專利名稱：轉(zhuǎn)基因禽類的生產(chǎn)的制作方法
轉(zhuǎn)基因禽類的生產(chǎn)本發(fā)明是申請日為2004年I月23日、發(fā)明名稱為“禽類及禽蛋中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)”的中國發(fā)明專利申請200480005912. 2的分案申請。
背景技術(shù)：
a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入禽類細(xì)胞以及使外源遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中表達(dá)的載體和方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因禽類，包括雞和火雞，以及含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。b)相關(guān)領(lǐng)域描述 很多天然和合成的蛋白質(zhì)已用于診斷和治療性應(yīng)用；很多其他蛋白質(zhì)正處于開發(fā)或臨床試驗階段?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法包括從天然來源中分離以及在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中重組生產(chǎn)。然而，因為這些蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法的復(fù)雜性和高成本，人們正在開發(fā)其他的方法。例如，已報道了在豬、綿羊、山羊和牛的奶中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的方法。這些方法有幾個局限性，包括創(chuàng)始動物和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物群體之間長時間傳代次數(shù)，大量的管理和醫(yī)療成本，以及由于基因組中轉(zhuǎn)基因插入位點的位置效應(yīng)所致表達(dá)水平的變化。也正在利用大麥和黑麥的碾磨和麥芽工藝生產(chǎn)蛋白質(zhì)。然而，植物的翻譯后修飾與脊椎動物的翻譯后修飾有所不同，這種不同常對外源蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生決定性影響。將輸卵管作為生物反應(yīng)器如組織培養(yǎng)和乳腺生物反應(yīng)器一樣，禽類的輸卵管也可能作為生物反應(yīng)器。修飾禽類遺傳物質(zhì)使高水平分泌外源蛋白質(zhì)并包裝于禽蛋中的方法成功使得能便宜地生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)。這種方法有幾個優(yōu)點a)減少了傳代次數(shù)(24周)和通過人工授精可快速建立轉(zhuǎn)基因群體；b)容易通過增加群體大小擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模以滿足產(chǎn)品需求；c)所表達(dá)蛋白質(zhì)可經(jīng)歷翻譯后修飾；4)可自動喂養(yǎng)和收集蛋；d)卵清天然無菌；和e)由于卵清中蛋白質(zhì)的濃度高從而降低了工藝成本。禽類包括雞的生殖系統(tǒng)已有很好的描述。母雞的蛋由經(jīng)過輸卵管時被分泌于卵黃上的幾層組成。蛋的產(chǎn)生開始于母雞卵巢中大卵黃的形成。然后未受精的卵母細(xì)胞定位于卵黃囊上部。隨著排卵或卵黃從卵巢中排出，卵母細(xì)胞進(jìn)入輸卵管漏斗時，如果有精子，卵母細(xì)胞受精，然后進(jìn)入有管狀腺體細(xì)胞排列的輸卵管蛋白分泌部(magnum)。這些腺體細(xì)胞可向蛋白分泌部腔中分泌卵清蛋白質(zhì)，包括卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白、伴白蛋白和卵粘蛋白，在腔中這些蛋白質(zhì)沉積于禽胚胎和卵黃上。卵白蛋白基因編碼一種在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中特異表達(dá)的45kD的蛋白質(zhì)，(Beato，Cell 56:335-344(1989))。卵白蛋白是含量最豐富的卵清蛋白質(zhì)，包括50%以上的管狀腺體細(xì)胞產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)，或每個大A級蛋約有4克蛋白質(zhì)(Gilbert，“蛋的白蛋白及其形成”，Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl, Bell 和Freeman，主編，科學(xué)出版社，倫敦，紐約，1291-1329頁)。已經(jīng)克隆和分析了卵白蛋白基因及其每側(cè)區(qū)域 20kb 以上的序列(Lai 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 :2205-2209 (1978)；Gannon 等，Nature 278 :428-424(1979) ；Roop 等，Cell 19 :63-68(1980)；和 Royal 等，Nature 279 125-132 (1975)) 對卵 白蛋白基因的調(diào)控給予了很大關(guān)注。該基因響應(yīng)留體激素，例如雌激素、糖皮質(zhì)激素和黃體激素，這些激素可誘導(dǎo)未成熟仔雞每個管狀腺體細(xì)胞累積產(chǎn)生約70，000個卵白蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物，和誘導(dǎo)成熟產(chǎn)蛋母雞每個管狀腺體細(xì)胞100，000個卵清蛋白 mRNA 轉(zhuǎn)錄物(Palmiter, J. Biol. Chem. 248 =8260-8270(1973) ；Palmiter, Cell 4 189-197(1975))。轉(zhuǎn)染的管狀腺體細(xì)胞中的DNA酶超敏性分析和啟動子-報告基因試驗確定了一個7. 4kb的區(qū)域含有卵白蛋白基因表達(dá)所需的序列。此5’側(cè)翼區(qū)含有四個從中心算起距離轉(zhuǎn)錄起始位點-0. 25、-0. 8、-3. 2和-6. Okb的DNA酶I超敏感位點。這些位點分別稱為HS-I、-II、-III和-IV。這些區(qū)域反映了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，并且與輸卵管細(xì)胞中卵白蛋白基因的表達(dá)特異性相關(guān)(Kaye等，EMB03 :1137-1144(1984))。HS-II和-III的超敏性是雌激素誘導(dǎo)的，支持了這些區(qū)域在卵白蛋白基因表達(dá)的激素誘導(dǎo)中具有作用(的觀點)。HS-I和-II都是卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄的甾體誘導(dǎo)所必需的，在移植的管狀腺細(xì)胞中，含有這些元件的5’區(qū)的一個I. 4kb部分足以驅(qū)動留體依賴的卵清蛋白表達(dá)(Sanders和 McKnight，Biochemistry 27:6550-6557(1988))。HS-I 稱為負(fù)響應(yīng)元件(“NRE”)，因為它含有幾個在缺少激素時能抑制卵白蛋白表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件(Haekers等，Mol. Endo. 9 1113-1126(1995))。蛋白因子結(jié)合于這些元件，包括一些只在輸卵管核中發(fā)現(xiàn)的因子，提示這些因子在組織特異性表達(dá)中有作用。HS-II稱為留體依賴的響應(yīng)元件(“SDRE”)，因為它對啟動甾體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是必需的。它可結(jié)合稱為Chirp-I的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體。Chirp-I受雌激素誘導(dǎo)并在環(huán)己胺的存在下迅速轉(zhuǎn)換(Dean等，Mol. Cell. Biol. 16 2015-2024(1996))。利用移植的管狀腺體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的實驗確定了一套附加的以甾體依賴方式結(jié)合SDRE的因子，包括NFk B類似因子(Nordstrom等，J. Biol. Chem. 268 13193-13202(1993) ；Schweers和 Sanders, J. Biol. Chem. 266 10490-10497(1991))。關(guān)于HS-III和-IV的功能了解極少。HS-III包括功能性雌激素響應(yīng)元件，當(dāng)它與雌激素受體cDNA共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞時使卵清蛋白近端啟動子或異源啟動子具有雌激素誘導(dǎo)性。這些數(shù)據(jù)提示，HS-III可能在卵白蛋白基因的總體調(diào)控中起功能性作用。關(guān)于HS-IV的功能了解很少，只知道它不含有功能性雌激素響應(yīng)元件。(Kato等，Cell 68:731-742(1992))。通過導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)和/或打斷特定基因來修飾真核基因組引起了人們很大的興趣。已證明某些真核細(xì)胞可能是生產(chǎn)外源性真核蛋白質(zhì)的優(yōu)良宿主。導(dǎo)入編碼某些蛋白質(zhì)的基因還可能產(chǎn)生具有更高經(jīng)濟(jì)價值的新表型。此外，通過導(dǎo)入能使遺傳缺陷型細(xì)胞表達(dá)其不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的外源基因，可治療一些遺傳疾病。最后，通過插入或去除遺傳物質(zhì)對動物基因組進(jìn)行修飾，有助于基因功能的基礎(chǔ)研究，并可能最終導(dǎo)入用于治療疾病的基因，或者改進(jìn)動物的表型。轉(zhuǎn)基因動物已用幾種不同的方法實現(xiàn)了哺乳動物的轉(zhuǎn)基因。第一，在哺乳動物包括小鼠、豬、山羊、綿羊和牛中，將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精卵的原核，然后將受精卵放于代孕母體的子宮內(nèi)，在其中受精卵發(fā)育成其種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因的創(chuàng)始動物。用工程方法改造的轉(zhuǎn)基因攜帶有含特定調(diào)控序列指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)在特定類型細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。因為轉(zhuǎn)基因是隨機(jī)插入基因組的，所以轉(zhuǎn)基因插入基因組位點的位置效應(yīng)可能不同程度地引起轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的下降。該方法還要求對啟動子進(jìn)行鑒定，以使指導(dǎo)在所需類型細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的必要序列得以確定并包含在轉(zhuǎn)基因載體中(Hogan等,小鼠胚胎操作，Cold Spring HarborLaboratory,紐約(1988))。產(chǎn)生動物轉(zhuǎn)基因的第二種方法是靶向基因打斷，該方法中，將攜帶側(cè)接有選擇標(biāo)記基因的目的基因序列的靶向載體導(dǎo)入胚胎干(“ES”)細(xì)胞。通過同源重組，該靶向載體替代了目的基因序列在染色體上的位置或插入序列內(nèi)部阻止目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)。選出攜帶有正確打斷的基因的ES細(xì)胞克隆，然后將其注射入早期胚泡產(chǎn)生嵌合性創(chuàng)始動物，其中一些創(chuàng)始動物種系中攜帶有該轉(zhuǎn)基因。如果該轉(zhuǎn)基因刪除了目標(biāo)位點，則該目標(biāo)位點被轉(zhuǎn)基因載體中的外源DNA所替代，該外源DNA含有編碼用于選擇培養(yǎng)中經(jīng)轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因的DNA，還可能含有編碼外源蛋白質(zhì)的插入并替代被刪除基因，以使目標(biāo)基因啟動 子驅(qū)動該外源基因表達(dá)的DNA序列(美國專利Nos. 5，464，764和5，487，992 (M. P. Capecchi和K. R. Thomas))。該方法的局限性在于，ES細(xì)胞在很多動物中是不能獲得的，包括山羊、牛、綿羊和豬。而且，當(dāng)被刪除的基因?qū)τ谠撋锘蚣?xì)胞型的生存或正常發(fā)育是必需時，此法不可行。最近，禽類轉(zhuǎn)基因的發(fā)展已使我們可對禽類基因組進(jìn)行修飾?？蓪?fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒注射入新產(chǎn)蛋的雞胚盤胚下腔中產(chǎn)生種系轉(zhuǎn)基因雞(美國專利號5，162，215 ；Bosselman 等，Science243 :533-534 (1989) ；Thoraval 等，Transgenic Research 4:
369-36(1995))。可將攜帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸隨機(jī)插入胚胎細(xì)胞的染色體中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，其中一些轉(zhuǎn)基因動物種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因。已有描述利用該插入融合基因構(gòu)建物5’或3’區(qū)的絕緣子元件來克服插入位點的位置效應(yīng)(Chim等，Cell 74504-514(1993))。在另一種方法中，將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精卵胚盤中產(chǎn)生穩(wěn)定的能將基因轉(zhuǎn)遞給Fl代的轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽(Love等，Bio/Technologyl2 :60-63 (1994)) 0然而，該方法有幾點不足。為收集受精卵必須犧牲母雞，轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽的份數(shù)低，注射的卵需要在代孕殼中花費(fèi)大量勞動力體外培養(yǎng)。在另一種方法中，將含有假定的原生殖細(xì)胞(“PGCs”)的胚盤細(xì)胞從供體卵切下，用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染并導(dǎo)入受體胚的胚下腔。將該轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞摻入受體胚產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚，預(yù)期其中一些胚的種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因通過非同源重組隨機(jī)插入染色體位點。然而，用該方法還沒有產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽類。Lui, Poult. Sci. 68 :999-1010 (1995)，用含有卵黃原蛋白基因側(cè)接DNA序列的靶向載體刪除培養(yǎng)的雞胚盤細(xì)胞的部分固有基因。然而，還沒有證明這些細(xì)胞有助于形成種系并因此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚。此外，當(dāng)被刪除的基因?qū)τ谠撋锘蚣?xì)胞型的生存或正常發(fā)育是必需的，此法不可行。因此可見，需要一種能將可操作性連接有合適啟動子的外源DNA導(dǎo)入禽類基因組中的方法以實現(xiàn)外源基因有效表達(dá)的方法。而且，需要創(chuàng)建能在輸卵管中表達(dá)外源基因并將表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到蛋中的種系修飾的轉(zhuǎn)基因禽類。干擾素1957年發(fā)現(xiàn)干擾素時，它作為一種重要的抗病毒制劑受到歡迎。70年代后期，干擾素開始與重組基因技術(shù)相結(jié)合。今天，干擾素是癌癥生物過程的復(fù)雜性以及對付這種復(fù)雜性的忍耐性和毅力價值的象征。 引起癌癥的異常基因包括至少三種類型第一種是癌基因，當(dāng)其改變時促進(jìn)了癌癥特征性的異常生長和分裂。第二，腫瘤抑制基因，當(dāng)其改變時不能控制這種異常生長和分裂。第三，DNA修復(fù)基因，當(dāng)其改變時不能修復(fù)致癌的突變。研究者推測體內(nèi)大約有30-40種腫瘤抑制基因，各編碼產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可能受到“主”腫瘤抑制蛋白質(zhì)例如Rb (成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，首先與其相關(guān)聯(lián))和p53(與很多不同的腫瘤相關(guān))的控制。實驗室證據(jù)提示，僅使這些腫瘤抑制基因之一回復(fù)到正常功能就可顯著降低惡性腫瘤的侵襲性。發(fā)現(xiàn)干擾素可抑制細(xì)胞生長時，激起了科學(xué)家們對干擾素的極大興趣。另外，還發(fā)現(xiàn)干擾素對免疫系統(tǒng)有某些正面作用?，F(xiàn)在認(rèn)為干擾素與腫瘤抑制蛋白質(zhì)類似它能抑制細(xì)胞尤其是惡性細(xì)胞的生長；阻抑許多癌基因和生長因子的作用；與其他生物制劑不同，它能抑制對于癌轉(zhuǎn)移過程很關(guān)鍵的細(xì)胞移動能力。細(xì)胞間通信依賴于組織中所有結(jié)構(gòu)組分發(fā)揮正常功能，信息通過以下結(jié)構(gòu)組分傳遞基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架以及細(xì)胞自身。在癌中，細(xì)胞間的通信網(wǎng)絡(luò)受到破壞。如果細(xì)胞骨架被破壞，信息就不能傳輸?shù)胶酥?，核開始功能異常。因為核是癌基因或腫瘤抑制基因開啟或關(guān)閉的部位，這種功能異?？蓪?dǎo)致惡性腫瘤。當(dāng)發(fā)生這種情況時，細(xì)胞開始不規(guī)則生長并且不分化。它們還可能開始移動并打擾其它細(xì)胞。據(jù)認(rèn)為干擾素可能與其他細(xì)胞外或細(xì)胞物質(zhì)協(xié)同，恢復(fù)平衡和自身穩(wěn)定，確保信息正確傳輸。干擾素抑制生長、抑制移動能力、通過粘附分子增強(qiáng)細(xì)胞對環(huán)境響應(yīng)的能力。它還糾正細(xì)胞骨架的缺陷和損傷。已發(fā)現(xiàn)干擾素可阻抑新血管形成，新血管形成的起始步驟是惡性腫瘤生長非常所必需的。而且，它能阻抑纖維化，纖維化是對刺激很多不同類型細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞生長所致傷害的一種反應(yīng)，(KathrynL. Hale, Oncolog，干擾素一種生物治療的演化，對細(xì)胞生物學(xué)的新看法)。干擾素是當(dāng)動物細(xì)胞受到病毒侵犯時產(chǎn)生的，被釋放到血流或細(xì)胞間的液體中，誘導(dǎo)健康的細(xì)胞產(chǎn)生抗擊感染的酶。很多年以來，用于研究的人干擾素的供應(yīng)受到高成本提取技術(shù)的限制。然而1980年，通過遺傳工程可獲得更大量的這種蛋白質(zhì)(即這種蛋白質(zhì)的重組形式)?？茖W(xué)家們還確定體內(nèi)可產(chǎn)生三種不同類型的干擾素，分別稱為a (a)、3 (貝塔)和Y (伽瑪)干擾素。起初認(rèn)為干擾素是高度物種特異性的，但是現(xiàn)在知道，各種干擾素可能在其他物種里具有不同的活性范圍。a干擾素(a-IFN)已被批準(zhǔn)用于毛細(xì)胞白血病和丙型肝炎的治療。還發(fā)現(xiàn)a-IFN對肝癌和肝硬化主要原因的慢性乙型肝炎和生殖道疣及一些罕見的血和骨髓癌癥有效。含有a-IFN的鼻噴霧劑可提供抗鼻病毒引起的感冒的某些保護(hù)力。人a-IFN屬于一個細(xì)胞外信號傳遞蛋白質(zhì)家族，具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性。IFN-a蛋白質(zhì)由人9號染色體上成簇的13個基因組成的多基因家族編碼。白細(xì)胞中大多數(shù)IFN-a基因受仙臺(Sendai)病毒誘導(dǎo)在mRNA水平上表達(dá)。另外，還發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平至少能產(chǎn)生九種不同亞型的蛋白質(zhì)。表達(dá)幾種類似的IFN-a蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義還不知道，然而，認(rèn)為它們在抗病毒、生長抑制和自殺細(xì)胞刺激活性方面具有劑量上不相同的模式?，F(xiàn)在，兩種IFN-a變體，IFN-a 2a和IFN-a 2b，已通過重組技術(shù)在大腸桿菌中大量生產(chǎn)并投入市場作為藥物。與天然的IFN-a不同，已發(fā)現(xiàn)這些重組的IFN-a產(chǎn)品在某些患者中具有免疫原性，這可能是因為IFN-a蛋白質(zhì)的非天然形式所致。因此，對于IFN-a藥物的發(fā)展，不但需要鑒定正常人白細(xì)胞中表達(dá)的IFN-a亞型和變體，而且需要特征分析它們可能的翻譯后修飾(Nyman等(1998) Eur. J. Biochem. 253 :485-493)。Nyman等(見上)研究了天然人IFN-a的糖基化。他們發(fā)現(xiàn)，仙臺病毒誘導(dǎo)后白細(xì)胞產(chǎn)生的九種亞型中有兩個是糖基化的，稱為IFN-a 14c和IFN-a 2b，與以前的研究一致。IFN-a 14是唯——個有潛在N-糖基化位點的IFN-a亞型，所述潛在糖基化位點為Asn2和Asn72，但實際上只有Asn72發(fā)生糖基化。IFN-a 2在蘇氨酸106 (Thrl06)位發(fā)生0-糖基化。令人感興趣的是，其他的IFN-a亞型在這個位置不含有Thr。在該研究中，Nyman等釋放和分離了這些寡糖鏈并用質(zhì)譜法和特異性糖苷酶消化分析了它們的結(jié)構(gòu)。IFN- a 2b和IFN-a 14c在反相高效液相色譜(RP-HPLC)中均解析為三個峰。對RP-HPLC產(chǎn)生的IFN-a 2b諸組分做電噴離子質(zhì)譜(ESI-MS)分析顯示它們的分子量有所不同，提示這些組分代表了不同的糖形。每個組分釋放的0-聚糖的質(zhì)譜分析證實了這一點。據(jù)估計，IFN- a 2b含有約20%的核心2型五糖，約50%雙唾液酸和30%單唾液酸的核心I型聚糖。Nyman等的數(shù)據(jù)與以前的IFN-a 2b糖基化的部分特征一致(Adolf等，(1991) Biochem. J. 276 =511-518)。IFN-a 14c和IFN-a 2b中糖基化的作用還不是很清楚。根據(jù)Nyman等(見上)，碳?xì)滏湆τ谄渖锘钚圆恢匾翘腔赡軙绊懺摰鞍踪|(zhì)的藥物動力學(xué)和穩(wěn)定性。人類基因組中至少有15種功能基因編碼IFN-a家族的蛋白質(zhì)。氨基酸序列相似性一般位于90%的區(qū)域，這些分子在結(jié)構(gòu)上緊密相關(guān)。IFN-a蛋白質(zhì)含有166個氨基酸(IFN-a 2除外，它有165個氨基酸)，特征是含有四個保守的可形成兩個二硫橋的半胱氨酸殘基。諸IFN-a類的特征為輕微酸性，缺少天門冬酰胺相連的糖基化識別位點(IFN-a 14除外，它含有天門冬酰胺相連的糖基化識別位點)。已知有三種IFN-a 2變體，它們在第23 位和 34 位上氨基酸不同IFN-a 2a(Lys-23, His-34)、IFN-a 2b (Arg-23, His-34)和IFN-a 2c (Arg-23，Arg-34)。其他兩種稱為IFN-co I和IFN-P的人IFN是N-糖基化的，與IFN-a關(guān)系更遠(yuǎn)。IFN-a、-P、- co合起來稱為I類IFNs，它們能結(jié)合相同的高親和性細(xì)胞膜受體(Adolf 等，(1991)，Biochem. J. 276 :511-518)。Adolf等(見上)利用單克隆抗體的特異性從人白細(xì)胞IFN中分離得到了天然的IFN-a 2。他們通過免疫親和層析得到了具有期望的抗病毒活性純度95%的IFN-a 2蛋白質(zhì)。用反相HPLC分析天然的IFN-a 2表明，該天然蛋白質(zhì)可以分辨為親水性均比大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-a 2高的兩種成分。SDS/PAGE顯示，該蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量上也是異質(zhì)性的，可產(chǎn)生三條帶，所有條帶的電泳遷移率都低于相等的大腸桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。Adolf等(見上)還推測天然的IFN-a 2攜帶有0-連接的糖殘基。用堿切割假定的多肽-糖鍵斷裂，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是均質(zhì)的，與重組蛋白質(zhì)的分子量相同，證實了他們的假說。在蛋白水解斷裂后，分離和分析產(chǎn)生的片段，將天然和重組的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步比較，使他們確定了一種候選的糖肽。該多肽的序列分析鑒定了 Thr-106為0-糖基化位點。所有已發(fā)表的IFN-a 2種類的氨基酸序列比較顯示，這個蘇氨酸殘基是IFN-a 2獨有的。在其他所有IFN蛋白質(zhì)中的相應(yīng)位置上(107)為甘氨酸、異亮氨酸或谷氨酸。大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-a 2制品缺少0_糖基化并且已在很多國家注冊為藥物。然而，缺少糖基化可能會影響治療應(yīng)用的大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-a 2的免疫原性。研究顯示，16位接受酵母生產(chǎn)的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的患者中，4位產(chǎn)生了該蛋白質(zhì)的抗體。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)這些抗體能與在內(nèi)源性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子中受O-連接的糖基化保護(hù)但在該重組因子中暴露的表位反應(yīng)(Adolf等，見上)。類似地，描述了在患者長期治療之后誘導(dǎo)了針對重組大腸桿菌IFN-a 2的抗體，據(jù)推測，天然IFN- a 2比重組IFN-a 2蛋白質(zhì)的免疫原性低(Galton等，(1989) Lancet 2 572-573)。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于將外源核酸序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類基因組以表達(dá)外源序列來改變禽類表型或產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的載體和方法。具體說，生產(chǎn)了在輸卵管中表達(dá)外源序列并使外源蛋白質(zhì)沉積到蛋中的轉(zhuǎn)基因禽類。本發(fā)明包括含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。本發(fā)明進(jìn)一步提供可在轉(zhuǎn)基因禽類輸卵管中有效表達(dá)并沉積于禽蛋中的新形式干擾素和促紅細(xì)胞生成素。 本發(fā)明的一個方面提供在禽類特定組織中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法。外源蛋白質(zhì)可在禽類輸卵管血液和/或其他細(xì)胞和組織中表達(dá)。將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛ヅ弑P細(xì)胞中，優(yōu)選接近X期的胚盤細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類，從而在輸卵管蛋白分泌部的管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)，分泌入腔中，沉積于硬殼蛋的卵清中。如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類在其種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因。因此，可通過將外源基因人工導(dǎo)入禽類胚胎細(xì)胞中和以孟德爾方式可將外源基因穩(wěn)定傳遞給禽類后代，將外源基因轉(zhuǎn)入禽類。本發(fā)明包括一種在禽類輸卵管中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法。該方法包括，第一步，提供含有編碼序列和操作性連接于該編碼序列的啟動子以使啟動子可影響該核酸在禽類輸卵管中表達(dá)的載體。下一步，創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和/或組織，其中，將所述載體導(dǎo)入新分離的、培養(yǎng)中或胚胎中的禽胚胎胚盤細(xì)胞，以使該載體序列隨機(jī)插入禽基因組。最后，由轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞和/或組織產(chǎn)生成熟的在輸卵管中表達(dá)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因禽類。當(dāng)輸卵管中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)也被分泌到輸卵管腔并沉積于硬殼蛋的卵清中時，該方法也可用于生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。一方面，通過載體隨機(jī)插入到禽類基因組染色體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞，可任選地包括用DNA轉(zhuǎn)染胚胎胚盤細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞注射入受體胚盤下的胚下腔。該方法所用的載體含有融合于外源編碼序列并指導(dǎo)該編碼序列在輸卵管管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。本發(fā)明的另一方面，通過在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5’和3’ LTRs之間攜帶有轉(zhuǎn)基因遺傳密碼的復(fù)制缺陷型或可復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)胚胎胚盤細(xì)胞，獲得隨機(jī)染色體插入和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類。例如，可利用含有經(jīng)修飾的含有插入到啟動子區(qū)段下游的外源基因的pNLB質(zhì)粒的禽白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？捎冒b在病毒顆粒中的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA拷貝感染胚胎胚盤發(fā)育為轉(zhuǎn)基因禽類?；蛘?，將能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的輔助細(xì)胞導(dǎo)入胚胎胚盤。本發(fā)明的另一方面提供一種含有編碼序列和操作及位置上相關(guān)可使該編碼序列在禽類輸卵管中表達(dá)的啟動子的載體。此載體包括，但不限于，禽白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。該啟動子能充分驅(qū)動此編碼序列在禽類輸卵管中的有效表達(dá)。此編碼序列編碼可沉積于硬殼蛋卵清中的外源蛋白質(zhì)。此編碼序列編碼的外源蛋白質(zhì)可以是如轉(zhuǎn)基因禽可產(chǎn)生的干擾素-a 2b(TH)IFN-a 2b)或轉(zhuǎn)基因禽類可產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TH) EP0)。本發(fā)明方法中所用的載體含有尤其適于外源蛋白質(zhì)在禽類和禽蛋中表達(dá)的啟動子。這樣，此外源編碼序列的表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)基因禽類的輸卵管和血液中以及禽蛋的卵清中。所述啟動子包括但不限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子，MDOT啟動子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，鼠白血病病毒(MLV)啟動子，鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子，卵白蛋白啟動子，溶菌酶啟動子，伴白蛋白啟動子，卵類粘蛋白啟動子，卵粘蛋白啟動子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子。任選地，該啟動子可以是至少一種啟動子區(qū)的一個區(qū)段，例如，卵白蛋白啟動子，溶菌酶啟動子，伴白蛋白啟動子，卵類粘蛋白啟動子，卵粘蛋白啟動子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的啟動子區(qū)的一個區(qū)段。本發(fā)明的一個方面包括將卵白蛋白啟動子截短和/或?qū)⒙寻椎鞍讍幼拥年P(guān)鍵調(diào)控元件壓縮使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)所需的序列，同時使其足夠小而易于摻入載體。例如，可利用卵白蛋白啟動子區(qū)的一個區(qū)段。卵白蛋白啟動子區(qū)段的總長度約0. 88kb-7. 4kb，優(yōu)選長0. 88kb-l. 4kb。優(yōu)選該區(qū)段含有卵清蛋白基因留類依賴性調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件。任選地，此區(qū)段也可包括卵白蛋白基因的5’非翻譯區(qū)(5’UTR) 殘基?；蛘?，該啟動子是溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類粘蛋白基因、卵粘蛋白基因和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白基因啟動子區(qū)的一個區(qū)段。此類啟動子的一個例子是合成的含有卵類粘蛋白(MD)啟動子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動子元件的MDOT啟動子。本發(fā)明的另一方面，整合入禽類基因組的載體含有操作上連接于外源編碼序列的組成型啟動子(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，鼠白血病病毒(MLV)啟動子)?；蛘撸墒褂梅墙M成型啟動子例如鼠乳腺腫瘤(MMTV)啟動子。本發(fā)明的其他方面提供在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類。更具體說，該轉(zhuǎn)基因包含外源基因和操作及位置上與外源基因相關(guān)的啟動子以表達(dá)此外源基因。所述外源基因在轉(zhuǎn)基因禽的輸卵管和血液中表達(dá)。該外源基因編碼外源蛋白質(zhì)例如TPD IFN-a 2b或TPD EPO0該外源蛋白質(zhì)可沉積于硬殼蛋的卵清中。本發(fā)明的另外一方面提供的禽蛋含有對于該禽類為外源性的蛋白質(zhì)。利用本發(fā)明可使外源蛋白質(zhì)在輸卵管細(xì)胞中表達(dá)，分泌到輸卵管蛋白分泌部腔并沉積于禽蛋的卵清中。包在禽蛋中的蛋白質(zhì)量可達(dá)到每只蛋I克或更多。所述外源蛋白質(zhì)包括，但不限于，TH)IFN- a 2b 和 TPD EPO。本發(fā)明的另外一方面提供分離的包含人干擾素-a2b(IFN-a2b)最佳編碼序列，即編碼轉(zhuǎn)基因禽可產(chǎn)生的干擾素-a 2b (TH) IFN- a 2b)的重組轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-a 2b編碼序列的多聚核苷酸序列。本發(fā)明還包括分離的包含TPDIFN-a 2b多肽序列的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)的Thr-106位被N-乙酰基-氨基半乳糖、半乳糖、N-乙?；?葡糖胺、唾液酸和其組合物0-糖基化。本發(fā)明還設(shè)想一種包含TPD IFN-a 2b多肽序列的藥物組合物，其中的蛋白質(zhì)在Thr-106位被N-乙?；?氨基半乳糖、半乳糖、N-乙?；?葡糖胺、唾液酸和其組合物0-糖基化。本發(fā)明的另外一方面提供一種分離的包含人促紅細(xì)胞生成素(EPO)最佳編碼序列，即編碼轉(zhuǎn)基因禽類可產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TH) EP0)的重組轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素編碼序列的多聚核酸序列。本發(fā)明的另外一方面提供一種含有第一和第二編碼序列及操作和位置上與該第一和第二編碼序列相關(guān)的可在禽類輸卵管中表達(dá)該第一和第二編碼序列的啟動子的載體。該載體還包含位于該第一和第二編碼序列之間的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)元件，其中，第一編碼序列編碼蛋白質(zhì)X，第二編碼序列編碼蛋白質(zhì)Y，蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y沉積于硬殼蛋的卵清中。例如，蛋白質(zhì)X可以是單克隆抗體的輕鏈(LC)，蛋白質(zhì)Y可以是單克隆抗體的重鏈(HC)?；蛘撸诙幋a序列編碼的蛋白質(zhì)(例如，酶)能對第一編碼序列編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾。該載體任選地可含有其它的編碼序列和其它IRES元件，通過IRES元件將載體中的每個編碼序列與其他編碼序列分開。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)含有蛋白質(zhì)如單克隆抗體、酶或其他蛋白質(zhì)的禽蛋的方法。這種方法包括提供含有啟動子、編碼序列和至少一個IRES元件的載體；通過將該載體導(dǎo)入禽類胚胎胚盤細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織，其中，該載體序列隨機(jī)插入禽類基因組；由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽類。如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類能在其輸卵管中表達(dá)所述編碼序列，將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌入輸卵管腔中，從而沉積于硬殼蛋的卵清中。附圖簡要說明圖IA和1B，顯示卵白蛋白啟動子表達(dá)載體，該載體含有卵白蛋白啟動子片段和編碼序列即編碼外源蛋白質(zhì)X的基因X。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質(zhì)。圖2A、2B、2C和2D，顯示本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體含有卵白蛋白啟動子和編碼序列即編碼外源蛋白質(zhì)X的基因X。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質(zhì)。圖2E，顯示擴(kuò)增用于插入2A和2B載體中外源基因的方法。圖2F，顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體含有控制編碼序列，基因X表達(dá)的卵白蛋白啟動子。該載體還包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)元件，以使第二編碼序列，基因Y能夠表達(dá)。X和Y代表感興趣的任何基因。圖3A和3B，分別顯示ALV衍生的載體pNLB和pNLB_CMV_BL的示意圖。因為NLB還沒有完全測序，bp (堿基對)的測量是從已發(fā)表的數(shù)據(jù)(Cosset等，1991 ；Thoraval等，1995)和本文討論的數(shù)據(jù)估計的。因為整合入雞的基因組時將出現(xiàn)這兩個載體，所以顯示了它們。圖4A和4B，顯示嵌合和轉(zhuǎn)基因雞血清中P -內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)的量。圖4A中，孵化后8個月測定的以NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的GO雞血清中生物活性內(nèi)酰胺酶濃度。示出了世代、性別和翅圈號碼。測定了孵化后6至7個月Gl轉(zhuǎn)基因雞的內(nèi)酰胺酶血清濃度。箭頭表示從公雞2395繁殖產(chǎn)生的Gl雞。在圖4B中，測定了 Gl和G2轉(zhuǎn)基因雞的內(nèi)酰胺酶血清濃度。箭頭表示從母雞5657或公雞4133繁殖產(chǎn)生的G2雞。雞4133、5308和5657的樣品與圖4A中的相同。收集5657繁殖的G2雞的孵化后3至60天的樣品。收集4133繁殖的G2雞孵化后3個月的樣品。圖5，顯示具有母雞5657(圖5A)或公雞4133(圖5B)所帶轉(zhuǎn)基因位點的雞的譜系。2395是攜帶有多個轉(zhuǎn)基因位點的公雞。將2395與一個非轉(zhuǎn)基因母雞交配，產(chǎn)生了 3個各在其基因組的唯一位點攜帶有轉(zhuǎn)基因的后代。簡單起見，將未顯示表達(dá)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)基因后代和非轉(zhuǎn)基因后代從譜系中略去。以下面的符號表示翅圈號碼〇母雞；□公雞； 攜帶有NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因的母雞；■攜帶有NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因的公雞。
圖6，顯示母雞5657及其后代卵清中的P -內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)量。圖6A中，檢測了 5657及其轉(zhuǎn)基因后代卵清中的活性內(nèi)酰胺酶。對照取自于未處理的母雞，連產(chǎn)雞(clutchmate)是從母雞5657繁殖的非轉(zhuǎn)基因G2雞。2000年三月收集雞蛋。箭頭表示從母雞5657繁殖的G2雞。圖6B中，將攜帶有一拷貝轉(zhuǎn)基因(半合子)的G2轉(zhuǎn)基因母雞的卵清樣品與攜帶有兩拷貝轉(zhuǎn)基因(純合)的G3母雞6978的卵清樣品進(jìn)行了比較。2001年二月收集雞蛋。左邊標(biāo)明了世代和翅圈號碼。圖7，顯示從公雞4133繁殖的G2和G3母雞卵中的P -內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。圖7A中，檢測了從公雞4133繁殖的四個代表性半合子轉(zhuǎn)基因母雞卵清的活性內(nèi)酰胺酶。收集蛋的時間分別是1999年10月，2000年3月和2001年2月，每次收集后一個月一只母雞至少檢測4只蛋。對照代表未處理母雞的卵清。左邊標(biāo)明了翅圈號碼。計算每個時期四只母雞的平均值。圖7B中，將半合子G2轉(zhuǎn)基因母雞的卵清與半合子和純合子轉(zhuǎn)基因G3母雞的卵清作比較。2001年2月收集雞蛋。每只母雞的世代和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)列于數(shù)據(jù)欄中。攜帶一個或兩個拷貝的母雞的平均濃度見該圖底部。圖8A和8B，分別顯示用于在雞中表達(dá)IFN- a 2b的pNLB_CMV_IFN載體和用于在雞中表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。 圖9，顯示轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-a 2b (TPD IFN- a 2b)的新糖基化模式，包括所有的6條帶。

圖10，顯示人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-a 2b (PBL IFN-a 2b或天然的hIFN)和轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素- a 2b (TH) IFN-a 2b或卵清hIFN)的比較。圖11A，顯示優(yōu)化的人干擾素-a 2b (IFN_ a 2b)的合成核酸序列(cDNA，殘基1-498)，即重組TPD IFN- a 2b (SEQ ID NO 1) 圖11B，顯示轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(TPD IFN-a 2b)的合成核酸序列(殘基 1-165) (SEQ ID NOS : 2)。圖12A，顯示優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)的合成核酸序列(cDNA，殘基1_579)，即重組TPD EPO (SEQ ID NO :3)。圖12B，顯示轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TH) EP0)的合成核酸序列(殘基1-193) (SEQ ID NO 4) 0 (對于天然的人EP0，又見NCBI登錄號NP_000790)。圖13，顯示與IFN-MM⑶S相連接的合成MDOT啟動子。MDOT啟動子包含雞卵類粘蛋白基因(卵類粘蛋白啟動子)的_435bp至-166bp (見NCBI登錄號J00894)和雞伴白蛋白基因(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子)的-251至+29bp (見NCBI登錄號Y00497，M11862和X01205)的元件。圖14提供主要卵清蛋白質(zhì)的小結(jié)。圖15A和15D，顯示pCMV-LC-emcvIRES-HC載體，其中，為檢測單克隆抗體的表達(dá)，通過放置腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES使該載體能表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)。與之相比，圖15B和15C分別顯示獨立的載體pCMV-HC和pCMV_LC，其中，這些載體也用于檢測單克隆抗體的表達(dá)。發(fā)明詳述a)定義和一般參數(shù)提出下面的定義用于闡述和明確描述本發(fā)明所用的各種術(shù)語的含義和范圍。“核酸或多聚核苷酸序列”包括，但不限于，真核生物的mRNA、cDNA、基因組DNA以及合成的DNA和RNA序列，包括天然的核苷堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。該術(shù)語還包括含有一個或多個經(jīng)修飾堿基的序列?！熬幋a序列”或“開放閱讀框”指當(dāng)置于合適的調(diào)控序列控制下可在體外或體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯(如果是DNA)或翻譯(如果是mRNA)成多肽的多聚核苷酸或核酸序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端翻譯起始密碼子和3’(羧基)末端翻譯終止密碼子界定。轉(zhuǎn)錄終止序列一般位于編碼序列的3’端。編碼序列的5’和/或3’末端可側(cè)接有非翻譯區(qū)?！巴怙@子”指基因的一部分，當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄為核轉(zhuǎn)錄物時，該部分在核剪接除去內(nèi)含子或間插序列后表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)mRNA中。核酸“控制序列”或“調(diào)控序列”指啟動子序列、翻譯起始和終止密碼子、核糖體結(jié)合位點、聚腺苷酸信號、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控區(qū)、增強(qiáng)子等，它們對于在特定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯某給定編碼序列是必需的和充分的。適合真核細(xì)胞的控制序列例如有啟動子、聚腺苷酸信號和增強(qiáng)子。重組載體中不一定存在所有的這些控制序列只需存在對于所需基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需和充分的控制序列，。“可操作性或操作性連接于”指可發(fā)揮所需功能的編碼和控制序列的配置。因此，操作性連接于編碼序列的控制序列可影響該編碼序列的表達(dá)。在細(xì)胞中，編碼序列可操作性連接于或受控于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，在此區(qū)DNA聚合酶結(jié)合于啟動子序列，將編碼序列轉(zhuǎn)錄為可翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA?？刂菩蛄锌刹槐嘏c編碼序列毗連，只要它們可發(fā)揮功能指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。因此，例如，啟動子序列和編碼序列之間可以有間插的不翻譯但可轉(zhuǎn)錄的序列，而該啟動子序列仍認(rèn)為是“可操作性連接于”該編碼序列。對于核酸序列例如編碼序列和控制序列，術(shù)語“異源的”和“外源的”指正常情況下不與重組構(gòu)建物的某區(qū)域或特定染色體位點相關(guān)的序列，和/或正常情況下不與特定細(xì)胞相關(guān)的序列。因此，核酸構(gòu)建物的“外源”區(qū)域是在自然狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)連的其它核酸分子內(nèi)或與該分子相連的核酸的可鑒定區(qū)段。例如，構(gòu)建物的外源區(qū)域可包含與自然狀態(tài)下未與之相關(guān)連的序列相連的編碼序列。外源編碼序列的另一個例子是編碼序列本身是自然界中未發(fā)現(xiàn)的構(gòu)建物(例如，合成的含有與天然基因不同的密碼子的序列)。類似地，用某宿主細(xì)胞正常情況下不存在的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的該宿主細(xì)胞，對本發(fā)明而言認(rèn)為是夕卜源的。本文所用“外源蛋白質(zhì)”指自然狀態(tài)下不存在于特定組織或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，外源表達(dá)構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物是這種蛋白質(zhì)，或在特定組織或細(xì)胞自然狀態(tài)下不以某確定數(shù)量存在的蛋白質(zhì)?！皟?nèi)源基因”指自然發(fā)生的因此正常情況下與特定細(xì)胞相關(guān)的基因或片段。本文所述的表達(dá)產(chǎn)物可包括具有確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)物質(zhì)。然而，精確的結(jié)構(gòu)取決于很多因素，尤其是對于蛋白質(zhì)很普遍的化學(xué)修飾。例如，因為所有的蛋白質(zhì)都含有可電離的氨基和羧基基團(tuán)，所以可獲得酸性或堿性鹽形式或中性形式的蛋白質(zhì)。例如，可用糖分子(糖基化)或其它化學(xué)方法包括例如與脂、磷酸、乙?；鶊F(tuán)等共價結(jié)合或離子結(jié)合，經(jīng)常通過與糖連接的化學(xué)衍生方法來產(chǎn)生一級氨基酸序列。這些修飾可發(fā)生在體外或體內(nèi)，后者是宿主細(xì)胞通過翻譯后加工系統(tǒng)進(jìn)行的。這些修飾可增加或降低分子的生物活性，這些化學(xué)修飾的分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？寺?、擴(kuò)增、表達(dá)和純化的其他方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。代表性方法見 Sambrook, Fritsch 和 Maniatis,分子克隆實驗室指南,第二版，Cold Spring HarborLaboratory(1989)。 “載體”指包括單鏈、雙鏈、環(huán)狀或超螺旋DNA或RNA的多聚核苷酸。一個典型載體可包含以下操作性連接于適宜位置能使功能基因表達(dá)的元件復(fù)制起始位點、啟動子、增強(qiáng)子、5’mRNA引導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點、核酸盒(Nucleic acid cassette)、終止位點和聚腺苷酸位點以及選擇性標(biāo)記序列。在具體應(yīng)用時可省略一個或多個此類元件。核酸盒可包含供待表達(dá)核酸序列插入的限制性位點。在功能性載體中，核酸盒包含含有翻譯起始位點和終止位點的待表達(dá)核酸序列。構(gòu)建物中可任選地包含內(nèi)含子，優(yōu)選地距編碼序列5’ ^ IOObp0構(gòu)建載體時要使特定的編碼序列和合適的調(diào)控序列位于該載體中，編碼序列相對于調(diào)控序列的位置和方向應(yīng)使得編碼序列在調(diào)控序列或調(diào)控序列的控制下轉(zhuǎn)錄。為實現(xiàn)這一目的，可能需要對編碼特定感興趣蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行修飾。例如，在有些情況下可能需要修飾該序列使其以正確方向與控制序列相連，或使其保持讀碼框。在插入載體之前將控制序列和其他調(diào)控序列與編碼序列連接。或者，將編碼序列直接克隆到已含有控制序列和該控制序列調(diào)控下的合適的讀碼框中的限制性位點的表達(dá)載體。 “啟動子”是DNA上可與RNA聚合酶結(jié)合從而啟動基因轉(zhuǎn)錄的位點。在有些實施方式中，通過添加或刪除序列來修飾啟動子，或者以其它序列包括天然和合成序列以及這兩種序列的組合物來替代啟動子。很多真核啟動子含有兩種類型的識別序列=TATA盒和上游啟動子元件。前者，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游，參與指導(dǎo)RNA聚合酶在正確的位置啟動轉(zhuǎn)錄，而后者似乎決定了轉(zhuǎn)錄速率，位于TATA盒上游。增強(qiáng)子也可促進(jìn)相連啟動子的轉(zhuǎn)錄，但很多增強(qiáng)子只在特定細(xì)胞型中發(fā)揮功能。很多增強(qiáng)子/啟動子元件來源于病毒，例如，SV40啟動子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子和鼠白血病病毒(MLV)啟動子均在很多細(xì)胞型中有活性，被稱為“組成型”或“遍在型”啟動子?；蛘撸景l(fā)明中也可采用非組成型啟動子例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子。插入克隆位點的核酸序列可含有編碼感興趣多肽的任何開放讀碼框，條件是當(dāng)該編碼序列編碼感興趣的多肽時，它應(yīng)該沒有可阻礙產(chǎn)生正確mRNA分子和/或產(chǎn)生異常剪接的或異常mRNA分子的隱蔽剪接位點?！皹?biāo)記基因”指編碼使正確轉(zhuǎn)染的細(xì)胞得以鑒定和分離的蛋白質(zhì)的基因。適宜的標(biāo)記基因包括，但不限于綠色、黃色和藍(lán)色熒光蛋白基因(分別為GFP、YFP、BFP)。其他適宜的標(biāo)記基因包括胸苷激酶(tk)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因。后者引入對氨基甙類抗菌素如卡那霉素、新霉素和硫酸慶大霉素的抗性?？蓪⑦@些和其他標(biāo)記基因例如編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、^ -內(nèi)酰胺酶、^ -半乳糖苷酶-gal)的基因，與表達(dá)所需蛋白質(zhì)的基因一起整合入一級核酸盒，或者選擇標(biāo)記可能包含在獨立的載體上共轉(zhuǎn)染。“報告基因”是通過其編碼的蛋白質(zhì)的存在來“報告”其在細(xì)胞中的活性的一種標(biāo)
記基因?！澳孓D(zhuǎn)錄病毒顆粒”，“轉(zhuǎn)導(dǎo)顆?！?(transducing particle 或 transductionparticle)指能夠?qū)⒎遣《镜腄NA或RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)制缺陷型或可復(fù)制的病毒。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“轉(zhuǎn)染”都表示將多肽導(dǎo)入禽類胚盤細(xì)胞?！暗鞍追置诓俊?Magnum)是含有能合成和分泌禽蛋的卵清蛋白質(zhì)的管狀腺體細(xì)胞的輸卵管漏斗和峽之間的部分。本文所用“MD0T啟動子”是在輸卵管蛋白分泌部而非其它組織的管狀腺體細(xì)胞中有活性的合成啟動子。MDOT包含卵類粘蛋白(MD)和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動子的元件(圖13)。在“優(yōu)化的編碼序列”中用到術(shù)語“優(yōu)化的”，其中，可利用在卵清蛋白質(zhì)卵清蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的各特定氨基酸最常用的密碼子設(shè)計優(yōu)化的人干擾素-a 2b (IFN-a 2b)的多聚核苷酸序列將其被插入本發(fā)明載體中。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-a 2b的DNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化密碼子的使用率通過Wisconsin Package
9.I 版(Genetics Computer Group Inc. , Madison, WI)的 BACKTRANSLATE 程序利用雞(GalIus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為G⑶34%，GCC 31%,GCA 26%，GCG 8%。因此，將G⑶作為優(yōu)化的人IFN-a 2b編碼序列中的大多數(shù)丙氨酸的密碼子。用含有編碼優(yōu)化的人IFN-a 2b基因的載體來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽，其能在組織和卵中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的IFN- a 2b (TPD IFN- a 2b)。類似地，用以上方法設(shè)計優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)多聚核苷酸序列來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類，其能在組織和蛋中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TH) EP0)。b)新載體和胚盤細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因 通過本發(fā)明的方法，可將轉(zhuǎn)基因?qū)肭蓊惻咛ヅ弑P細(xì)胞，產(chǎn)生在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雞或火雞或其他禽類。胚盤細(xì)胞是典型的VII-XII期細(xì)胞，或與之相等的細(xì)胞，優(yōu)選的是近X期的細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞包括胚胎生殖細(xì)胞(EG)、胚胎干細(xì)胞(ES)和原生殖細(xì)胞(PGCs)。胚胎胚盤細(xì)胞可以是新分離的、保持在培養(yǎng)中的或胚胎中的。本文描述了可用于實施本發(fā)明方法的載體?？捎眠@些載體將外源編碼序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類基因組?；蛘撸捎眠@些載體在禽類特定組織尤其是輸卵管中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。還可將這些載體用于生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋的方法中。在一個優(yōu)選實施方式中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，編碼序列和啟動子均位于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5’和3’ LTRs之間。在另一個優(yōu)選實施方式中，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來源于禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病毒(MLV)或慢病毒。在另一個優(yōu)選實施方式中，該載體包含操作性連接于編碼序列的信號肽編碼序列，從而在細(xì)胞中翻譯后該信號肽將指導(dǎo)該載體表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌入硬殼蛋的卵清中。在另一個優(yōu)選實施方式中，該載體還包含標(biāo)記基因，其中所述標(biāo)記基因操作性連接于該啟動子。在有些情況下，將本發(fā)明的載體導(dǎo)入胚胎胚盤細(xì)胞是用新分離的或培養(yǎng)中的胚胎胚盤來進(jìn)行的。然后，一般是將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞注射入蛋的受體胚盤下的胚下腔。然而在有些情況下，可將載體直接送入胚盤胚的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于轉(zhuǎn)染胚盤細(xì)胞并產(chǎn)生隨機(jī)穩(wěn)定整合入禽基因組的載體含有某編碼序列和操作及位置上相關(guān)的啟動子，以在禽類輸卵管蛋白分泌部的管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)該編碼序列，其中，該編碼序列編碼一種可沉積于硬殼蛋卵清中的外源蛋白質(zhì)。任選地，啟動子可以是卵白蛋白啟動子區(qū)的一個足夠大的區(qū)段以指導(dǎo)編碼序列在管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明包括將卵白蛋白啟動子截短和/或?qū)⒙寻椎鞍讍幼拥年P(guān)鍵調(diào)控元件壓縮，以使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)所需的序列，同時使其足夠小易于與載體整合。在一個優(yōu)選實施方式中，可利用卵白蛋白啟動子區(qū)的一個區(qū)段。該區(qū)段包含卵清蛋白基因的5’側(cè)翼區(qū)域。卵白蛋白啟動子區(qū)段的總長度為0. 88kb-7. 4kb，優(yōu)選0.88kb-1.4kb。優(yōu)選該區(qū)段含有卵清蛋白基因留類依賴性調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件。任選地，該區(qū)段也包含卵白蛋白基因的5’非翻譯區(qū)(5，UTR)殘基。因此，該啟動子可來源于卵白蛋白基因、溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類粘蛋白基因、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白基因或卵粘蛋白基因的啟動子區(qū)(圖.14)。此類啟動子的一個例子是包含卵類粘蛋白啟動子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子元件的合成性MDOT啟動子(圖.13)。該啟動子也可以是很大程度上但是不完全是對輸卵管蛋白分泌部特異性的，例如溶菌酶啟動子。該啟動子也可以是鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子?；蛘?該啟動子可以是組成型啟動子(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子,羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，鼠白血病病毒(MLV)啟動子等)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，該啟動子是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、MDOT啟動子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、鼠白血病病毒(MLV)啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子。任選地，該啟動子可以至少是啟動子區(qū)的至少一個區(qū)段，例如卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子區(qū)的一個區(qū)段。在一個更優(yōu)的實施方式中，該啟動子是CMV啟動子。圖.IA和IB說明了卵白蛋白啟動子表達(dá)載體例子?；騒是編碼外源蛋白質(zhì)的 編碼序列。彎曲箭頭表不轉(zhuǎn)錄起始位點。在一個實施例中，此載體含有卵白蛋白基因I. 4kb的5’側(cè)翼序列(圖.1A)。圖.IA “-I. 4kb啟動子”序列對應(yīng)于從卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游約I. 4kb開始延伸到卵白蛋白基因5’非翻譯區(qū)約9個殘基的序列。這個約I. 4kb長的區(qū)段含有兩個關(guān)鍵調(diào)控元件，留類依賴性調(diào)控元件(SDRE)和負(fù)調(diào)控元件(NRE)。之所以稱為NRE是因為它含有幾個在缺少激素(例如雌激素)時可阻斷基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件。一個更短的0. 88kb區(qū)段也可含有這兩種元件。在另一個實施例中，此載體含有卵白蛋白基因約7. 4kb的5’側(cè)翼序列并含有兩個附加元件(HS-III和HS-IV)，已知其中一個含有可使該基因響應(yīng)雌激素誘導(dǎo)的功能區(qū)(圖.1B)。一個更短的6kb區(qū)段也含有這四個元件，可任選地用于本發(fā)明。用于本發(fā)明隨機(jī)整合的每個載體優(yōu)選包含至少一個I. 2kb的雞P -珠蛋白基因位點元件，該元件可使基因在插入基因組的位點既不活化也不失活。在一個優(yōu)選的實施方式中，將兩個絕緣子元件加入到卵白蛋白基因構(gòu)建物的一端。在￠-珠蛋白位點中，此絕緣子元件作用是阻止遠(yuǎn)端位點控制區(qū)(LCR)活化珠蛋白基因區(qū)上游的基因，并且已顯示可克服轉(zhuǎn)基因蠅中的位置效應(yīng)，表明它們可防止插入位點的正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)。只有在該基因的5’或3’末端才需要絕緣子元件，因為轉(zhuǎn)基因是以多拷貝串聯(lián)形式整合有效產(chǎn)生了一系列側(cè)翼連接有相鄰轉(zhuǎn)基因的絕緣子的基因。在另一個實施方式中，絕緣子元件不連于該載體而是和該載體共轉(zhuǎn)染。這種情況下，所述載體和元件通過隨機(jī)整合入基因組的過程在細(xì)胞中串聯(lián)連接。任選地，每個載體還可包含標(biāo)記基因以鑒定和富集已穩(wěn)定整合表達(dá)載體的細(xì)胞克隆。用能驅(qū)動各類細(xì)胞型高水平表達(dá)的遍在啟動子驅(qū)動該標(biāo)記基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，該標(biāo)記基因是受溶菌酶啟動子驅(qū)動的人干擾素(基因)。在另一個實施方式中，是受蟾蜍延伸因子I- a (ef-1 a )啟動子(Johnson和Krieg, Gene147 :223-26(1994))驅(qū)動的綠色熒光蛋白(GFP)報告基因(Zolotukhin 等，J. Virol 70 4646-4654(1995))。蟾蜍ef_l a啟動子是一種能在各類細(xì)胞中都表達(dá)的強(qiáng)啟動子。GFP含有能增強(qiáng)熒光的突變并且已被人源化或修飾以使其密碼子符合人基因的密碼子使用特點。因為事實上禽類的密碼子使用率和人的一樣，所以該基因的人源化形式也能在禽類胚盤細(xì)胞中高表達(dá)。在其他可選的實施方式中，該標(biāo)記基因可操作性連接于遍在啟動子HSV tk,CMV, ￠-肌動蛋白或RSV中的一個。人和禽類的密碼子使用率相配很好，當(dāng)用無脊椎動物的基因作為轉(zhuǎn)基因中的編碼序列時，可修飾無脊椎動物的基因序列以改變適當(dāng)?shù)拿艽a子從而使密碼子使用率與人和禽類的相似?？刹捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何幾種方法轉(zhuǎn)染胚盤細(xì)胞。首先將核酸與聚賴氨酸或陽離子脂混和以促進(jìn)載體穿過細(xì)胞膜從而幫助將載體導(dǎo)入細(xì)胞。然而，優(yōu)選通過采用輸送運(yùn)運(yùn)載體例如脂質(zhì)體或病毒將載體導(dǎo)入細(xì)胞。用于將本發(fā)明載體導(dǎo)入胚盤細(xì)胞的病毒包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒和牛痘病毒。
在轉(zhuǎn)染胚盤細(xì)胞的一種方法中，用包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將該載體運(yùn)送進(jìn)胚胎胚盤細(xì)胞以使該載體整合入禽類基因組。向胚胎中的胚胎胚盤細(xì)胞運(yùn)送逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的另一種方法，可將能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的輔助細(xì)胞運(yùn)送入胚盤。用于將轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入禽類基因組的優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒是復(fù)制缺陷型禽類白血病病毒(ALV)、復(fù)制缺陷型鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。為了產(chǎn)生合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將卵白蛋白啟動子的一個區(qū)域和一個或多個外源基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的5’和3’長末端重復(fù)(LTRs)之間以修飾pNLB載體。因為卵白蛋白啟動子驅(qū)動卵清蛋白的表達(dá)且在輸卵管管狀腺體細(xì)胞中有活性，所以置于卵白蛋白啟動子下游的任何編碼序列都將能在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)。雖然在培養(yǎng)的輸卵管管狀腺體細(xì)胞中檢測時，發(fā)現(xiàn)7. 4kb的卵白蛋白啟動子產(chǎn)生活性最高的構(gòu)建物，然而用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時優(yōu)選將卵白蛋白啟動子縮短。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有卵白蛋白啟動子的I. 4kb片段；0. 88kb區(qū)段也是足夠的。任選地，本發(fā)明的任何載體也可任選包含信號肽的編碼序列，該信號肽可指導(dǎo)載體中編碼序列表達(dá)的蛋白質(zhì)從輸卵管管狀腺體細(xì)胞分泌出來。本發(fā)明的這一方面有效地擴(kuò)大了利用本發(fā)明方法可沉積于禽蛋的外源蛋白質(zhì)的范圍。當(dāng)一種外源蛋白質(zhì)不能分泌時，可修飾攜帶其編碼序列的載體使其含有溶菌酶基因的60bp編碼信號肽的DNA序列?？蓪⒕幋a該信號肽的DNA序列插入載體中并使其位于該cDNA編碼蛋白質(zhì)的N端。圖.2A-2D說明合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建物例子。此載體構(gòu)建物與5’和3’LTRs一起插入禽類基因組。Neo是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點。圖.2A和2B說明LTR和攜帶有編碼溶菌酶信號肽(LSP)的序列的輸卵管轉(zhuǎn)錄物，而圖.2C和2D說明沒有這種序列的轉(zhuǎn)錄物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體策略有兩部分?？蓪⒑姓婧松镄盘栯牡娜魏蔚鞍踪|(zhì)克隆入圖.2B和2D所示載體中?？蓪⑼ǔ２荒芊置诘娜魏蔚鞍踪|(zhì)克隆入圖.2A和2B所示載體以使其能由管狀腺體細(xì)胞分泌。圖.2E說明將外源蛋白質(zhì)克隆入溶菌酶信號肽載體的策略。用一對含有可使擴(kuò)增的基因在雙酶切后插入質(zhì)粒中限制性酶切位點的寡聚核苷酸作為引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增編碼序列，基因X的一個拷貝。5’和3’寡聚核苷酸分別含有Bsu36I和Xbal限制性位點。本發(fā)明的另一方面包括在本發(fā)明的任何載體中利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)以從雙順反子或多順反子mRNA中翻譯兩種或多種蛋白質(zhì)(實施例15)。將IRES單元融合于一種或多種其它的編碼序列的5’末端，然后插入載體中原始編碼序列的末端，從而通過IRES使這些編碼序列彼此分開(圖.2F，15A和15D)。按照本發(fā)明的這一方面，有利于產(chǎn)物的翻譯后修飾，因為一個編碼序列編碼的酶能夠修飾另一個編碼序列的產(chǎn)物。例如，第一個編碼序列編碼的膠原可能被第二個編碼序列編碼的酶羥基化和活化。在圖.2F的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例子中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)元件位于兩個外源編碼序列(基因X和基因Y)之間。IRES可使得由卵白蛋白啟動子指導(dǎo)的同樣的轉(zhuǎn)錄物翻譯出蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點?；騒編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)預(yù)期在管狀腺體細(xì)胞中是最高的，該細(xì)胞特異性表達(dá)但不分泌?；験編碼的蛋白質(zhì)也在管狀腺體細(xì)胞中特異表達(dá)，但因為它被有效分泌，所以蛋白質(zhì)Y被包裝入蛋中。圖.15A和15D的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例中，由于放置了腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES，一個載體pCMV-LC-emcvIRES-HC可表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)?？捎肅MV啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。(又見Murakami等(1997)“通過含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點的可復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高水平表達(dá)外源基因” Gene 202 :23-29 ；Chen等，(1999) “更有效的禽類復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的產(chǎn)生和設(shè)計”Dev. Biol. 214
370-384 ；Noel等(2000) “通過遺傳修飾的皮膚成纖維細(xì)胞持續(xù)系統(tǒng)地輸送單克隆抗體”J.Invest. Dermatol. 115 :740-745)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明任何方法中所用載體的編碼序列都含有一個3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)以保證產(chǎn)生的RNA的穩(wěn)定性。當(dāng)將3’ UTR添加到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，該融合的卵白蛋白啟動子、基因X和3’ UTR在構(gòu)建物中的方向必須反轉(zhuǎn)，以使3’ UTR的加入不影響全長基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。在一個優(yōu)選實施方式中，該3’ UTR可以是卵白蛋白或溶菌酶基因的3’ UTR，或是在蛋白分泌部細(xì)胞中有功能的任何3’ UTRjB SV40的晚期區(qū)域。在本發(fā)明的另一實施方式中，用組成型啟動子(例如CMV)在禽類輸卵管蛋白分泌部中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的編碼序列。這種情況下，表達(dá)不局限于蛋白分泌部；在禽類的其他組織中也有表達(dá)(例如，血液)。利用這種含有組成型啟動子和編碼序列的轉(zhuǎn)基因，尤其適合于影響蛋白質(zhì)在輸卵管中的表達(dá)和其后分泌入卵清中(見圖.8A，以CMV驅(qū)動的構(gòu)建物為例，如在雞中表達(dá)IFN- a 2b的pNLB-CMV-IFN載體)。圖3A顯不基于復(fù)制缺陷型禽白血病病毒(ALV)的載體pNLB,—種適合用于本發(fā)明的此種實施方式的載體。在PNLB載體中，用新霉素抗性基因(Neo)和編碼P _半乳糖苷酶的IacZ基因替代了 ALV的大部分基因組。圖.3B顯示載體pNLB-CMV-BL，其中，用CMV啟動子和￠-內(nèi)酰胺酶編碼序列W-La或BL)取代IacZ基因。在具體實施例(實施例1，見下)中報道了該載體的構(gòu)建。由CMV啟動子表達(dá)￠-內(nèi)酰胺酶，并且在其3’長末端重復(fù)序列(LTR)有聚腺苷酸信號(PA)。P -內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)含有天然信號肽；因此，它存在于血液和卵清中。以pNLB-CMV-BL載體轉(zhuǎn)導(dǎo)禽類胚胎(實施例2，見下)。產(chǎn)生的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的母雞每只卵的卵清含有高達(dá)60微克(y g)的分泌的活性P -內(nèi)酰胺酶(實施例2和3，見下)。圖8A和8B分別顯示用于表達(dá)干擾素- a 2b (IFN-a 2b)的pNLB_CMV_IFN載體和用于表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。這兩種外源蛋白質(zhì)(EP0，IFN)可 在禽類中表達(dá)，優(yōu)選的是雞和火雞。pNLB-MDOT-EPO載體是以EPO編碼序列替代BL編碼序列而創(chuàng)建的(實施例10，見下)。在一個實施方式中，采用稱為MDOT的合成啟動子來驅(qū)動EPO的表達(dá)。MDOT含有卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子元件。人EPO的DNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化密碼子使用率，通過 Wisconsin Package 9. I 版(Genetics Computer Group Inc. , Madison, WI)的BACKTRANSLATE程序，利用由雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建的。合成EPO DNA序列并將其克隆入載體產(chǎn)生質(zhì)粒pNLB-MDOT-EPO(又名pAVIJCRA145. 27. 2. 2)。在一個實施方式中，產(chǎn)生了此載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，滴定這些轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒以確定可用于注射胚胎的合適濃度。然后以轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注射蛋，其后孵化蛋21天。可用采集于孵化后一周的仔雞血清樣品做ELISA試驗來測定外源蛋白質(zhì)例如EPO的水平。選擇雄雞用于交配，其中篩選出精子中含有EPO轉(zhuǎn)基因的GO公雞。優(yōu)選通過人工授精使精子樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配。篩選血DNA樣品是否存在該轉(zhuǎn)基因。常能發(fā)現(xiàn)一些仔雞是轉(zhuǎn)基因的(Gl禽)。檢測仔雞血清是否存在人EPO (例如ELISA試驗)。也可檢測Gl母雞蛋的卵清是否存在人EP0。本發(fā)明中蛋中的EPO(即，來源于優(yōu)化的人EPO編碼序列)具有生物活性(實施例11)。類似地，以IFN編碼序列替代BL編碼序列可得到pNLB-CMV-IFN載體(圖8A)(實 施例12，見下)。在一個實施方式中，用組成型巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV)驅(qū)動IFN表達(dá)。更具體地，用巨細(xì)胞病毒啟動子立即早期啟動子/增強(qiáng)子和SV40 polyA位點控制IFN編碼序列。圖8A說明用于在禽類中表達(dá)IFN的pNLB-CMV-IFN，優(yōu)選的禽類為雞和火雞。創(chuàng)建了人IFN-a 2b的優(yōu)化編碼序列，其中，用在卵清蛋白質(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中的各特定氨基酸最常使用的密碼子來設(shè)計人IFN- a 2b序列其插入本發(fā)明載體。更具體地，優(yōu)化的人IFN-a 2b DNA序列(圖11A)可根據(jù)母雞的輸卵管優(yōu)化使用密碼子，通過BACKTRANSLATE程序(見上)利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為G⑶34%，GCC 31%, GCA 26%, GCG 8%。因此，將G⑶作為優(yōu)化的人IFN- a 2b序列匯總絕大多數(shù)丙氨酸的密碼子?？捎煤袃?yōu)化的人IFN- a 2b序列的基礎(chǔ)的載體來產(chǎn)生在其組織和蛋中表達(dá)TPD IFN- a 2b的轉(zhuǎn)基因禽類。產(chǎn)生此載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒并滴定這些轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒以確定可用于注射胚胎的合適濃度(實施例2,見下)。這樣就產(chǎn)生了嵌合的禽類(又見實施例13,見下)。依據(jù)Speksnijder工藝(美國專利號5，897，998)將禽蛋放于窩中，以轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注射蛋。注射后孵化蛋約21天。采集孵化后一周的仔雞血清樣品測定其中hIFN的水平(例如ELISA試驗)。與EPO類似(見上)，選擇雄雞用于交配。為篩選精子中含有IFN轉(zhuǎn)基因的GO公雞，提取公雞精子樣品的DNA。通過人工授精，使精子樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配。檢測轉(zhuǎn)基因公雞的血清是否存在hIFN(例如用ELISA試驗)。如果證實有該外源蛋白質(zhì)，用轉(zhuǎn)基因公雞的精子人工授精非轉(zhuǎn)基因母雞。一定比率的后代將攜帶有該轉(zhuǎn)基因(例如，大于50% )。當(dāng)本發(fā)明的蛋中存在IFN(即，來源于優(yōu)化的人IFN編碼序列)時，要檢測IFN的生物活性。與EPO類似，這些蛋中通常含有有生物活性的IFN，例如TPD IFN- a 2b (圖11B)。c)轉(zhuǎn)基因禽類和禽蛋中外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)本發(fā)明提供在禽類輸卵管中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)和生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的蛋的方法，該方法還包括一個附加后續(xù)步驟，即提供合適的載體及將此載體導(dǎo)入胚胎胚盤細(xì)胞從而使載體整合入禽類基因組。該后續(xù)步驟包括從前面步驟產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因胚盤細(xì)胞得到成熟的轉(zhuǎn)基因禽類。任選地，從胚盤細(xì)胞產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽類任選包括將轉(zhuǎn)基因胚盤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎并使該胚胎充分發(fā)育，從而隨著該胚胎的發(fā)育所述細(xì)胞整合入禽類。然后使產(chǎn)生的仔雞生長成熟。在一個優(yōu)選實施方式中，直接用胚胎中的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)胚盤細(xì)胞(實施例
2)。使產(chǎn)生的胚胎發(fā)育，使仔雞成熟。在這兩種情況下，轉(zhuǎn)基因胚盤細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類稱為創(chuàng)始禽。有些創(chuàng)始禽在其輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中攜帶有轉(zhuǎn)基因，這些禽將在其輸卵管中表達(dá)轉(zhuǎn)基因編碼的外源蛋白質(zhì)。除輸卵管之外，外源蛋白質(zhì)也可能在其他組織中表達(dá)(例如，血液)。如果外源蛋白質(zhì)含有適當(dāng)?shù)男盘栃蛄校鼘置诘捷斅压芮缓偷暗穆亚逯?。有些?chuàng)始禽為種系創(chuàng)始禽(實施例8和9)。種系創(chuàng)始禽是在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有轉(zhuǎn)基因的創(chuàng)始禽，它們也可在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞中攜帶有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因。因此，根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因禽類將含有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的管狀腺體細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因禽的后代也將含有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細(xì)胞?；蛘撸蟠菘稍谇莸奶囟ńM織中表達(dá)該外源基因表達(dá)而決定的某種表型(實施例6,表2)。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式 中，所述轉(zhuǎn)基因禽是雞或火雞。可用本發(fā)明高產(chǎn)量低成本表達(dá)各種所需蛋白質(zhì)，包括可用作人類和動物的藥物、診斷劑以及家畜飼料添加劑的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)例如干擾素(IFN)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、人生長激素、溶菌酶和￠-酪蛋白是根據(jù)本發(fā)明需要在輸卵管中表達(dá)并沉積于蛋中的例子(實施例2，3和5)。其他可能生產(chǎn)的蛋白質(zhì)包括，但不限于，白蛋白、a-I抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII，IX，X(等)、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸、胰島素、乳鐵蛋白、蛋白質(zhì)C、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、組織型血纖蛋白溶酶原活化子(tPA)、促生長素和胰凝乳蛋白酶。也可表達(dá)遺傳工程抗體，例如能結(jié)合人腫瘤細(xì)胞表面抗原并破壞腫瘤的免疫毒素，用做藥物或診斷試劑。d)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-a 2b (TPD IFN- a 2b)本發(fā)明包括禽類產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽干擾素-a 2b (TPD IFN- a 2b)。TPD IFN-a 2b顯示正常情況下人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-a 2b (PBL IFN-a 2b)中不存在的新糖基化模式并含有兩種新糖形(條帶4和5是a -Gal延伸的二糖；見圖9)。TPDIFN-a 2b還含有與人PBL IFN- a 2b相似的在雞中比人中更有效產(chǎn)生的0_連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)。本發(fā)明設(shè)想一種含有人IFN-a 2b優(yōu)化的多聚核苷酸序列，即重組轉(zhuǎn)基因禽干擾素-a2b(Tro IFN-a 2b)編碼序列(SEQ ID NO :1)的分離的多聚核苷酸。優(yōu)化的人IFN-a 2b編碼序列包含498個核酸165個氨基酸(見SEQ ID NO :1和圖11A)。類似地，天然的人IFN- a 2b編碼序列包含498個核酸(NCBI登錄號AF405539和GI : 15487989)和165個氨基酸(NCBI登錄號AALO1040和GI :15487990)?？衫迷诼亚宓鞍踪|(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中各特定氨基酸最常使用的密碼子來設(shè)計優(yōu)化的人干擾素-a 2b編碼序列將其插入本發(fā)明載體。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-a 2bDNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化密碼子使用率，通過 Wisconsin Package 9. I 版(Genetics Computer Group Inc.,Madison,WI)的BACKTRANSLATE程序利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為G⑶34%，GCC 31%,GCA 26%,GCG 8%。因此，可將G⑶作為優(yōu)化的人IFN- a 2b編碼序列大多數(shù)丙氨酸的密碼子。用含有優(yōu)化的人IFN- a 2b基因的載體來產(chǎn)生在組織和卵中表達(dá)TPD IFN- a 2b的轉(zhuǎn)基因禽類。如在實施例13中(見下)所述的，可在雞中生產(chǎn)TPD IFN-a 2b。然而，也可在火雞或其他禽類中生產(chǎn)TPD IFN-a 2b。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，在雞和火雞以及它們的硬殼蛋中表達(dá)TPD IFN-a 2b。碳?xì)浠衔锓治?實施例14，見下)包括單糖分析和FACE分析，可揭示糖的組成或蛋白質(zhì)的新糖基化模式。TPD IFN-a 2b顯示如下的單糖殘基N-乙?；?氨基半乳糖(NAcGal)、半乳糖(Gal)、N-乙酰基-葡糖胺(NAcGlu)和唾液酸(SA)。然而，在TPD IFN-a 2b中沒有N-連接的糖基化，而是在Thr-106 O-糖基化。這種類型的糖基化與人IFN-a 2的相似，其中，106位的Thr殘基是IFN-a 2獨有的。與天然IFN-a相似，TPD IFN-a 2b沒有甘露糖殘基。FACE分析顯示代表各種糖殘基的6條帶(圖9)，其中條帶1、2、3分別是未唾酸化、單唾酸化和雙唾酸化的(圖10)。唾液酸(SA)連接是a 2-3與半乳糖(Gal)和a 2-6與N-乙酰基-氨基半乳糖(NAcGal)連接。條帶6代表未唾酸化的四糖。條帶4和5是在人PBL IFN-a 2b或天然的人IFN(天然hIFN)中未 發(fā)現(xiàn)的a -半乳糖(a -Gal)延伸的雙糖。圖10顯示TPD IFN- a 2b (卵清hIFN)和人PBLIFN- a 2b (天然hIFN)的比較。TH) IFN- a 2b (見下)中條帶3和4，條帶4和5之間還有次帶。本發(fā)明設(shè)想TPD IFN- a 2b的一種分離的多肽序列(SEQ ID NO 2)(又見圖11B)及它的藥物組合物，其中該蛋白質(zhì)在Thr-106位以特定殘基0-糖基化。這些殘基如下⑴Gal-NAcGal-(ii)SA-Gal-NAcGal-(iii)SA-Gal-NAcGal-SA(iv) Gal-NAcGlu-NAcGal-Gal(v) Gal-Gal-NAcGal-(vi) Gal-Gal-NAcGal-SA其中，Gal=半乳糖NAcGal = N-乙?；?氨基半乳糖NAcGlu = N-乙酰基-葡糖胺SA=唾液酸在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，百分比如下
權(quán)利要求
1.ー種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因禽類的方法，其中包括(I)提供逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體，其中所述載體包含藥物蛋白的編碼序列以及與所述編碼序列可操作連接的輸卵管特異性啟動子；(2)將所述載體導(dǎo)入禽類胚胎的胚盤細(xì)胞內(nèi)，其中所述載體序列被隨機(jī)和穩(wěn)定地整合到該禽類基因組中；和(3)從所述胚胎生成成熟的轉(zhuǎn)基因禽類，其中所述轉(zhuǎn)基因禽類在管狀腺體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述藥物蛋白，并且該藥物蛋白被分泌到輸卵管腔中和沉積到轉(zhuǎn)基因禽類的蛋白內(nèi)。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述輸卵管特異性啟動子選自卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因禽類選自雞和火雞。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述藥物蛋白選自下組中干擾素、促紅細(xì)胞生成素、人生長激素、溶菌酶、￠-酪蛋白、白蛋白、a-I抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII、因子IX、因子X、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸、胰島素、乳鐵蛋白、蛋白質(zhì)C、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組織型血纖蛋白溶酶原活化子、促生長素、胰凝乳蛋白酶和遺傳工程抗體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述藥物蛋白是抗體。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因禽類是雞。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供將外源核酸序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類基因組中以表達(dá)外源序列來改變禽類表型或產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的載體和方法。具體說，產(chǎn)生能在輸卵管中表達(dá)外源序列并使外源蛋白質(zhì)沉積到禽蛋中的轉(zhuǎn)基因禽。本發(fā)明包括含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋。本發(fā)明還提供在轉(zhuǎn)基因禽輸卵管中有效表達(dá)并沉積于禽蛋中的新形式干擾素和促紅細(xì)胞生成素。
文檔編號C12N15/90GK102660581SQ20121015063
公開日2012年9月12日 申請日期2004年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者A·J·哈維, G·劉, J·A·莫里斯, J·C·拉普, R·D·伊瓦瑞 申請人:佐治亞大學(xué)研究基金會股份有限公司, 辛那杰瓦生物制藥股份有限公司