專利名稱：一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試 劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
香蕉為芭蕉科芭蕉屬植物，是熱帶亞熱帶重要的經(jīng)濟作物和糧食作物。近年來，我國廣東、云南、海南等香蕉主要種植地區(qū)先后出現(xiàn)了香蕉花葉心腐病毒(Banana streakvirus, BSV)爆發(fā)流行的情況，該病早期癥狀表現(xiàn)為米粒狀的褪綠，隨著癥狀的發(fā)展葉片出現(xiàn)斷續(xù)或連續(xù)的褪綠條斑及梭形條斑，并可逐漸發(fā)展成壞死黑色條斑，假莖、葉柄及果穗有時也會出現(xiàn)條紋癥狀。香蕉主要通過無性組織培養(yǎng)エ廠化生產(chǎn)，香蕉花葉心腐病毒可隨著組培中香蕉分化芽的繁殖，通過游離病毒形式或病毒基因組整合進香蕉基因組的形式逐代傳遞，若種苗(或蕉頭)攜帯香蕉花葉心腐病毒又未經(jīng)嚴(yán)格檢疫，其病原就可能隨組培苗以更快的速度傳播，成為傳播病毒的ー個重要的初侵染源。因此，建立ー套BSV快速、穩(wěn)定的檢測方法是無毒種苗生產(chǎn)的重要保證。近年來，有大量的報道證實基于PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測香蕉花葉心腐病毒，PCR方法在操作時間上以及檢測的特異性和靈敏度方面較常規(guī)方法有較大提高，但是，PCR方法必須有精密的溫度循環(huán)裝置，而且它的檢測時間也還是比較長(2 3小吋)，并且反應(yīng)過程很容易受污染物的影響，從而使得這種方法不能滿足實際檢測的需要。因此，需要開發(fā)ー種靈敏度高并且反應(yīng)迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的檢測方法。因此，將生物技術(shù)發(fā)展的最新成果應(yīng)用于香蕉花葉心腐病毒檢測，具有重要意義。DNA 環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification ofDNA, LAMP)克服以往基因擴增方法的不足，在等溫條件下能夠特異性、高效、快速地進行核酸的擴增，具有很多的優(yōu)越性，見文獻Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T,Watanabe K,Amino N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. NucleicAcids Res. 2000Jun 15 ；28(12) :E63.。該方法通常是按如下步驟進行步驟一、對被檢標(biāo)本進行預(yù)處理，快速提取被檢標(biāo)本的DNA或RNA ;步驟ニ、特異性引物的制備確定待測標(biāo)本的靶基因后，取得特異性引物2對，內(nèi)引物和外引物各ー對；步驟三、進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)反應(yīng)將經(jīng)前處理的樣品、引物、反應(yīng)緩沖液與Bst DNA聚合酶混合，在63 65°C保溫0. 5至I. 5小時進行循環(huán)鏈置換反應(yīng)；步驟四、分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供該香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的使用方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其試劑包括由兩對引物構(gòu)成的引物混合液，所述兩對引物為外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1(AATTCGATTCTACCGTGTGG)所示，外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ IDNO 2(GACATGAAGTACTAGCTCGTC)所示，內(nèi)引物 1-CMV-FIP，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 3(ACCAGTACCGGTGAGGCTTGCCTCCTCGGACTTATC)所示，內(nèi)引物 2-CMV-BIP，其核苷酸序列如 SEQID NO 4(TCTGGAGTCCAAGCCAACAACTACGCATGTCACCAATATCAG)所示，所述內(nèi)引物 1-CMV-FIP和所述內(nèi)引物2-CMV-BIP的濃度均為40pmol/iil，所述外引物1-CMV-F3和所述外引物2-CMV-B3的濃度分別為5pmol/iil ；濃度為8U/ U I的Bst DNA聚合酶；8U的反轉(zhuǎn)錄酶；RNA 提取液，所述 RNA 提取液包含IOOmM Tris-HCl (pH7. 4)、IMKCl、IOmM EDTAjP2% (w/v)PVPP ；反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包含10mM (1見1\10\11161'1110 01反應(yīng)緩沖液、1501111MgS04、5mM 甜菜堿=8 5 2 10 ；核酸染料； 陽性對照含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA ；陰性對照IOOmMTris-HCl (pH 8. 0)和 50mM EDTA。優(yōu)選地，所述核酸染料為1000XSYBR Green I。如本文使用的，在反應(yīng)緩沖液中，“反應(yīng)緩沖液包含IOmM dNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04、5mM甜菜堿=8 :5:2: 10”是指反應(yīng)緩沖液中IOmM dNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4的水溶液、5mM甜菜堿的水溶液的體積比為8 : 5 : 2 : 10。本發(fā)明還提供一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的使用方法，該方法包括下列步驟I)被檢樣品的RNA核酸提取向0. 5mg待檢測樣品中加入30 u IRNA提取液，研磨成糊狀后，在95°C IOmin, IOOOOrpm下離心2分鐘，取上清作為檢測模板RNA ；2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)在25iil PCR管中配置反應(yīng)溶液1 ii I的外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQID勵1所示；1111的外引物2-01^-83，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；I yl的內(nèi)弓丨物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；I 的內(nèi)引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；12. 5 ill的反應(yīng)緩沖液；8U的BstDNA聚合酶I yl ;8U的反轉(zhuǎn)錄酶0. 2u l,2u I 的模板 RNA ；然后加水至25iU ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA代替I)中得到的檢測模板RNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用IOOmM Tris-HCl (pH 8.0)和50mM EDTA代替I)中得到的檢測模板RNA，將含有配制好的反應(yīng)溶液的PCR管于63°C恒溫反應(yīng)90min ；3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在2)中所得產(chǎn)物中加入I U I的核酸染料，如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性。
優(yōu)選地，所述核酸染料為1000XSYBR Green I。本發(fā)明所述的香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒具有以下有益效果I、高特異性本發(fā)明根據(jù)香蕉花葉心腐病毒基因保守區(qū)設(shè)計了四條特異性引物，引物序列為SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3和SEQ ID NO :4。應(yīng)用上述四條引物，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，陽性率大于95%，假陽性率小于3% ；2、無需高純度模板DNA :簡單快速的DNA提取方法，不需要離心機、液氮、
酚、氯仿儀器和試劑；3、實現(xiàn)樣品現(xiàn)場檢測在野外或田間現(xiàn)場，直接對樣本中的條斑病毒進行現(xiàn)場基因擴增檢測；4、快速、高效擴增擴增在不到I小時即可完成，且產(chǎn)率高；5、靈敏度高在復(fù)雜體系中可檢測到單個細(xì)胞的靶目標(biāo)，最低檢測極限達(dá)到2pgDNA，標(biāo)本的檢出率達(dá)到95%以上；6、鑒定簡便通過肉眼觀察顏色變化判定結(jié)果，無需電泳等其他任何分析步驟。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I香蕉花葉心腐病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)可以購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。按下列配方制備香蕉花葉心腐病毒等溫基因擴增快速檢測試劑盒由兩對引物構(gòu)成的引物混合液，所述兩對引物為外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，內(nèi)引物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，內(nèi)引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQ IDNO 4所示，所述內(nèi)引物I-CMV-FIP和所述內(nèi)引物2-CMV-BIP的濃度均為40pmol/iil，所述外引物1-CMV-F3和所述外引物2-CMV-B3的濃度分別為5pmol/iil ；濃度為8U/ U I的Bst DNA聚合酶；RNA提取液，所述RNA提取液包含100mM Tris-HCl (pH7. 4)、IM KClUOmM EDTA和2% PVPP ；反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包含IOmM dNTP (購自sigma)、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液(購自 sigma)、150mM MgS04、5mM甜菜堿=8 5 2 10 ；核酸染料1000 X SYBR Green I ；陽性對照含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA ；陰性對照IOOmMTris-HCl (pH 8. 0)和 50mM EDTA。使用上述試劑盒按以下方法對香蕉花葉心腐病毒進行檢測I)被檢樣品的DNA核酸提取向0. 5mg待檢測樣品(植株取中脈，種苗取球莖)中加入30iil RNA提取液,研磨成糊狀后,在95°C 10 min, IOOOOrpm下離心2分鐘,取上清作為檢測模板DNA ；2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)在25iU PCR管中配置反應(yīng)溶液IiU的外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；lu I的外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；lu I的內(nèi)引物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；lyl的內(nèi)引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示；12. 5u I的反應(yīng)緩沖液;1 yl的BstDNA聚合酶；2iil的模板DNA ;然后加水至25 ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA代替I)中得到的檢測模板DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用IOOmMTris-HCKpH 8.0)和5OmM EDTA代替I)中得到的檢測模板DNA，將含有配制好的反應(yīng)溶液的PCR管于63°C恒溫反應(yīng)90min ；
3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在2)中所得產(chǎn)物中加入I U I的核酸染料1000 X SYBRGreen I，如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性。
權(quán)利要求
1.一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于，其試劑包括 由兩對引物構(gòu)成的引物混合液，所述兩對引物為外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID ■:1所示，外引物2-01^-83，其核苷酸序列如5￡0 ID勵:2所示，內(nèi)引物1-01^+1卩，其核苷酸序列如SEQ ID勵:3所示，內(nèi)引物2-01^-81 ，其核苷酸序列如5￡010 NO:4 ^示，所述內(nèi)引物I-CMV-FIP和所述內(nèi)引物2-CMV-BIP的濃度均為40pmol/yl，所述外引物1-CMV-F3和所述外引物2-CMV-B3的濃度分別為5pmol/iil ； 濃度為8U/ u I的Bst DNA聚合酶； 8U的反轉(zhuǎn)錄酶； RNA 提取液，所述 RNA 提取液包含IOOmM Tris-HCl (pH7. 4)、IM KClUOmM EDTAjP2%(w/v) PVPP ； 反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包含10mM dNTPUOXThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mMMgS04、5mM 甜菜堿=8:5:2:10 ； 核酸染料； 陽性對照含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA ； 陰性對照100mM Tris-HCKpH 8. 0)和 50mM EDTA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于，所述核酸染料為1000XSYBR Green I。
3.一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的使用方法，該方法包括下列步驟 1)被檢樣品的RNA核酸提取向0.5mg待檢測樣品中加入30 u IRNA提取液，研磨成糊狀后，在95°C IOmin, IOOOOrpm下離心2分鐘，取上清作為檢測模板RNA ； 2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng) 在25iU PCR管中配置反應(yīng)溶液liil的外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID勵:1所示；1111的外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；Iyl的內(nèi)引物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示;I Ul的內(nèi)引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示；12. 5 ill的反應(yīng)緩沖液；8U的Bst DNA聚合酶I yl ;8U的反轉(zhuǎn)錄酶0.2u l,2u I 的模板 RNA ； 然后加水至25iil ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA代替I)中得到的檢測模板RNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用IOOmM Tris-HCl (pH 8.0)和5OmMEDTA代替I)中得到的檢測模板RNA，將含有配制好的反應(yīng)溶液的PCR管于63°C恒溫反應(yīng)90min ； 3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在2)中所得產(chǎn)物中加入Iul的核酸染料，如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述核酸染料為1000 X SYBRGreenI。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香蕉花葉心腐病毒(Banana streak virus，BSV)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其試劑包括由兩對引物構(gòu)成的引物混合液；濃度為8U/μl的Bst DNA聚合酶；8U的反轉(zhuǎn)錄酶；RNA提取液，所述RNA提取液包含100mM Tris-HCl(pH7.4)、1M KC1、10mM EDTA、和2％(w/v)PVPP；反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包含10mM dNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4、5mM甜菜堿＝8∶5∶2∶10；核酸染料；陽性對照含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA；陰性對照100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mMEDTA。本發(fā)明還涉及該試劑盒的使用方法。該試劑盒通過對樣品中香蕉花葉心腐病毒的核酸提取、恒溫基因擴增反應(yīng)、最后通過對反應(yīng)液顏色的肉眼判斷來實現(xiàn)對香蕉花葉心腐病毒高特異性、快速、高效、高靈敏度、簡便的分子檢測。
文檔編號C12Q1/70GK102703605SQ20121015198
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者彭軍, 楊臘英, 梁昌聰, 王國芬, 郭建榮, 郭立佳, 黃俊生 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所