專利名稱：一株擔(dān)子菌類的酵母菌及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物，具體而言，涉及擔(dān)子菌類的酵母菌。
背景技術(shù)：
擔(dān)子菌是一群多種多樣的真菌，全世界有1100屬，16000余種。都是由多細(xì)胞的菌絲體組成的有機(jī)體，菌絲均具橫隔膜。經(jīng)檢索，涉及擔(dān)子菌的中國專利申請件有85106023號《從擔(dān)子菌菌絲體中提取有效成分的方法》、88103414. 2號《塊狀擔(dān)子菌及其栽培方法》、00806244. 7號《來源于擔(dān)子菌培養(yǎng)物的新型物質(zhì)、其制造方法及其用途》、00806635. 3號《在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔(dān)子菌綱真菌的方法》、01807160. O號《擔(dān)子菌亞門和五加科提取物的生理活性組合物》、200410011142. 4號《牛樟芝擔(dān)子菌類的多糖體及其用途》、200480011774. 9號《擔(dān)子菌、擔(dān)子菌提取組合物、保健食品和免疫強化劑》、200680033191. 5號《擔(dān)子菌類真菌的糖組合物作為抗病原體的殺蟲劑》、200680022879. 3號《生產(chǎn)木質(zhì)素降 解酶的木腐擔(dān)子菌》、200880012804. 6號《來自擔(dān)子菌綱的肽酶》、200980138468. 4號《用擔(dān)子菌菌絲體和酵母細(xì)胞對經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料酶水解的改進(jìn)》等，但迄今為止未見涉及擔(dān)子菌類的酵母菌的專利申請件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株擔(dān)子菌類的酵母菌，以便對其進(jìn)行多相分類研究，了解其生理和化學(xué)分類學(xué)特征。本發(fā)明的又一目的是提供該菌株的培養(yǎng)方法。發(fā)明人在研究的過程中發(fā)現(xiàn)該菌株屬于隱球菌屬，它和其它幾株類似菌株的基因和生物學(xué)特點均和已知的隱球菌有較大區(qū)別，各種實驗證明其符合一種新型隱球菌菌種的特點；由于該菌株發(fā)現(xiàn)于自然界，其毒力未知，因此對該菌的研究有助于加深對臨床病原隱球菌毒力和耐藥性進(jìn)化的認(rèn)識，為將來更好地預(yù)防和治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。發(fā)明人提供的擔(dān)子菌類的酵母菌菌株屬于隱球菌屬，是從印度南部的Guindy國家公園中的一棵肉桂科的熱帶陣雨樹上分離獲得，該菌株在日本聯(lián)合保藏中心的編號為IFM56699。在我國中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株保藏號CCTCC N0:M2011246，于2011年7月10日保藏，保藏單位的地址為中國湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。上述菌株建議命名為Oypi叱叱狀 ·從sp. IFM56699，這是因為IFM56699菌株與其最相似的菌種Cryptocococcus podzoIicus兩者在D1/D2和ITS域的相似之處分別有95. 8%和92. 9% ;其形態(tài)、生理和化學(xué)分類學(xué)特征都支持該菌株屬于隱球菌屬的觀點。但其系統(tǒng)發(fā)育和生理分析均表明該株菌代表了一個隱球菌屬新種。Cryptococcus cassiae IFM 56699τ 在 GenBank/EMBL/DDBJ 上注冊的 D1/D2 區(qū)和ITS域的DNA序列的編號分別是AB519799和AB519800。發(fā)明人對該菌株的基因進(jìn)行了研究，結(jié)果是>Cryptococcus cassiae ITS 基因片段數(shù)據(jù)
AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTGCCCTTCATGGGCTTAACTAT
TCCAAACCTCTGTGAACCGTGTCCTTCGGGACAATTTTACAAACATTGTGTAATGAACGTAGTATACTTTAACAAAA
CAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG
CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGTG
TCATGTAGACTCAATCCCTCGGGTTTCCGAGGAGATTGGACTTGGGTGCTGCCAGTATTGGCTCACCTTAAAGAACT
TAGCGGGATAGCACCGTAGTTGGCGTAATAAGTTTCGTCAGCAAAGGTTGTGATGCCTGCTTATAATCGCCTTTTGG
CAATCTTTGACTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
>Cryptococcus cassiae 的 25S rRNA 基因的 D1/D2 區(qū)域片斷數(shù)據(jù) TAGCGGCGAGCGAAGTGGGAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCGTCCTCCGGGCGTCCGCATTGTAATCTAT
AGAGGCGTTTTCTGTGCCGGACTGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTATCAAAGAGGGTGACAATCCCGTACTTGA
CACAACGACCGGTGCTCTGTGATACGTCTTCTACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAATGGGTGGTGAAT
TCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAA
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TGGCGGTGTATTTCCTACAGACGGGTCAACATCAGTTTTAGCTGGCGGATAAAGGCGAGAGGAATGTAGCACCCTCG
GGTGTATTATAGCCTCTTGTCGCATACGCTGGCCGAGACTGAGGAATGCAGCTCGCCTTTATGGCAGGGGTTCGCCC ACTTCCGAGCTTAGGATGTTGACATAATGGCCTTCAACGACCCGTCTTGAAACACG
通過實踐，發(fā)現(xiàn)該菌的培養(yǎng)較容易，一般的普通真菌培養(yǎng)基(沙保弱，PDA等)均能生長，生長周期短，1-2天就可能回收大量新生菌細(xì)胞，如能用于工業(yè)用途非常方便。但在臨床常規(guī)藥敏試驗的1640RPMI培養(yǎng)基上不能生長。發(fā)明人提供的菌株的培養(yǎng)方法是在YMA培養(yǎng)基上接入菌種，30°C條件下連續(xù)培養(yǎng)3天，細(xì)胞呈卵形有薄莢膜，并可單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養(yǎng)基上30°C條件下培養(yǎng)6天，細(xì)胞呈檸檬形，直徑I. 5 3. O X 3. 5 6. O微米，有厚度O. 6 O. 9微米的薄莢膜，并通過在細(xì)胞上的小預(yù)測證明其可單個或成對出芽，表現(xiàn)為兩極或多邊出芽；在YMA培養(yǎng)基上于25°C下培養(yǎng)19天，圓形細(xì)胞發(fā)生單個，成對或鏈狀的出芽，表現(xiàn)為多邊出芽。在YMA，PDA,或CMA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)出的是粘稠的菌落呈粘液狀，光滑，整個菌落邊緣晶瑩透亮。培養(yǎng)1-3天菌落呈白色，I周后變?yōu)槟逃蜕?個星期以后成為橙色。在CMA或PDA培養(yǎng)基上半?yún)捬醐h(huán)境中生長超過15天會產(chǎn)生假菌絲。不生產(chǎn)芽分生孢子。有性型未知。發(fā)酵能力陰性。上述YMA (Yeast Morphology Agar)培養(yǎng)基是指酵母菌形態(tài)瓊脂培養(yǎng)基,上述PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基是指馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,上述CMA(Corn Meal Agar)培養(yǎng)基是指麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基。IFM56699T菌株的特征性碳和氮化合物的同化模式列于表I。
表 I 比較 C cassiae IFM 56699T 和podzolicus CBS 6819T 的生理
特性
表中一，沒有增長；+，增長；D，延遲增長(超過4天)；W，增長乏力。能被該菌株同化的碳化合物有D -葡萄糖，菊粉，蔗糖，棉子糖，D -半乳糖，海藻糖(延遲)，麥芽糖，α-甲基-D-葡萄糖苷(弱)，山梨醇(弱)，淀粉，纖維二糖，水楊素，L-鼠李糖(弱)，D -木糖，L -阿拉伯糖，乙醇(延遲)，核糖醇(弱)，D -甘露醇(延遲)，肌醇，琥珀酸，D-葡萄糖醛酸脂和D -葡萄糖。沒有同化的碳化合物有蜜二糖，山梨糖，乳糖，D -核糖，赤蘚糖醇，甲醇，D -阿拉伯糖，和檸檬酸。這個新穎的菌株同化的氮化合物有D-氨基葡萄糖和L -賴氨酸(弱)。不同化的氮化合物有亞硝酸鹽，硝酸鹽和肌酐。從表I中看出在沒有維生素的培養(yǎng)基上生長延遲，其可以在42°C下生長，但不能在45°C的YM肉湯培養(yǎng)基中生長。最適生長溫度介于27°C和37°C之間。據(jù)觀察在50%或60% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖/酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基上沒有生長。在含有O. 01%和0.1%酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)果陰性。尿素水解和重氮藍(lán)反應(yīng)試驗的結(jié)果是陽性的。無淀粉狀化合物的產(chǎn)生。主要的輔酶類型是Q- 10。本發(fā)明的一株擔(dān)子菌類的酵母菌，對該菌株進(jìn)行了多相分類研究、了解其生理和化學(xué)分類學(xué)特征，本發(fā)明的培養(yǎng)方法為其研究提供了基礎(chǔ)，從而為加深對臨床病原隱球菌毒力和耐藥性進(jìn)化的認(rèn)識，為將來更好地預(yù)防和治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。


圖I為檸檬形的C. cassiae IFM 56699T營養(yǎng)細(xì)胞，在PDA培養(yǎng)基上30°C生長6天的狀態(tài)，圖中可見細(xì)胞有薄薄的莢膜，比例尺表示10微米；圖2為在YMA培養(yǎng)基中25 0C生長19天的狀態(tài)，圖中可見圓形至橢圓形的成對或鏈狀的C. cassiae IFM 56699τ營養(yǎng)細(xì)胞，比例尺表示10微米；圖3為cassiae IFM 56699τ在PDA培養(yǎng)基上30°C生長7天的狀態(tài)，圖中可見掃描電子顯微照片顯示出芽細(xì)胞和budding scars芽痕，比例尺表示10微米；圖4為cassiae IFM 56699τ在PDA培養(yǎng)基上30°C生長7天的放大狀態(tài)，圖中用箭頭指出buddingscars芽痕，比例尺表示5微米；圖5為以26S rDNA的D1/D2區(qū)和ITS域的串聯(lián)序列為基礎(chǔ)的IFM 56699τ和相關(guān)菌株的NJ (Neighbor-Join)系統(tǒng)發(fā)育樹，圖中IFM56699T屬于層菌綱層菌綱(Hymenomycetes)酵母的銀耳目(Tremellales)分支；在D1/D2和ITS聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹上，菌株IFM56699最接近的系統(tǒng)進(jìn)化真菌菌種是Crjpiococci/s podzolicus和Bullera 但是在進(jìn)化樹上可見IFM56699T與其相鄰的已知菌種在進(jìn)化距離上明顯較遠(yuǎn)，說明IFM56699T代表的相關(guān)類似菌株很有可能在分類上屬于一個新的隱球菌菌種類型。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。實施例
按照以下方法培養(yǎng)擔(dān)子菌類的酵母菌
在YMA培養(yǎng)基即酵母菌形態(tài)瓊脂培養(yǎng)基上接入擔(dān)子菌類的酵母菌菌種，于30°C條件下連續(xù)培養(yǎng)3天，細(xì)胞呈卵形有薄莢膜，并可單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養(yǎng)基即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上30°C條件下培養(yǎng)6天，細(xì)胞呈檸檬形如圖1，直徑I. 5 3. 0X3. 5 6. O微米，有厚度O. 6 O. 9微米的薄莢膜，并通過在細(xì)胞上可單個或成對出芽，表現(xiàn)為兩極或多邊出芽；在YMA培養(yǎng)基即酵母菌形態(tài)瓊脂培養(yǎng)基上于25°C下培養(yǎng)19天，圓形細(xì)胞發(fā)生單個如圖2，成對或鏈狀的出芽，為多邊出芽。在YMA，PDA，或CMA培養(yǎng)基即麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)出的是粘稠的菌落呈粘液狀，光滑，整個菌落邊緣晶瑩透亮；培養(yǎng)I 天菌落呈白色，I周后變?yōu)槟逃蜕?個星期以后成為橙色；在CMA或PDA培 養(yǎng)基上半?yún)捬醐h(huán)境中生長超過15天會產(chǎn)生假菌絲，不生產(chǎn)芽分生孢子。
權(quán)利要求
1.一株擔(dān)子菌類的酵母菌,其特征在于該菌株屬于隱球菌屬，是從印度南部的Guindy國家公園中的一棵肉桂科的熱帶陣雨樹上分離獲得，該菌株為IFM56699，菌株保藏號CCTCC N0:M2011246，2011年7月10日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。
2.如權(quán)利要求I所述酵母菌菌株的培養(yǎng)方法，其特征是在YMA培養(yǎng)基上接入菌種，30°C條件下連續(xù)培養(yǎng)3天，細(xì)胞呈卵形有薄莢膜，并可單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養(yǎng)基上30°C條件下培養(yǎng)6天，細(xì)胞呈檸檬形，直徑I. 5 3. 0X3. 5 6. 0微米，有厚度0.6 0. 9微米的薄莢膜，并通過在細(xì)胞上可單個或成對出芽，表現(xiàn)為兩極或多邊出芽；在YMA培養(yǎng)基上于25°C下培養(yǎng)19天，圓形細(xì)胞發(fā)生單個，成對或鏈狀的出芽，表現(xiàn)為多邊出芽；在YMA，PDA,或CMA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)出的是粘稠的菌落呈粘液狀，光滑，整個菌落邊緣晶瑩透亮；培養(yǎng)I 3天菌落呈白色，I周后變?yōu)槟逃蜕?個星期以后成為橙色；在CMA或PDA培養(yǎng)基上半?yún)捬醐h(huán)境中生長超過15天會產(chǎn)生假菌絲，不生產(chǎn)芽分生孢子。
3.如權(quán)利要求2所述菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于所述YMA培養(yǎng)基是酵母菌形態(tài)瓊脂培養(yǎng)基，所述PDA培養(yǎng)基是馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，所述CMA培養(yǎng)基是麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株擔(dān)子菌類的酵母菌，屬于隱球菌屬，是從印度南部的Guindy國家公園中的一棵肉桂科的熱帶陣雨樹上分離獲得，該菌株為IFM56699，菌株保藏號CCTCC NOM2011246，2011年7月10日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。該菌株的培養(yǎng)方法是在YMA培養(yǎng)基上接入菌種，30℃條件下連續(xù)培養(yǎng)3天，細(xì)胞呈卵形有薄莢膜，單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養(yǎng)基上30℃條件下培養(yǎng)6天，細(xì)胞呈檸檬形，有薄莢膜，單個或成對出芽，表現(xiàn)為兩極或多邊出芽；在YMA培養(yǎng)基上于25℃下培養(yǎng)19天，圓形細(xì)胞發(fā)生單個，成對或鏈狀的出芽，表現(xiàn)為多邊出芽。本發(fā)明對該菌株進(jìn)行的多相分類研究、了解其生理和化學(xué)分類學(xué)特征，本發(fā)明的培養(yǎng)方法為其利用提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/16GK102816705SQ20121015193
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者康穎倩 申請人:康穎倩