專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)花特異表達(dá)啟動(dòng)子kt631p的功能和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物工程和植物改良基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー個(gè)植物花特異表達(dá)啟動(dòng)子KT631P的功能鑒定和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
外源DNA序列通過(guò)連接到特定的啟動(dòng)子從而啟動(dòng)在植物宿主中的表達(dá)，啟動(dòng)子類(lèi)型的選擇決定基因的表達(dá)時(shí)間和部位。目前在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的主要是ー些組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，比如CaMV 35S啟動(dòng)子和玉米Ubiquitin-I啟動(dòng)子(Battraw and Hall,1990 ；Christensen et al. 1992),然而在利用這些啟動(dòng)子誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)化水稻等作物以期改良作物的品質(zhì)時(shí)，往往會(huì)由于目的基因表達(dá)的時(shí)間(發(fā)育階段特異性)或空間(組織器官特異性)不能很好地控制而導(dǎo)致改良效果不明顯，或者由于這些組成型啟動(dòng)子誘導(dǎo)基 因表達(dá)量太高而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響，這些都是目前利用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子結(jié)合功能基因來(lái)改良作物品質(zhì)時(shí)遇到的障礙。此外，在研究某些代謝過(guò)程或調(diào)節(jié)途徑時(shí)，常常需要將同一途徑上的兩個(gè)以上的基因轉(zhuǎn)化到同一個(gè)株系中去，采用轉(zhuǎn)化其中ー個(gè)基因得到轉(zhuǎn)基因植株后再轉(zhuǎn)化另外ー個(gè)基因，或者兩個(gè)基因分別轉(zhuǎn)化完成后再進(jìn)行雜交，都需要等待較長(zhǎng)的時(shí)間，為了提高效率縮短多個(gè)基因轉(zhuǎn)化的時(shí)間，最近有報(bào)道可以利用新的載體同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的轉(zhuǎn)化(Lin etal. 2003; Chen et al. 2006)，但是在多基因轉(zhuǎn)化時(shí)如果重復(fù)使用同一個(gè)啟動(dòng)子，也會(huì)由于啟動(dòng)子序列的高同源性可能導(dǎo)致基因沉默。因此，克服以上轉(zhuǎn)化技術(shù)上的困難，就很有必要克隆更多的組織器官特異性或者特定條件誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動(dòng)子，這樣可以根據(jù)需要選擇不同的啟動(dòng)子誘導(dǎo)目的基因在適合的時(shí)間或空間表達(dá)。植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，是基因表達(dá)調(diào)控因子中最重要的因子，它基本決定ー個(gè)基因是否表達(dá)、何時(shí)表達(dá)和何處表達(dá)，它一般位于功能基因的5’側(cè)翼區(qū)域，能夠與RNA聚合酶以及其他蛋白輔助因子等反式元件相結(jié)合，從而控制基因轉(zhuǎn)錄的起始和速度。根據(jù)其驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的不同特點(diǎn)，啟動(dòng)子分為組成型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能在所有細(xì)胞或組織中，不分時(shí)間和空間地啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；特異性啟動(dòng)子又可分為組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子亦稱(chēng)器官特異性啟動(dòng)子，在這類(lèi)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位，并表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。組織特異性啟動(dòng)子不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，増加區(qū)域表達(dá)量，同時(shí)也可以避免植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，這ー特性必然使組織特異性啟動(dòng)子作為ー種重要的順式作用元件在生物反應(yīng)器、選育抗蟲(chóng)、抗病、抗旱、抗高滲脅迫等抗逆特性的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)良品種等領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用。植物花器官的形成與發(fā)育一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。植物花的發(fā)育過(guò)程分為4個(gè)階段成花誘導(dǎo)、花分生組織形成、花器官原基產(chǎn)生和花器官成熟。分離這些過(guò)程中的花特異性表達(dá)基因啟動(dòng)子，在控制植物育種和花卉培育過(guò)程中都有重要的作用。目前世界上已經(jīng)分離鑒定了ー些花器官特異的啟動(dòng)子，例如，PAL價(jià)值的zb8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因⑶S在轉(zhuǎn)基因水稻的花藥、花芽、花托和花絲中都表達(dá)[Zhu Q，et al.，1995，Plant Mol.Biol.，29:535-550]，而另ー些花特異啟動(dòng)子則具有花器官某特定組織的特異性，如ー些水稻花藥特異性啟動(dòng)子[Tsuchiya T等，1994，Plant Mol. Biol. , 20:1189-1193]、番茄花粉特異性啟動(dòng)子LAT52[Twell D等，1989，Mol GenGenet, 217:240-245]和煙草花藥絨氈層特異性啟動(dòng)子 TA29 [Koltunow AM 等，1990，Plant cell，2:1201-1224]等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能在植物花器官驅(qū)動(dòng)特異性轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子核苷酸序列，及克隆并應(yīng)用該啟動(dòng)子的方法。本發(fā)明還提供了用于在植物中表達(dá)核苷酸序列的方法。在ー些實(shí)施方式中，方法包括(a)將核苷酸序列可操作地連接于包括SEQ ID No :1的啟動(dòng)子，以產(chǎn)生表達(dá)盒；和(b)生成包括表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物，由此在植物中，更具體地說(shuō)，是在植物花器官表達(dá)所述核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述“生成”包括用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生出植物。 本發(fā)明所提供的植物花特異性表達(dá)啟動(dòng)子，含有序列表中SEQ ID No 1所示的核苷酸序列，還包含與SEQ ID No :1中所列核苷酸序列至少具有95%相似性的核苷酸序列，可以驅(qū)動(dòng)操作性連接的核苷酸序列在植物花器官的特異性表達(dá)。實(shí)施方案中的啟動(dòng)子核苷酸序列可用于從其它生物中分離相應(yīng)序列，如其它植物(單子葉或雙子葉植物等)。根據(jù)這些相應(yīng)序列與本文所列序列間的序列同源性，使用如PCR、雜交等技術(shù)來(lái)鑒別分離這些相應(yīng)序列。因此，根據(jù)它們與本文所列的完整KT631P啟動(dòng)子序列(或其片段)間的序列相似性而分離的相應(yīng)片段，也包括在實(shí)施方案中。實(shí)施方案的啟動(dòng)子區(qū)域可從任何植物中分離，包括(但不限干)水稻、蕓苔屬、玉米、小麥、高粱、兩節(jié)薺屬、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、擬南芥屬、菜豆屬、花生、苜蓿、燕麥、油菜籽、大麥、燕麥、黒麥(Rye)、粟、蜀黍、小黒麥、單粒小麥、斯佩爾特小麥(Spelt)、雙粒小麥、亞麻、格蘭馬草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麥草、甘鹿、紅莓苔子、番木瓜、香蕉、紅花、油棕、香瓜、蘋(píng)果、黃瓜、石斛、劍蘭、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、蕓苔、甜菜、咖_、薯蕷、觀賞植物和松類(lèi)等。本文中“啟動(dòng)子” ー詞指DNA調(diào)控序列，其中通常含有ー個(gè)TATA盒，該序列能夠指導(dǎo)RNA聚合酶II在合適的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上起始特定編碼序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子也可另外含有其他識(shí)別序列，它們通常位于TATA盒的上游或5’端，被稱(chēng)作上游啟動(dòng)子元件，這些元件能夠影響轉(zhuǎn)錄速率。應(yīng)認(rèn)識(shí)到當(dāng)鑒別了本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列后，分離并鑒定位于本文所鑒別的特定啟動(dòng)子區(qū)域上游的其它調(diào)控元件就屬于現(xiàn)有技術(shù)范圍了。因此，本文公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)域可另外包含上游調(diào)控元件，如負(fù)責(zé)組織特異性和時(shí)間特異性表達(dá)的元件、調(diào)控組成型表達(dá)的元件和增強(qiáng)子等。本文中的“特異性表達(dá)”是指目的基因在特定的時(shí)間或特定組織器官中表達(dá)。“組織特異性啟動(dòng)子”又稱(chēng)“器官特異性啟動(dòng)子”，在這類(lèi)啟動(dòng)子的調(diào)控下，基因往往只在某特定的組織或器官中表達(dá)。本文中所述植物花器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子指在植物花器官特異表達(dá)的啟動(dòng)子。
通常，如果在某組織或器官中某特定基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的量比在其它組織或器官中高至少5倍，優(yōu)選至少高10倍，更優(yōu)選至少高100倍，最優(yōu)選至少高1000倍水平，則驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的啟動(dòng)子被認(rèn)為具有組織或器官特異性。啟動(dòng)子的活性和強(qiáng)度可以根據(jù)其驅(qū)動(dòng)基因的mRNA或蛋白質(zhì)的含量來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的實(shí)施案例中也包括DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有操作性連接于異源核苷酸序列上的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子含有本發(fā)明公開(kāi)的序列，并可在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)上述異源核苷酸序列進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了表達(dá)載體，以及在基因組中穩(wěn)定包含上述DNA構(gòu)建體的植物或植物細(xì)胞?！安僮餍赃B接”指使異源核苷酸序列處于啟動(dòng)子作用下的連接方式，也指將兩個(gè)核苷酸序列連接起來(lái)從而使每個(gè)DNA片段的編碼序列都保持在適當(dāng)?shù)拈喿x框內(nèi)?！爱愒春塑账嵝蛄小敝柑烊粻顟B(tài)下沒(méi)有與本文所述啟動(dòng)子序列KT631P操作性連接的序列，對(duì)于植物宿主來(lái)說(shuō)可以是同源的，或是 異源的。本文所公開(kāi)的KT631P花器官特異啟動(dòng)子及其變異體和片段可用于植物基因エ程，例如制備轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因植物，以產(chǎn)生目的表型。“轉(zhuǎn)化植物”或“轉(zhuǎn)基因植物”指在基因組內(nèi)含有異源核苷酸序列的植物。通常轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)基因植物基因組穩(wěn)定含有這些異源核苷酸序列，可將該異源核苷酸序列穩(wěn)定地遺傳給下一代。這些異源核苷酸序列可単獨(dú)或與重組DNA構(gòu)建體一起存在于基因組中。這里所述的“轉(zhuǎn)基因事件”包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物體部分或完整植物體，只要它們的基因型被外源核酸的存在而改變，包括通過(guò)轉(zhuǎn)基因操作而改變的起始宿主，以及通過(guò)這些起始宿主進(jìn)行有性或無(wú)性繁殖所得的后代。這里所用的“轉(zhuǎn)基因事件”并不包括通過(guò)傳統(tǒng)植物種植方法或天然事件(例如隨機(jī)雜交、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變)改變了基因組(染色體或染色體外)的植物?！稗D(zhuǎn)基因事件”通過(guò)以下步驟獲得，使用外源DNA構(gòu)建體(含有核酸表達(dá)盒，其中又含有目的基因)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，用基因組插入了外源DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞再培養(yǎng)獲得大量植物體，根據(jù)插入的外源基因進(jìn)行篩選獲得所需的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因系。轉(zhuǎn)基因事件的典型表型特征是目的基因的表達(dá)。在遺傳水平上，“目的基因”是植物基因組成的一部分。“轉(zhuǎn)基因事件”也指轉(zhuǎn)基因植物體與其它植物體進(jìn)行雜交所得的含有外源DNA的后代。本文的“植物”包括整株植物、植物組織器官(如葉、根、莖等)、種子、植物細(xì)胞，以及它們的后代。實(shí)施方案中轉(zhuǎn)基因植物的部分植株應(yīng)理解為包括轉(zhuǎn)基因植物或其后代的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚，及從轉(zhuǎn)基因植物或其后代長(zhǎng)出的花、莖、果實(shí)、胚珠、葉或根等。這里所用的“植物細(xì)胞”包括但不限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子、花粉、孢子體和小孢子?？捎糜诒疚乃_(kāi)方法的植物種類(lèi)包括所有可進(jìn)行轉(zhuǎn)化的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子序列可在宿主植物中調(diào)控任何異源核苷酸序列的表達(dá)。因此，所述的異源核苷酸序列可以是操作性連接于本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子之上的結(jié)構(gòu)基因(編碼目的蛋白)。實(shí)施方案中的目的基因包括參與信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控的基因如轉(zhuǎn)錄因子、激酶等，持家基因如熱休克蛋白基因。更具體地說(shuō)，轉(zhuǎn)基因的種類(lèi)包括如，所編碼蛋白賦予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、溫度、鹽和毒素(殺蟲(chóng)劑和除草剤)等?；蚴撬幋a蛋白賦予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、細(xì)菌、昆蟲(chóng)和線(xiàn)蟲(chóng)的侵害，以及由這些脅迫引起的疾病。表型的編碼包括改變植物中某個(gè)基因的表達(dá)，從而改變植物對(duì)病原體或昆蟲(chóng)等的防御機(jī)制，或是提高植物對(duì)除草劑的抗性，根據(jù)環(huán)境改變植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程等。這些改變可通過(guò)在植物體內(nèi)表達(dá)外源基因或提高內(nèi)源特定基因的表達(dá)來(lái)獲得?；蛘呤峭ㄟ^(guò)降低植物體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因的表達(dá)產(chǎn)物，如酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、輔因子等，通過(guò)影響植物的代謝機(jī)制來(lái)獲得相應(yīng)的表型。由上可見(jiàn)，可將任何目的基因操作性連接到實(shí)施方案中的啟動(dòng)子序列上，并在植物體中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選在植物花器官系中表達(dá)。根據(jù)RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi),操作性連接于本文所公開(kāi)的KT631P花器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子上的異源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反義序列?！胺戳x核苷酸序列”指一段與靶基因核苷酸序列互補(bǔ)的雙鏈RNA分子。當(dāng)導(dǎo)入到植物細(xì)胞中后，反義DNA序列的轉(zhuǎn)錄能阻止靶基因DNA序列的正常表達(dá)。反義核苷酸序列編碼的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可與靶基因轉(zhuǎn)錄生成的內(nèi)源mRNA互補(bǔ)，并可與其雜交，由此，靶基因編碼的天然蛋白的合成就受到限制，從而獲得相應(yīng)的表型。 下面通過(guò)具體實(shí)施方式
，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步詳細(xì)描述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。


圖I是表達(dá)載體pHPG的T-DNA區(qū)圖譜。LB和RB分別為T(mén)-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動(dòng)子；Tnos表不nos基因的終止子；⑶S表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的終止子；HindIII和BamHI分別表示限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和BamHI的酶切位點(diǎn)；花特異啟動(dòng)子即為本發(fā)明所分離鑒定的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子。圖2是KT631P轉(zhuǎn)基因水稻的組織器官⑶S染色。A為葉片；B為莖；C為根；D為花器官；E為種子。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)公司合成,測(cè)序由北京華大基因完成，PCR試劑盒、載體構(gòu)建過(guò)程中的核酸內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程有限公司，pEASY-ΤΙ連接試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自PiOmega公司，方法均參照試劑盒提供的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中所用的載體pHPG由本實(shí)驗(yàn)改造所得，基本骨架來(lái)自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。I.啟動(dòng)子KT631P的分離和鑒定 設(shè)計(jì)克隆啟動(dòng)子KT631P所需引物
引物 I :5，_ aagcttTTAATAGAATATTACCCCATCGTC _3，
引物 2 :5’- ggatccGCCCACCCCCTCCTCCTCG _3’
弓丨物I中序列aagctt為HindIII的酶切位點(diǎn)，弓丨物2中序列g(shù)gatcc為BamHI的酶切位點(diǎn)。利用啟動(dòng)子的正反向引物(其中帶下劃線(xiàn)部分的序列為啟動(dòng)子序列，如Seq IDNO: I所示)，以植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的水稻(中花11)基因組DNA作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸I分鐘；30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收，產(chǎn)物連入pEASY-Tl，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明所擴(kuò)增序列為預(yù)期的KT631P啟動(dòng)子序列。2.構(gòu)建表達(dá)載體
將測(cè)序驗(yàn)證已經(jīng)插入KT631P啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒用HindIII和BamHI雙酶切，連入同樣用HindIII和BamHI雙酶切的載體pHPG，挑取菌落PCR結(jié)果為陽(yáng)性的菌落進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證正確后，提取相應(yīng)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，命名為pHPG-KT631P。菌落PCR檢測(cè)所需引物
引物 3 :5，- TCTCCGCTCATGACGATAAT -3，
引物 4:5，- GACGTAACATGGTGAAGGGG -3，
引物3和引物4為pHPG載體上引物，位于所克隆的啟動(dòng)子片段兩側(cè)，擴(kuò)增片段約為啟動(dòng)子的長(zhǎng)度，以菌液為模板，擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸I分鐘；34個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。所構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA區(qū)的圖譜如圖I所示，其中LB和RB分別為T(mén)-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動(dòng)子；Tnos表不nos基因的終止子AUS表示gus蛋白基因；T35S表示35S基因的終止子；HindIII和BamHI分別表示內(nèi)切HindIII和BamHI的酶切位點(diǎn)；花特異啟動(dòng)子即為本發(fā)明通過(guò)PCR克隆出的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子。3.農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化
利用熱激法將質(zhì)粒PHPG-KT631P轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。4.功能鑒定
從轉(zhuǎn)基因植株中分離各組織器官，進(jìn)行⑶S活性檢測(cè)，將各組織器官置于含有⑶S染色緩沖液的EP管中，放于37°C溫箱溫育過(guò)夜，然后室溫條件下在無(wú)水こ醇中脫色保存。4. I轉(zhuǎn)基因水稻苗的組織器官染色
將水稻KT631P轉(zhuǎn)基因水稻苗的組織器官，如葉片、莖、根和花分別進(jìn)行⑶S染色，結(jié)果如圖2所示，⑶S基因只在植株的花器官(圖2D)中有很強(qiáng)的表達(dá)，顯現(xiàn)出很強(qiáng)的藍(lán)色，在其它各組織器官中基本沒(méi)有檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征是含有一種啟動(dòng)子核酸分子，所述啟動(dòng)子核酸分子具有選自SEQ ID NO :1，或其互補(bǔ)鏈的核酸序列。
2.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的啟動(dòng)子核酸分子可與異源核苷酸序列操作性相連。
3.權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的異源核苷酸序列指天然狀態(tài)下沒(méi)有與所述啟動(dòng)子序列操作性連接的序列，對(duì)于植物宿主來(lái)說(shuō)可以是同源或是異源的。
4.權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的異源核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物可賦予植物對(duì)除草剤、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲(chóng)的抗性，或是調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、雄性不育。
5.權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的異源核苷酸序列為靶基因的部分同源序列，以RNA干擾技術(shù)的方式抑制植物內(nèi)源或外源基因的表達(dá)。
6.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞來(lái)自單子葉植物。
7.權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物細(xì)胞來(lái)自禾本科植物，優(yōu)選為水稻。
8.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞來(lái)自雙子葉植物。
9.權(quán)利要求8所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述雙子葉植物細(xì)胞來(lái)自十字花科，優(yōu)選為擬南芥。
10.ー種在植物中表達(dá)核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物體導(dǎo)入DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體含有啟動(dòng)子及操作性連接于所述啟動(dòng)子的目的異源核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子含有的核苷酸序列選自 a)含有SEQID NO : I所示的啟動(dòng)子核苷酸序列； b)包含的序列與SEQID NO 1所示序列至少有95%序列相似性的啟動(dòng)子核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子核苷酸序列可以在植物花器官啟動(dòng)異源核苷酸序列的特異轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
11.ー種核酸分子，包含選自SEQ ID NO 1的分離的啟動(dòng)子。
12.—種載體，它含有權(quán)利要求11所述的核酸分子。
13.—種細(xì)胞，它含有權(quán)利要求12所述的載體。
14.權(quán)利要求13所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，或真菌細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14所述細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞來(lái)自根瘤土壤桿菌或大腸桿菌。
16.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞為水稻細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物工程和植物改良基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)植物花特異表達(dá)啟動(dòng)子KT631P的功能鑒定和應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了一種在植物體中調(diào)控異源核苷酸序列表達(dá)的方法和DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體包含一個(gè)新的植物花特異性表達(dá)啟動(dòng)子的核苷酸序列，提供了使用本文所公開(kāi)的花特異啟動(dòng)子序列在植物花器官優(yōu)先表達(dá)異源核苷酸序列的方法。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102676457SQ20121015099
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者吳潔芳, 周君莉, 李早霞 申請(qǐng)人:北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司