專利名稱：一種高效水體脫氮施氏假單胞菌db-33及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物菌制劑技術(shù)領(lǐng)域和環(huán)境微生物應(yīng)用領(lǐng)域。涉及一種應(yīng)用于養(yǎng)殖水體快速脫氮的施氏假單胞菌DB-33及其開(kāi)放培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
據(jù)國(guó)家環(huán)?？偩?010年中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)，我國(guó)主要湖泊氮、磷污染較重，養(yǎng)殖水體由于養(yǎng)殖密度提高，飼料投放量過(guò)高，導(dǎo)致富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題突出。高濃度的氨氮和(亞)硝酸鹽氮不僅對(duì)許多水生動(dòng)物有直接的毒害作用，還會(huì)降低其免疫力，導(dǎo)致水產(chǎn)病害頻發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。因此，更快更好地解決水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題已成為亟待解決的環(huán)境問(wèn)題之一，也是目前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)氮污染的治理日益重視，生物脫氮技術(shù)因其迅速安全而被廣泛應(yīng)用。在生物脫氮過(guò)程中，最重要的也是具有較大的優(yōu)勢(shì)的是好氧反硝化過(guò)程。而菌株的好氧反硝化特性決定了水體脫氮的效果。近年來(lái)越來(lái)越多的好氧反硝化菌被發(fā)現(xiàn)，已報(bào)道的有產(chǎn)堿桿菌屬(genes )、副球菌屬iP3racoccus )、假單胞菌屬{Pseudomonas )、芽胞桿菌屬(ifeci77w50、紅球菌屬生絲微菌屬(Jfyphomicrobium)、兔電似氏菌屬iKlebsi)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、戴爾福特屬iDelftia)等多個(gè)屬存在好氧反硝化現(xiàn)象。但是目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)尚無(wú)可有效進(jìn)行水體脫氮的微生物制劑產(chǎn)品，其主要原因是沒(méi)能開(kāi)發(fā)出高效的反硝化菌種，而且在反硝化細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)中，需要較完善的發(fā)酵設(shè)備，投入較高的成本，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶的生產(chǎn)成本增加，制約了生物脫氮技術(shù)在生產(chǎn)上的大面積應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有污染水體生物脫氮技術(shù)的缺陷，旨在開(kāi)發(fā)一種高效反硝化細(xì)菌及其簡(jiǎn)單實(shí)用的培養(yǎng)方法，極大地降低脫氮微生物制劑的生產(chǎn)成本，為廣大養(yǎng)殖戶提供一種高效、安全、實(shí)用的生物脫氮技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人從自然環(huán)境中分離得到一株高效反硝化細(xì)菌DB-33，具有快速、高效脫氮功能；開(kāi)發(fā)出DB-33的規(guī)?；囵B(yǎng)方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種施氏假單胞菌iPsGudomorms stutzeri) DB-33,分離自天津市西青區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖池中，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC No. 5993。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了施氏假單胞菌DB-33保藏號(hào)CGMCC No. 5993在制備養(yǎng)殖水體、污染水體快速脫氮菌劑方面的應(yīng)用。其中的快速脫氮指的是能快速降解水體中的硝酸鹽，在48h之內(nèi)對(duì)含有138mg L—1硝酸鹽的模擬廢水中的硝酸鹽降解率達(dá)94. 58% ;能快速降解水體中的亞硝酸鹽，在24h之內(nèi)對(duì)含有32mg 亞硝酸鹽的模擬廢水中的亞硝酸鹽降解率達(dá)99. 99% ;能快速降解水體中的氨氮,在48h之內(nèi)對(duì)含有18mg *L_1氨氮的模擬廢水中的氨氮降解率達(dá)51. 52%。、
本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了施氏假單胞菌5^加 /^')013-33,保藏號(hào)CGMCCNo. 5993的開(kāi)放培養(yǎng)方法,其特征在于該菌劑發(fā)酵流程是斜面菌種一活化一液體菌種一塑料桶通氣發(fā)酵一檢驗(yàn)；其中
斜面菌種將施氏假單胞菌)DB_33,保藏號(hào)CGMCC No. 5993接種在含有DM固體培養(yǎng)基的斜面試管中，30°C培養(yǎng)24h，4°C冰箱中保存的菌種。其中DM固體培養(yǎng)基為檸檬酸鈉 5 g，KN03 2 g, KH2PO4 I g,MgS04 *7H20 0.2 g，蒸餾水 I 000 mL，瓊脂粉 12g，pH7. 2?；罨渲肈M固體培養(yǎng)基，滅菌后倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi)，待冷卻后，接入保存的DB-33斜面菌株，30°C培養(yǎng)24h。液體菌種配置DM液體培養(yǎng)基，分裝與三角瓶中，滅菌，待冷卻后，挑取培養(yǎng)皿中活化后的菌株接入，30°C培養(yǎng)24h ;其中DM液體培養(yǎng)基為檸檬酸鈉5 g，KNO3 2 g，KH2PO4I g, MgS04 7H20 0. 2 g，蒸餾水 I 000 mL, pH7. 2。 塑料桶通氣發(fā)酵用25L的塑料桶作培養(yǎng)裝置，舊桶用1%的次氯酸鈉溶液消毒，然后用清水沖洗，新桶可用清水清洗過(guò)直接使用。裝入DM液體培養(yǎng)基20L，接入三角瓶中的液體菌種，接菌量為20%，溫度在25°C以上，用氣泵(45w)接入沙頭(2%的次氯酸鈉溶液浸泡)通氣,發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)。本發(fā)明更加詳細(xì)的技術(shù)內(nèi)容如下
(I)本申請(qǐng)人于2008年8月在天津西青區(qū)魚(yú)蝦養(yǎng)殖池中分離、篩選到一株高效的反硝化菌DB-33，在好氧條件下具有較強(qiáng)的水體脫氮能力。經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察，生理生化試驗(yàn)和16SrDNA鑒定,屬于施氏假單胞菌(Aewt/offlmas stutzeri")0申請(qǐng)人于2012年4月13日將該菌株送交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC No. 5993。保藏日期2012年4月13日；單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院。^彡施氏假單胞菌…此訊^艦^狀菌株DB-33的細(xì)菌學(xué)特征及生理生化指標(biāo)
DB-33為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面粗糙，隆起形狀不規(guī)則。接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，淀粉水解陽(yáng)性，MP陰性，VP陰性，吲哚反應(yīng)陰性，檸檬酸鹽利用陽(yáng)性，明膠液化陰性，產(chǎn)硫化氫陰性。(3)施氏假單胞菌DB-33的對(duì)養(yǎng)殖水體的脫氮效果
能快速降解水體中的硝酸鹽，在48h之內(nèi)對(duì)含有138mg L—1硝酸鹽的模擬廢水中的硝酸鹽降解率達(dá)94. 58% ;能快速降解水體中的亞硝酸鹽，在24h之內(nèi)對(duì)含有32mg .171亞硝酸鹽的模擬廢水中的亞硝酸鹽降解率達(dá)99. 99% ;能快速降解水體中的氨氮，在48h之內(nèi)對(duì)含有18mg L—1氨氮的模擬廢水中的氨氮降解率達(dá)51. 52%。(4)菌株DB-33的發(fā)酵生產(chǎn)方法
該菌劑發(fā)酵流程是斜面菌種一活化一三角瓶液體菌種一塑料桶通氣發(fā)酵一檢驗(yàn)?；罨渲肈M固體培養(yǎng)基，滅菌后倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi)，待冷卻后，接入保存的DB-33斜面菌株，30°C培養(yǎng)24h。其中DM固體培養(yǎng)基為檸檬酸鈉5 g，KNO3 2 g，KH2PO4 Ig，MgS04 7H20 0. 2 g，蒸餾水 I 000 mL，瓊脂粉 12g，pH7. 2。液體菌種配置DM液體培養(yǎng)基，分裝與三角瓶中，滅菌，待冷卻后，挑取培養(yǎng)皿中活化后的菌株接入，30°C培養(yǎng)24h ;其中DM液體培養(yǎng)基為檸檬酸鈉5 g，KNO3 2 g，KH2PO4I g, MgS04 7H20 0. 2 g，蒸餾水 I 000 mL, pH7. 2。塑料桶通氣發(fā)酵用25L的塑料桶作培養(yǎng)裝置，舊桶用1%的次氯酸鈉溶液消毒，然后用清水沖洗，新桶可用清水清洗過(guò)直接使用。裝入DM液體培養(yǎng)基20L，接入三角瓶中的液體菌種，接菌量為20%，溫度在25°C以上，用氣泵(45w)接入沙頭(2%的次氯酸鈉溶液浸泡)通氣,發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)。檢驗(yàn)發(fā)酵完成后通過(guò)稀釋涂板法測(cè)定發(fā)發(fā)酵液中的菌數(shù)和雜菌數(shù)。測(cè)定菌數(shù)平均為16億 mL'在10_7，10_6兩個(gè)稀釋濃度下未發(fā)現(xiàn)雜菌。DB-33的安全性評(píng)價(jià)
試驗(yàn)設(shè)對(duì)照、DB-33接種2個(gè)處理。每缸裝水40 L，放養(yǎng)10條大小基本一致的鯽魚(yú)(長(zhǎng)約6 8 cm),平均每條魚(yú)重10. 75 g，投DB-33菌液I L (菌液濃度為3 X IO8 cfu mL 1X養(yǎng)魚(yú)管理按日常管理，7 d投一次菌，試驗(yàn)周期30 d。 試驗(yàn)期間魚(yú)苗進(jìn)食正常，非?；钴S，無(wú)浮頭現(xiàn)象，所有處理未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。魚(yú)的成活率均為100%，說(shuō)明DB-33制劑對(duì)魚(yú)苗是安全的。本發(fā)明公開(kāi)的高效的反硝化菌DB-33菌株所具有的有益效果在于
(I)能夠快速?gòu)氐椎慕到馑w中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，對(duì)氨氮也有較好的降解效果。(2)由于其培養(yǎng)基的特殊性可以在非滅菌條件下生產(chǎn)，在增加其生產(chǎn)操作簡(jiǎn)便性的同時(shí)降低生產(chǎn)成本。(3)對(duì)養(yǎng)殖生物無(wú)毒性，可以在環(huán)境污水處理，養(yǎng)殖池脫氮等多個(gè)領(lǐng)域使用。


圖I為DB-33對(duì)模擬養(yǎng)殖水中硝酸鹽氮的降解效果；
圖2為DB-33對(duì)模擬養(yǎng)殖水中亞硝酸鹽氮的降解效果；
圖3為DB-33對(duì)模擬養(yǎng)殖水中氨氮的降解效果；
圖4為DB-33菌株的顯微觀察照片(1000X )。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定。下面通過(guò)實(shí)例來(lái)進(jìn)一步闡明高效水體脫氮施氏假單胞菌DB-33的制備方法。本發(fā)明所用到的試劑除特別指出外均有市售。實(shí)施例I
菌株的分離，篩選和鑒定
(I)菌株分離
樣品采集2007年10月采集天津市西青區(qū)魚(yú)蝦養(yǎng)殖池底泥樣品。樣品富集配置液體富集培養(yǎng)基
DM 培養(yǎng)基檸檬酸鈉 5 g, KNO3 2 g, KH2PO4 I g, MgSO4 7H20 0. 2 g，蒸餾水 I 000ml，pH7. 2
將底泥樣品取3-5g加入富集培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)5d。分離培養(yǎng)基
BTB(百里酚藍(lán))固體培養(yǎng)基天冬酰胺 I g，KN03 I g,KH2PO4 I g,FeCl2 *6H20 0. 5 g，CaCl2-2H20 0.2 g,MgSO4 *7H20 I g，琥珀酸鈉 8. 5 g，瓊脂 15-18 g，1% 溴百里酚蘭(無(wú)水乙醇溶解)I mL,蒸懼水I OOO mL, pH 7 7. 5
將富集后的菌 液在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，經(jīng)過(guò)4-5次純化后獲得單菌株。(2)優(yōu)良菌株的篩選
篩選培養(yǎng)基
DM亞硝酸鹽培養(yǎng)基檸檬酸鈉5 g，NaNO2 0. 025 g (亞硝酸鹽氮的含量為5 mg/L),KH2PO4 I g, MgSO4 7H20 0. 2 g，去離子水 I 000 mL, pH7. 2
DM硝酸鹽培養(yǎng)基檸檬酸鈉5 g，KN03 0 . 72 1 8 g(硝酸鹽氮的含量為100 mg/L),KH2PO4I g, MgS04 7H20 0. 2 g，去離子水 I 000 mL、pH7. 2
DM氨氮培養(yǎng)基檸檬酸鈉5 g，(NH4)2SO4 0. 2g (氨氮的含量為20mg/L) KH2PO4 I g，MgS04 7H20 0. 2 g，去離子水 I 000 mL、pH7. 2
將多株單菌株接種到篩選培養(yǎng)基，定期測(cè)定其中的污染物含量，選擇出降解能力強(qiáng)，降解速度快的菌株DB-33。(3)菌株的鑒定利用16S rDNA鑒定，即采用原核生物16S rDNA通用引物16F:5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
16R :5’GGITACCTTGITACGACTT3，做PCR擴(kuò)增其 16S rDNA并測(cè)序，將DB-33 16S rDNA序列到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與多株施氏假單胞菌的序列同源性達(dá)到99%，經(jīng)鑒定，確定為施氏假單胞菌(FsGudomorms stutzeri) DB-33。DB-33 16S rDNA 序列TACCATGCAGTCGAGCGGATGAAGAGGGCTTGCTCTCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGA
ATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTA實(shí)施例2
DB-33菌株在模擬養(yǎng)殖廢水中的脫氮效果DB-33菌株對(duì)硝酸鹽的降解效果
將玻璃容器中裝2. 5 L模擬養(yǎng)殖廢水，調(diào)整硝態(tài)氮的初始濃度為138mg L_\接入50mL菌液后放置30 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以 不加菌為對(duì)照，定時(shí)取樣測(cè)水中硝酸鹽的含量。結(jié)果如圖I。由圖I可以看出，在水體中接入反硝化細(xì)菌，48 h內(nèi)對(duì)硝酸鹽濃度為138mg噸―1模擬廢水的降解率為94. 58%，在72 h之內(nèi)將亞硝酸鹽完全降解，降解效果顯著優(yōu)于對(duì)照。DB-33菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解效果
將玻璃容器中裝2. 5 L模擬養(yǎng)殖廢水，調(diào)整亞硝態(tài)氮的初始濃度為32 mg噸―1，接入50mL菌液后放置30 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不加菌為對(duì)照，定時(shí)取樣測(cè)水中亞硝酸鹽的含量。結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，在水體中接入反硝化細(xì)菌，24 h內(nèi)對(duì)亞硝酸鹽濃度為32 mg噸―1模擬廢水的降解率為99. 9%，基本被完全降解，降解效果顯著優(yōu)于對(duì)照。DB-33菌株對(duì)氨氮的降解效果
將玻璃容器中裝2. 5 L模擬養(yǎng)殖廢水，調(diào)整氨氮的初始濃度為18 mg L—1，接入50 mL菌液后放置30 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不加菌為對(duì)照，定時(shí)取樣測(cè)水中亞硝酸鹽的含量。結(jié)果如圖3。由圖3可以看出，在水體中接入反硝化細(xì)菌，48 h內(nèi)對(duì)氨氮濃度為18 mg I/1模擬廢水的降解率為51. 52%，降解效果顯著優(yōu)于對(duì)照。實(shí)施例3
DB-33菌株在開(kāi)放條件下的發(fā)酵培養(yǎng)
活化配置DM固體培養(yǎng)基，滅菌后倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi)，待冷卻后，接入保存的DB-33斜面菌株，30°C培養(yǎng)24h。制作液體菌種配置DM液體培養(yǎng)基，分裝與三角瓶中，滅菌，待冷卻后，挑取培養(yǎng)皿中活化后的菌株接入，30°C培養(yǎng)24h。塑料桶通氣發(fā)酵用25L的塑料桶作培養(yǎng)裝置，舊桶用1%的次氯酸鈉溶液消毒，然后用清水沖洗，新桶可用清水清洗過(guò)直接使用。裝入DM液體培養(yǎng)基20L，接入三角瓶中的液體菌種，接菌量為20%，溫度在25°C以上，用氣泵(45w)接入沙頭(2%的次氯酸鈉溶液浸泡)通氣,發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)。檢驗(yàn)發(fā)酵完成后通過(guò)稀釋涂板法測(cè)定發(fā)發(fā)酵液中的菌數(shù)和雜菌數(shù)。測(cè)定菌數(shù)平均為16億 mL'在10_7，10_6兩個(gè)稀釋濃度下未發(fā)現(xiàn)雜菌。實(shí)施例4 DB-33的安全性評(píng)價(jià)
試驗(yàn)設(shè)對(duì)照、DB-33接種2個(gè)處理。每缸裝水40 L，放養(yǎng)10條大小基本一致的鯽魚(yú)(長(zhǎng)約6 8 cm),平均每條魚(yú)重10. 75 g，投DB-33菌液I L(菌液濃度為3*108 cfu養(yǎng)
魚(yú)管理按日常管理，7 d投一次菌，試驗(yàn)周期30 d。試驗(yàn)期間魚(yú)苗進(jìn)食正常，非?；钴S，無(wú)浮頭現(xiàn)象，所有處理未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。魚(yú)的成活率均為100%，說(shuō)明DB-33制劑對(duì)魚(yú)苗是安全的。
權(quán)利要求
1.ー種施氏假單胞菌iPsGudomorms stutzeri )DB_33,分離自天津市西青區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)埴池中，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC No. 5993。
2.權(quán)利要求I所述施氏假單胞菌DB-33保藏號(hào)CGMCCNo. 5993在制備養(yǎng)殖水體、污染水體快速脫氮菌劑方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中的快速脫氮指的是能快速降解水體中的硝酸鹽，在48h之內(nèi)對(duì)含有138mg ·じ1硝酸鹽的模擬廢水中的硝酸鹽降解率達(dá)94. 58% ;能快速降解水體中的亞硝酸鹽,在24h之內(nèi)對(duì)含有32mg ·じ1亞硝酸鹽的模擬廢水中的亞硝酸鹽降解率達(dá)99. 99% ;能快速降解水體中的氨氮，在48h之內(nèi)對(duì)含有18mg ·じ1氨氮的模擬廢水中的氨氮降解率達(dá)51. 52%。
4.權(quán)利要求I所述施氏假單胞菌iPsGudomormsstutzeri ) DB-33,保藏號(hào)CGMCCNo. 5993的開(kāi)放培養(yǎng)方法,其特征在于該菌劑發(fā)酵流程是斜面菌種一活化一液體菌種一塑料桶通氣發(fā)酵一檢驗(yàn)；其中 斜面菌種將施氏假單胞菌5· ζ6 τΥ)Ε)Β-33,保藏號(hào)CGMCC No. 5993接種在含有DM固體培養(yǎng)基的斜面試管中，30°C培養(yǎng)24h，4°C冰箱中保存的菌種，所述的DM固體培養(yǎng)基為:檸檬酸鈉 5 g，KN03 2 g，KH2PO4 I g,MgS04 ·7Η20 0.2 g，蒸餾水 I 000 mL，瓊脂粉 12g，ρΗ7· 2 ； 活化配置DM固體培養(yǎng)基，滅菌后倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi)，待冷卻后，接入保存的DB-33斜面菌株，30°C培養(yǎng)24h ； 液體菌種配置DM液體培養(yǎng)基，分裝與三角瓶中，滅菌，待冷卻后，挑取培養(yǎng)皿中活化后的菌株接入，30°C培養(yǎng)24h ;所述的DM液體培養(yǎng)基為檸檬酸鈉5 g，KNO3 2 g，KH2PO4 Ig, MgS04 · 7H20 0. 2 g,蒸餾水 I 000 mL, ρΗ7· 2 ； 塑料桶通氣發(fā)酵用25L的塑料桶作培養(yǎng)裝置，舊桶用1%的次氯酸鈉溶液消毒，然后用清水沖洗，新桶可用清水清洗過(guò)直接使用；裝入DM液體培養(yǎng)基20L，接入三角瓶中的液體菌種，接菌量為20%，溫度在25°C以上，用氣泵(45w)接入沙頭(2%的次氯酸鈉溶液浸泡)通氣，發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能夠用于養(yǎng)殖水體快速脫氮的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)DB-33，其保藏號(hào)CGMCCNo.5993。本發(fā)明還公開(kāi)該菌劑的開(kāi)放培養(yǎng)方法用25L的塑料桶作培養(yǎng)裝置，裝入DM液體培養(yǎng)基20L，接入液體菌種，接菌量為20%，溫度在25℃以上，用氣泵通氣(45w)，發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)，發(fā)酵液有效活菌數(shù)達(dá)到16億·mL-1。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的施氏假單胞菌可快速降解水體中的硝酸鹽，亞硝酸鹽，氨氮，從而改善水體環(huán)境，減少含氮污染物對(duì)水體中生物的危害，極大地降低脫氮微生物制劑的生產(chǎn)成本，為廣大養(yǎng)殖戶提供一種高效、安全、實(shí)用的生物脫氮技術(shù)。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102676432SQ201210151039
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者周可, 張峰峰, 謝鳳行, 趙玉潔 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心