝細胞的糖原鑒定 取上述無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h (接種后第3 d)的肝細胞進行糖原染色鑒定，具體操作步驟如下 2:吸去培養(yǎng)液，加入Carnoy’ s液室溫固定細胞15 min后棄液，加入95%酒精，5 min ； S棄液，加入70%酒精15 min后棄液，加入質量百分比為0. 8%的過碘酸酒精溶液氧化，10 min ； S蒸懼水洗2 min后,加入Schiff’ s酒精混合液，10 min ； X棄液后，加入0. 5%偏亞硫酸鈉溶液，2 min后蒸餾水再洗2 min ； 5+加入Ehrlich’ s蘇木精復染細胞核,20 min ； .1以0. 5%鹽酸酒精分色，自來水藍化10 min ； 395%酒精及100%酒精分別脫水2 min ； S:二甲苯透明，樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種畜禽原代肝細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的方法，將螯合法與原位兩步灌流法進行整合，預先脫去畜禽肝臟組織內(nèi)Ca2+與Mg2+，使之盡量多地釋放出原代肝細胞，通過調整培養(yǎng)液的添加物配方，完善其無血清培養(yǎng)體系，并就所獲原代肝細胞進行糖原鑒定。本發(fā)明能有效提高分離到的原代畜禽肝細胞數(shù)量、活率和純度，并可適用于畜禽各類動物，所獲得的原代肝細胞損傷少，易貼壁，活性好，能廣泛應用于畜禽肝細胞的生理功能調節(jié)、代謝性疾病，藥理和毒理學機制，建立病毒感染細胞模型，以及理化和毒物因素影響等領域的研究。
文檔編號C12N5/071GK102643778SQ201210145959
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月13日 優(yōu)先權日2012年5月13日
發(fā)明者周桂炫, 唐勝球, 賓艷芳, 方心靈, 朱曉彤, 江青艷, 羅增福, 董小英 申請人:韶關學院