專利名稱：骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
巨噬細(xì)胞廣泛分布于全身各器官、組織，在保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、機(jī)體防御、炎癥調(diào)控、促進(jìn)組織損傷修復(fù)方面起著重要作用。巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下具有不同的表型，使巨噬細(xì)胞處于不同的功能狀態(tài)。這些功能狀態(tài)迥異的巨噬細(xì)胞在不同生理及病理?xiàng)l件下發(fā)揮不同的生理功能；與腫瘤、代謝綜合癥、糖尿病等嚴(yán)重疾病的發(fā)生、發(fā)展都有密切的聯(lián)系。靜息巨噬細(xì)胞在不同刺激條件下可激活分化為表型和功能迥異的兩大類型M1型和M2型。Ml型巨噬細(xì)胞主要引起Thl型免疫反應(yīng)，起著細(xì)菌感染防御的作用；加重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷。M2型巨噬細(xì)胞則主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，在防御寄生蟲感染，促進(jìn)組 織修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面起著重要作用。骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞具有靜息巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)即同源性好，通過不同的刺激條件可分別誘導(dǎo)分化為Ml型(經(jīng)典激活型)和M2(選擇激活型)。另外，骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞還具有產(chǎn)量高，易轉(zhuǎn)染，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)；其他巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，如從血液、腹腔、組織中分離提取獲得的巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)。這種獲得巨噬細(xì)胞的方法雖簡(jiǎn)單方便，得到的巨噬細(xì)胞往往均一性較差，產(chǎn)量低、存活時(shí)間短。特別是針對(duì)一些較難獲得的珍貴血液或組織標(biāo)本，骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種巨曬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法穩(wěn)定性佳，能提高外誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的純度。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具體為將骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)，在加入培養(yǎng)基培養(yǎng)前，還包括骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液的預(yù)處理步驟，具體為將所述骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 的濾器過濾，取過濾液進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基為含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基。進(jìn)一步，將所述骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 Pm的濾器過濾，將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心不多于10分鐘，去上清液，用含M-CSF的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備單個(gè)核細(xì)胞懸液。進(jìn)一步，含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基中含M-CSF的濃度為20ng/ml。所述的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法的優(yōu)選方案具體包括以下步驟A骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液的制備
用注射器吸取PBS緩沖液插入離體動(dòng)物股骨兩端的軟骨處沖出股骨內(nèi)的骨髓，收集骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液；B單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備將步驟A所得的收集骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液混懸，得骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞懸液，用濾孔為70iim的濾器過濾,將過濾液在1500rmp/min條件下離心10分鐘,去上清液，用含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞重懸液；C第一階段細(xì)胞培養(yǎng)將步驟B所得細(xì)胞重懸液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)成濃度為1-2X106個(gè)/mL，置于培養(yǎng)箱中37°C、5%孵育24 30小時(shí)后，吸棄上清，另加入所述含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時(shí)；D第二階段培養(yǎng) 在第一階段細(xì)胞培養(yǎng)完成后，不超過24小時(shí)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行換液，另培養(yǎng)3-4日，得分化成熟的巨噬細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果在于在骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液的制備過程中，不破壞股骨，在保持兩端完整的情況下利用壓力將單核細(xì)胞沖出股骨，然而阻止大量紅細(xì)胞和骨髓組織混入單細(xì)胞懸液。直接剪開股骨兩端將骨髓沖出，骨髓組織及凝結(jié)的紅細(xì)胞也都會(huì)隨之沖出，去除的股骨也含有大量細(xì)胞，此方法勢(shì)必會(huì)影響骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞的分離和數(shù)量。然而，在保持兩端完整的情況下沖洗股骨，大大提高了單核細(xì)胞的純度和數(shù)量，降低紅細(xì)胞的數(shù)量，保證了單個(gè)核細(xì)胞懸液的質(zhì)量。提高單核細(xì)胞的純度、降低紅細(xì)胞的數(shù)量會(huì)大大利于骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。在骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，紅細(xì)胞雖然會(huì)逐漸死亡，但是紅細(xì)胞的多少會(huì)大大影響巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞的理化環(huán)境進(jìn)而影響骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的分化成熟過程。從本實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)，與剪開股骨兩端的情況相比，在保持兩端完整的情況下分離提取骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞后在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的純度得到了大大提升。從本實(shí)施例中實(shí)際的培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在保持兩端完整的情況下分離提取的骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞在第一階段的培養(yǎng)過程中，貼附在細(xì)胞培養(yǎng)板的巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)目大大增加，分化成熟所需的時(shí)間也縮短了。本實(shí)施例中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分化成熟所需的時(shí)間與原來(lái)相比縮短了 I 2天。在細(xì)胞懸液的處理中，經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相比，骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提高；未過濾的骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度僅約為17%，經(jīng)過濾后，骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提升到30%-40%?；烊虢M織雜細(xì)胞污染的幾率也大大降低。未進(jìn)行過濾處理的細(xì)胞懸液常常遭遇組織雜細(xì)胞的污染，組織雜細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)會(huì)蓋過巨噬細(xì)胞，從而使巨噬細(xì)胞不能分化成熟甚至死亡。進(jìn)行過濾處理后的細(xì)胞懸液從未遭遇組織雜細(xì)胞的污染。


圖I為分化前的細(xì)胞照片。圖2為分化成熟的巨噬細(xì)胞照片。圖3為采用一次性細(xì)胞過濾器后得到的單個(gè)核細(xì)胞的純度檢測(cè)。圖4為未采用一次性細(xì)胞過濾器的單個(gè)核細(xì)胞的純度檢測(cè)。圖5為分化成熟的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞純度檢測(cè)圖，其中，A為空白對(duì)照，B為FITC-F4/80 單標(biāo)，C 為 APC-CDllb 單標(biāo)，D 為 FITC-F4/80、APC-CDllb 雙標(biāo)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件進(jìn)行或配置，未注明來(lái)源的產(chǎn)品均可通過市場(chǎng)途徑獲得。PBS緩沖液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05 %吐溫-20的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱為PBS緩沖液)；配制方法為稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4),磷酸氫二鈉(Na2HPO4* 12H20)，氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)，吐溫-20，加水。PBS緩沖液IL配方pH7. 4 :磷酸二氫鉀(KH2P04)0. 27g，磷酸氫二鈉(Na2HP04) :1.42g，氯化鈉(NaCl) :8g，氯化鉀(KCl) 0. 2g，加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7. 4，最后定容到1L。高溫高壓滅菌后室溫保存。本實(shí)施例中采用的PBS緩沖液來(lái)自Hyclone SH30031. 02AVJ79106。M-CSF(巨曬細(xì)胞集落刺激因子)(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)來(lái)自 RD M-CSF Recombinant mouse M-CSF416-ML-010/CF ME1811071。PRMI1640 培養(yǎng)基來(lái)自 GIBCOC11875500BT。實(shí)施例I骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液的制備取6 8周大小鼠，脫頸致死，浸入體積為70%酒精中。運(yùn)用鑷子夾起腹部上皮，用剪刀在小鼠腹部下方橫著剪開一個(gè)小口，分別夾住開口兩端向不同方向分開，暴露出小鼠腿部，用手拔出小鼠股骨和脛骨，使小鼠股骨與小鼠身體及脛骨從關(guān)節(jié)處分離，保持兩端完整。采用酒精浸潤(rùn)的紗布去除股骨兩端關(guān)節(jié)連接處殘留的組織及軟骨。將取出的股骨在體積濃度為70%酒精中漂洗2 3次，再在PBS緩沖液中漂洗；提前準(zhǔn)備5 IOml的PBS在離心管內(nèi)，用ImL的注射器吸取離心管內(nèi)的PBS緩沖液插入股骨的兩端的軟骨處，迅速?zèng)_出骨髓，重復(fù)2 3次，直到股骨變白，得骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液。此方法的優(yōu)勢(shì)在于不破壞股骨，在保持兩端完整的情況下利用壓力將單核細(xì)胞沖出股骨，然而阻止大量紅細(xì)胞和骨髓組織混入單細(xì)胞懸液。與以往的方法相比，在保持兩端完整的情況下沖洗股骨，大大提高了單核細(xì)胞的純度和數(shù)量，降低紅細(xì)胞的數(shù)量，保證了單個(gè)核細(xì)胞懸液的質(zhì)量。提高單核細(xì)胞的純度、降低紅細(xì)胞的數(shù)量會(huì)大大利于骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。在骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，紅細(xì)胞雖然會(huì)逐漸死亡，但是紅細(xì)胞的多少會(huì)大大影響巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞的理化環(huán)境進(jìn)而影響骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的分化成熟過程。從本實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)，與剪開股骨兩端的情況相比，在保持兩端完整的情況下分離提取骨髓來(lái)源的細(xì)胞后在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的純度得到了大大提升。采用的方法分離提取的骨髓來(lái)源的細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞純度達(dá)到了 90-95%以上,分化前的細(xì)胞如圖I所示,分化成熟的細(xì)胞如圖2所示；從圖2中可知，F(xiàn)4/80陽(yáng)性率為90. 8%，⑶Ilb陽(yáng)性率為98. 2% ;分化成熟的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞F4/80、CDllb雙陽(yáng)性率達(dá)到了 90. 6%。本實(shí)施例子中采用的方法分離提取的骨髓來(lái)源的細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞純度達(dá)到了 90. 6%以上。與其他方法相比，純度得到了大大提升。其中，圖3,圖4和圖5中涉及純度檢測(cè)的試驗(yàn)方法參見www. BioleRend.com Cell Surface Immunofluorescence Staining Protocol。Joachim Weischenfeldt and Bo Porse在實(shí)驗(yàn)方法中釆用剪刀剔除股骨及兩端殘留的組織及軟骨，且用剪刀直接打開股骨的兩端釋放骨髓。這個(gè)方法的缺點(diǎn)在于股骨上及兩端殘留的組織不易清除干凈而且在清除時(shí)極易損傷股骨導(dǎo)致骨髓污染；用剪刀直接打開股骨兩端不僅大大增加股骨的污染幾率，而且股骨中大塊的骨髓組織也會(huì)被沖洗出來(lái)，這樣不利于后續(xù)的單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備。實(shí)施例2細(xì)胞懸液的處理將所述骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液輕輕用移液器吹打幾次制備單個(gè)核細(xì)胞懸液。吸取細(xì)胞懸液經(jīng)過75 y m濾器(經(jīng)多次試驗(yàn)證明，40 m濾器也可實(shí)現(xiàn))，轉(zhuǎn)入IOml的離心管中，1000 1500rmp/min離心不多于lOmin。去上清，用含有M-CSF (20ng/ml)的PRMI1640完全培養(yǎng)基輕輕吹打重懸細(xì)胞懸液制備單個(gè)核細(xì)胞懸液?！癐shii M，Wen HT,Corsa CAS,Liu TJ,Coelho AL, Allen RM, et al. Epigenetic regulation of the alternatively activatedmacrophage phenotype. Blood. 2009 ；114 (15) :3244_54” 一文中米用的骨髓來(lái)源的巨卩遼細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法沒有這一步；增加了這一步會(huì)大大提高骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度，更、重要的也減少其他雜細(xì)胞污染的機(jī)會(huì)；如前面所述的操作步驟中股骨及兩端殘留的組織細(xì)胞的污染。本發(fā)明中采用了一次性的70 的過濾器過濾制備好的單核細(xì)胞懸液，過濾器會(huì)過濾掉骨髓組織和混入的大塊組織以及凝集的紅細(xì)胞。經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相t匕，骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提高，混入組織雜細(xì)胞污染的幾率也大大降低。實(shí)施例3骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)經(jīng)實(shí)施例2過濾處理后的骨髓來(lái)源細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定細(xì)胞濃度，稀釋細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至I 2X IO6個(gè)/ml。鋪板，將IX IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種到6空培養(yǎng)板中，3ml/每孔。放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C、5%孵育30小時(shí)后，吸棄上清，并加入新的含M-CSF (20ng/ml)的PRMI1640完全培養(yǎng)基。吸棄上清的步驟非常關(guān)鍵，此步驟的意義在于純化巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞，提高誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞的純度。未經(jīng)吸棄上清這個(gè)關(guān)鍵步驟而直接將獲得的單個(gè)細(xì)胞懸液在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，部分死細(xì)胞或則非巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞沒有得到及時(shí)清除會(huì)影響最后的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的純度，在第一階段培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、棒狀，培養(yǎng)過程中細(xì)胞不斷增殖和分化，細(xì)胞數(shù)目不斷增加，細(xì)胞慢慢由梭形向橢圓形轉(zhuǎn)變。這時(shí)更換新的M-CSF(20ng/ml)的PRMI 1640完全培養(yǎng)基，從第4天開始，每隔一天替換一次新的M-CSF(20ng/ml)的1640PRMI完全培養(yǎng)基。一定要及時(shí)更換培養(yǎng)基，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞大量增殖、分化，對(duì)M-CSF的需求量大。在第七天的時(shí)候，細(xì)胞逐漸變大，形態(tài)從梭形變?yōu)闄E圓形，此時(shí)，骨髓來(lái)源的細(xì)胞已經(jīng)分化成成熟的巨噬細(xì)胞。本實(shí)施例中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分化成熟所需的時(shí)間與原來(lái)相比縮短了 I 2天。在細(xì)胞懸液的處理中，經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相比，骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提高；未過濾的骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度最低僅約為17% ;如圖4所示，未過濾的骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度最低僅約為19. 8%。經(jīng)過濾后，骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提升到30% -40% ;如圖3所示骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提升到33.3%。混入組織雜細(xì)胞污染的幾率也大大降低。未進(jìn)行過濾處理的細(xì)胞懸液常常遭遇組織雜細(xì)胞的污染，組織雜細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)會(huì)蓋過巨噬細(xì)胞，從而使巨噬細(xì)胞不能分化成熟甚至死亡。進(jìn)行過濾處理后的細(xì)胞懸液從未遭遇組織雜細(xì)胞的污染。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技 術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其為將骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)，其特征在于在加入培養(yǎng)基培養(yǎng)前，還包括骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液的預(yù)處理步驟，具體為將所述骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 μ m的濾器過濾，取過濾液進(jìn)行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨髓來(lái)源的巨噬 細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于將所述骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 μ m的濾器過濾,將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心不多于10分鐘，去上清液，用含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備單個(gè)核細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基中含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的濃度為20ng/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟 A骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液的制備 用注射器吸取PBS緩沖液插入離體動(dòng)物股骨兩端的軟骨處沖出股骨內(nèi)的骨髓，收集骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液； B單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備 將步驟A所得的收集骨髓來(lái)源的細(xì)胞混合液混懸，得骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞懸液，用濾孔為40 70 μ m的濾器過濾，將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心5 10分鐘，去上清液，用含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞重懸液； C第一階段細(xì)胞培養(yǎng) 將步驟B所得細(xì)胞重懸液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)成濃度為1-2X IO6個(gè)/mL，置于培養(yǎng)箱中37°C、5%孵育24 30小時(shí)后，吸棄上清，另加入所述含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時(shí)； D第二階段培養(yǎng) 在第一階段細(xì)胞培養(yǎng)完成后，不超過24小時(shí)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行換液，另培養(yǎng)3 4日，得分化成熟的巨噬細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法，骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具體為將骨髓來(lái)源單細(xì)胞懸液在體外用含M-CSF的PRMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在加入培養(yǎng)基培養(yǎng)前，還包括骨髓來(lái)源單細(xì)胞懸液的預(yù)處理步驟，具體為將所述骨髓來(lái)源單細(xì)胞懸液用濾孔為40～75μm的濾器過濾，取過濾液進(jìn)行培養(yǎng)；本實(shí)施例中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分化成熟所需的時(shí)間與原來(lái)相比縮短了1～2天；在細(xì)胞懸液的處理中，經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相比，骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提高；未過濾的骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度僅約為17％～20％，經(jīng)過濾后，骨髓來(lái)源祖細(xì)胞的純度提升到30％-40％。
文檔編號(hào)C12N5/0786GK102732482SQ20121014811
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者吳玉章, 姜曼, 張志仁, 楊曉風(fēng), 楊琴 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)