專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尿蛋白提取方法，尤其涉及一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法。
背景技術(shù)：
人尿中含有三百多種蛋白質(zhì)，目前已開(kāi)發(fā)提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶等，這些組分在臨床上具有重要的治療價(jià)值。人尿激肽原酶(Urinary Kallidinogenase,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為KN),是從人尿中分離提取的一種由238個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，等電點(diǎn)在4左右，分子量約54000D，屬于絲氨酸蛋白酶。它能夠激活人血漿激肽原轉(zhuǎn)化為激肽。目前，已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成用于治療急性腦梗死的藥物。人尿胰蛋白酶抑制劑(Urinary trypsin inhibitor,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為UTI)是一種從人尿中分離純化的由143個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，等電點(diǎn)在2左右，分子量65000D，具有抑制多種蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性；從而抑制炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放；改善微循環(huán)和組織灌注。而在機(jī)體受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)起抑制全身性炎癥反應(yīng)(SIRS)的發(fā)生發(fā)展、繼而阻斷多臟器功能障礙(MODS)，保護(hù)臟器功能等作用。尿蛋白產(chǎn)品目前主要的生產(chǎn)過(guò)程是首先，在各地經(jīng)過(guò)尿蛋白的吸附、洗脫、沉淀等步驟制備尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品經(jīng)過(guò)下游的分離純化和精制，制備尿蛋白原料藥；最后灌裝成品制劑，用于臨床。中國(guó)人尿資源非常豐富，依賴(lài)于這一有利條件，尿蛋白產(chǎn)業(yè)從上世紀(jì)七十年代末就已經(jīng)開(kāi)始發(fā)展起來(lái)，至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的規(guī)?；a(chǎn)方式主要有兩種，方法一收集尿液，運(yùn)輸?shù)郊庸c(diǎn)，用吸附劑吸附尿蛋白，由于尿液來(lái)源分散，收集成本高，加上城市衛(wèi)生改造，收集已經(jīng)越來(lái)越困難；方法二 直接將吸附尿蛋白的樹(shù)脂放置在廁所進(jìn)行連續(xù)在線(xiàn)吸附，然后收集吸附后的樹(shù)脂運(yùn)回加工點(diǎn)進(jìn)行分離純化。這種方法對(duì)環(huán)境無(wú)污染，可以在大中城市進(jìn)行收集，尿源集中，運(yùn)輸成本較低，極大地?cái)U(kuò)大了尿蛋白的收集區(qū)域。目前，KN粗品主要按照第一種方法制備，需要首先收集尿液，再用吸附KN的吸附劑單獨(dú)對(duì)尿液進(jìn)行吸附處理。尿液中的KN含量低、不穩(wěn)定、容易降解，導(dǎo)致生產(chǎn)的收率很低、成本很高，后續(xù)純化難度大。在采用第二種方法制備KN粗品時(shí)，采用高效陰離子吸附劑，放置尿斗或尿池中， 其可以在人尿流經(jīng)吸附劑的同時(shí)，把其中KN和UTI等蛋白有效吸附，從而實(shí)現(xiàn)這些尿蛋白的高度富集，再經(jīng)過(guò)集中洗脫、沉淀等步驟得到粗品。該方法中，KN迅速被固定化，大大提高了其穩(wěn)定性，由于避免了尿液的大規(guī)模運(yùn)輸，也明顯降低了成本。但是，該方法中，由于吸附劑較強(qiáng)的吸附性能，同時(shí)吸附了較多蛋白，給下游的純化帶來(lái)較大的難度。尤其是KN和UTI，二者分子大小相近，且均為酸性蛋白，常規(guī)的純化方法對(duì)其較難分離，影響了 KN的后續(xù)純化。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高效分離出尿液中的KN和UTI，便于KN和UTI后續(xù)純化的制備人尿激肽原酶粗制品的方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時(shí)間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液通過(guò)金屬螯合親和層析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制劑不吸附，而人尿激肽原酶則結(jié)合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實(shí)現(xiàn)二者的分離，收集洗脫峰，制備人尿激肽原酶粗制品。所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，包含以下步驟 I)將陰離子交換樹(shù)脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池和尿斗中，吸附流經(jīng)尿液或稀釋尿液中的尿蛋白；2)收集已吸附尿蛋白的樹(shù)脂，進(jìn)行清洗、解吸處理；3)用O. 5 — I. OM的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰；4)超濾濃縮；5)超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)，上樣已經(jīng)用平衡液平衡好的金屬螯合親和層析柱，再用平衡液沖洗；6)繼續(xù)用洗脫溶液洗脫，收集洗脫峰；7)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 — 10小時(shí)后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。可采用離心或者板框過(guò)濾收集沉淀。步驟5的金屬螯合親和層析柱，其螯合的金屬離子可以是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一種。優(yōu)選Cu2+。步驟5中，金屬螯合親和層析柱平衡液為O. 01 - O. 2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為O — 2M。優(yōu)選O. 02M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為O. 2M。步驟5中，超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)，pH6 — 9，電導(dǎo)O. 5 — 10mS/cm。優(yōu)選ρΗ8· 0，電導(dǎo) 2. 2mS/cm ο在步驟5和步驟6之間，增加一個(gè)沖洗步驟，使用pH5 — 8，NaCl濃度彡O. 2M的沖洗金屬螯合親和層析柱，所述的沖洗液緩沖介質(zhì)為O. 01 - O. 2M磷酸鹽或者醋酸鹽。加入低PH沖洗步驟，以提高人尿激肽原酶粗制品粗制品的比活，優(yōu)選配方為0. IM醋酸一醋酸鈉(PH5. 0),0. IM 氯化鈉。步驟6中，金屬螯合親和層析柱洗脫溶液為O. 01 - O. 2M醋酸一醋酸鈉溶液，PH4. 5 — 2. 8。優(yōu)選洗脫液配方為20mM醋酸一醋酸鈉(pH3. 8)。在步驟5中，收集上樣和平衡液沖洗穿透，加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 — 10小時(shí)后，收集沉淀，制備人尿激肽原酶含量極低的人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品。可采用離心或者板框過(guò)濾收集沉淀。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是I、由于使用了對(duì)KN和UTI有高效分離效果的金屬螯合親和層析工藝，實(shí)現(xiàn)了兩種蛋白的有效分離，大大降低了兩種產(chǎn)品后續(xù)純化的難度；2、實(shí)現(xiàn)了兩種蛋白粗制品的聯(lián)產(chǎn)，生產(chǎn)成本較低；
3、步驟5與步驟6之間增加一個(gè)沖洗步驟，能夠提高KN粗制品的比活；4、利用本發(fā)明方法得到的UTI和KN具有以下特性KN粗制品活性大于I. OPNA單位/g粗制品，比活(單位/A28tl)應(yīng)彡O. 02PNA單位/A28tl, UTI粗制品活性大于3萬(wàn)單位/g粗制品，比活(單位/A28tl)應(yīng)> 200單位/A280O


圖I為本發(fā)明實(shí)施步驟示意圖；圖2為金屬螯合親和層析圖譜，縱坐標(biāo)為280nm的光吸收，橫坐標(biāo)為流出溶液體積。
具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述實(shí)施例。如圖I所示，一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法步驟為將大孔陰離子交換樹(shù)脂作為吸附劑，裝入透水性較好的濾布袋內(nèi)，直接放在公共廁所的尿池和尿斗中，吸附流經(jīng)尿液或稀釋尿液中的尿蛋白，一定時(shí)間后，收集吸附尿蛋白后的樹(shù)脂，集中解析，將洗脫出的尿蛋白溶液通過(guò)Cu2+金屬螯合親和層析柱，其中的UTI不吸附，而KN蛋白則結(jié)合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實(shí)現(xiàn)二者的分離，這樣可以得到UTI粗制品和KN蛋白粗制品。實(shí)施例I大孔型陰離子交換樹(shù)脂100公斤作為吸附劑，經(jīng)過(guò)再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹(shù)脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過(guò)樹(shù)脂，24小時(shí)后，收集吸附尿蛋白的樹(shù)脂，將吸附后樹(shù)脂用飲用水沖洗干凈，最后裝柱；用O. IM的NaCl進(jìn)行沖洗，用O. SM的NaCl進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。用截留分子量30K的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，將超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH至8. O和電導(dǎo)至2. 2mS/cm,上已經(jīng)平衡好的金屬離子為Cu2+的金屬螯合親和層析柱(Chelating sepharoseFF);再用平衡液(平衡液配方0. 02M磷酸鹽緩沖，O. 2MNaCl, pH8. O)沖洗金屬螯合親和層析柱，收集上樣穿透液和沖洗穿透液(U液)，用20mM的醋酸一醋酸鈉緩沖液(pH3. 8)洗脫金屬螯合親和層析柱，收集洗脫峰(K液)。U液與K液分別加入硫酸銨粉末，邊加邊攪，至飽和，靜置4小時(shí)，U液加入硅藻土80g，K液加入硅藻土 40g，分別用板框過(guò)濾收集和吹干沉淀，得到UTI粗制品190克。KN粗制品95克，詳見(jiàn)表I。從表I中可見(jiàn)，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而98%的KN活性集中在KN粗制品中，二者實(shí)現(xiàn)了很好的分離。表I :
I重量(g)~ UTI 含量(U)~IKN 含量(PNA)
UTI 粗制品 1901.21X 107 &KN 粗制品 [95~1.03X 104 [ 75UTI粗制品每克含UTI63000U，比活為250U/A28(I。KN粗制品每克含KNl. 85PNA,比活 O. 016PNA U/A28。。實(shí)施例2大孔型陰離子交換樹(shù)脂200公斤作為吸附劑，經(jīng)過(guò)再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹(shù)脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過(guò)樹(shù)脂，24小時(shí)后，收集吸附尿蛋白的樹(shù)脂，將吸附后樹(shù)脂用飲用水沖洗干凈，最后裝柱；用O. IM的NaCl進(jìn)行沖洗；用O. SM的NaCl進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。用截留分子量30K的超濾膜超濾濃縮，將超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH至8. O和電導(dǎo)至 2. 2mS/cm，上已經(jīng)平衡好的Cu2+金屬螯合親和層析柱；再用平衡液(平衡液配方0. 02M磷酸鹽緩沖，O. 2M NaCl, pH8. O)沖洗該金屬螯合親和層析柱，收集上樣穿透液和沖洗穿透液(U液)，用O. 2M醋酸一醋酸鈉(O. IM氯化鈉，PH5. O)溶液沖洗金屬螯合親和層析柱后，用20mM的醋酸一醋酸鈉緩沖溶液(pH3. 8)進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰(K液)，圖2為其層析圖譜。U液與K液分別加入硫酸銨粉末，邊加邊攪，至飽和，靜置4小時(shí)，U液加入硅藻土160g，K液加入硅藻土 60g，分別用板框過(guò)濾收集和吹干沉淀，得到UTI粗制品412克。KN粗制品135克，詳見(jiàn)表2。從表2中可見(jiàn)，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而98%的KN活性集中在KN粗制品中，二者實(shí)現(xiàn)了很好的分離。表2
I重量(g)~ UTI 含量(U)~IKN 含量(PNA)
UTI 粗制品 4122. 35XIO7 5 76
KN 粗制品 1351.81XIO4 303UTI粗制品每克含UTI57000U，比活為226U/A28(I。KN粗制品每克含KN2. 24PNA,比活O. 039PNA UZA2800由于本實(shí)施例中增加一個(gè)低pH沖洗步驟，明顯提高了 KN粗制品的比活。實(shí)施例3大孔型陰離子交換樹(shù)脂100公斤作為吸附劑，經(jīng)過(guò)再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹(shù)脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過(guò)樹(shù)脂，24小時(shí)后，收集吸附尿蛋白的樹(shù)脂，將吸附后樹(shù)脂用飲用水沖洗干凈，最后裝柱；用O. IM的NaCl進(jìn)行沖洗，用O. 5M的NaCl進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。用截留分子量30K的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，將超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH至6和電導(dǎo)至
O.5mS/cm，上已經(jīng)平衡好的金屬離子為Zn2+的金屬螯合親和層析柱；再用平衡液(平衡液配方0. OlM磷酸鹽緩沖液，pH6. O)沖洗金屬螯合親和層析柱，收集上樣穿透液和沖洗穿透液(U液)，用O. OlM磷酸鹽緩沖液(O. 15M氯化鈉，PH8. O)溶液沖洗金屬螯合親和層析柱后，用O.OlM的醋酸溶液(pH2. 8)洗脫金屬螯合親和層析柱，收集洗脫峰(K液)。U液與K液分別加入硫酸銨粉末，邊加邊攪，至飽和，靜置4小時(shí)，離心，在U液沉淀中加入硅藻土 80g，K液沉淀中加入硅藻土 40g，得到UTI粗制品192克。KN粗制品86克，詳見(jiàn)表3。從表3中可見(jiàn)，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而約70%的KN活性集中在KN粗制品中。表3
權(quán)利要求
1.一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時(shí)間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液通過(guò)金屬螯合親和層析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制劑不吸附，而人尿激肽原酶則結(jié)合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實(shí)現(xiàn)二者的分離，收集洗脫峰，制備人尿激肽原酶粗制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于，包含以下步驟 .1)將陰離子交換樹(shù)脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池和尿斗中，吸附流經(jīng)尿液或稀釋尿液中的尿蛋白； .2)收集已吸附尿蛋白的樹(shù)脂，進(jìn)行清洗、解吸處理； .3)用O.5 — I. OM的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰； .4)超濾濃縮； .5)超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)，上樣已經(jīng)用平衡液平衡好的金屬螯合親和層析柱，再用平衡液沖洗； .6)繼續(xù)用洗脫溶液洗脫，收集洗脫峰； .7)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2— 10小時(shí)后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于步驟5的金屬螯合親和層析柱，其螯合的金屬離子可以是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于步驟5中，金屬螯合親和層析柱平衡液為O. 01 - O. 2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為O — 2M。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于步驟5中，超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)，pH6 — 9,電導(dǎo)O. 5 — 10mS/cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于在步驟5和步驟6之間，增加一個(gè)沖洗步驟，使用pH5 - 8，NaCl濃度< O. 2M的沖洗液沖洗金屬螯合親和層析柱，所述的沖洗液緩沖介質(zhì)為O. 01 - O. 2M磷酸鹽或者醋酸鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于，步驟6中，金屬螯合親和層析柱洗脫溶液為O. 01 - O. 2M醋酸一醋酸鈉溶液，PH4. 5 — 2. 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于在步驟5中，收集上樣和平衡液沖洗穿透，加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 - 10小時(shí)后，收集沉淀，制備人尿激肽原酶含量極低的人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法。所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法為吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時(shí)間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液通過(guò)金屬螯合親和層析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制劑不吸附，而人尿激肽原酶則結(jié)合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實(shí)現(xiàn)二者的分離，收集洗脫峰，制備人尿激肽原酶粗制品。采用該技術(shù)方案可以實(shí)現(xiàn)尿液中的人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制劑的高效分離，便于人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制劑后續(xù)純化處理，提高純化收率；實(shí)現(xiàn)了兩種蛋白粗制品的聯(lián)產(chǎn)，生產(chǎn)成本較低。
文檔編號(hào)C12N9/64GK102660525SQ20121014834
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者池正昌, 蘇古方, 苗丕渠 申請(qǐng)人:揚(yáng)州艾迪生物科技有限公司